一种可大幅提高包涵体蛋白复性效率的高分子复合胶束及其复性工艺的制作方法

本发明属于高分子材料领域，涉及一种可大幅提高包涵体蛋白复性效率的高分子复合胶束及其复性工艺。

背景技术：

蛋白质和多肽药物是生物制药行业的支柱，目前，市场上超过200个蛋白质药物正在进行临床前和临床试验。此类蛋白质药物主要以大肠杆菌为宿主菌以“重组蛋白”的形式进行表达和生产。但是在大肠杆菌中表达的目的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物，如何对包涵体蛋白进行高效率的复性以获得活性产品是生物工程产业化经常面临的一个难题。

目前，包涵体蛋白体外复性的方法主要有透析和稀释复性法、折叠促进剂协助复性法、天然分子伴侣介导的复性法以及层析折叠复性法等。这些方法往往操作复杂、成本高昂、复性效率低下，并且方法的选择往往局限于蛋白质自身结构的复杂性，适用范围很窄，因此发展一种适用范围广并且可以促使包涵体蛋白高效率复性的新技术是很有价值的。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种经济且适用范围广的可大幅提高包涵体蛋白复性效率的高分子复合胶束，同时提供了该高分子复合胶束高效率复性包涵体蛋白的复性工艺。该复合胶束可提高包涵体蛋白的复性效率，并且针对不同特性的包涵体蛋白，通过调节相应高分子复合胶束的组成，均能达到较高效率的复性效果。

本发明的技术方案：

一种可大幅提高包涵体蛋白复性效率的高分子复合胶束，由粒径为30-500nm且均匀分布的颗粒构成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物组成，两种双亲性嵌段共聚物中包括一种亲水端具有环境响应性的双亲性嵌段共聚物和一种为亲水端不带环境响应性的双亲性嵌段共聚物，该复合胶束在一定条件下为核-壳结构，核层和壳层分别由两种双亲性嵌段共聚物的疏水端和亲水端混合组成。

所述两种双亲性嵌段共聚物的疏水端为5-20kda(千道尔顿)，且两种疏水端的分子量相差不超过10kda。

所述亲水端具有环境响应性的双亲性嵌段共聚物，其亲水环境响应性链段为具有温度响应性的聚n-异丙基丙烯酰胺(poly(n-isopropylacrylamide),pnipam)、聚2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(poly(2-(2-methoxyethoxy)ethylmethacrylate),pmeo2ma)，或者具有ph响应性的聚β氨酯(poly(β-aminoester),pae)，或者具有温度和ph双重响应性的聚甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯(poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate),pdmaema)、聚n-2-乙氨基乙基丙烯酰胺(poly(n-[2-(diethylamino)ethyl]acrylamide),pdeaeam)；其疏水链段为聚已内酯(poly(ε-caprolactone),pcl)、聚乳酸(polylactide,pla)或者聚苯乙烯(polystyrene,ps)。

针对带正电荷的包涵体蛋白(等电点pi>7.0)的复性，所述亲水端具有环境响应性的双亲性嵌段共聚物，其亲水环境响应性链段混聚了疏水类单体：包括但不限于n-叔丁基丙烯酰胺(n-tert-butylacrylamide)、n-苯基丙烯酰胺(n-phenylacrylamide)；和带正电荷类的单体：包括但不限于带氨基类(-nh2)单体、带叔胺类单体(-nr1r2，r1、r2可相同也可不同)、带季铵盐类单体(-n⁺r1r2r3)、带胍基类单体、带咪唑基类单体。针对带负电荷的包涵体蛋白(等电点pi<7.0)的复性，所述亲水端具有环境响应性的双亲性嵌段共聚物，其亲水环境响应性链段混聚了疏水性单体：包括但不限于n-叔丁基丙烯酰胺(n-tert-butylacrylamide)、n-苯基丙烯酰胺(n-phenylacrylamide)；和带负电荷的单体：包括但不限于带羧基(-cooh)类单体、带磷酸基团类单体、带磺酸基类单体。

所述亲水端不具有环境响应性的双亲性嵌段共聚物，其亲水链段为聚乙二醇(poly(ethyleneglycol),peg)、聚2一甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(poly(2-methacryloyl-oxyethylphosphorylcholine),pmpc)，其疏水链段为聚已内酯(poly(ε-caprolactone),pcl)、聚乳酸(polylactide,pla)或者聚苯乙烯(polystyrene,ps)。

一种可大幅提高包涵体蛋白复性效率的高分子复合胶束，用于促使包涵体蛋白的复性，其单次复性工艺包括如下步骤：

1)将包涵体蛋白溶解到到变性缓冲溶液中制得变性蛋白溶液，所述变性缓冲液含有6m盐酸胍、edta和dtt。

2)制备含有高分子复合胶束的复性缓冲溶液，针对带正电荷的包涵体蛋白，所用高分子复合胶束，其亲水环境响应性链段混聚了疏水类单体和带正电荷类单体；针对带负电荷的包涵体蛋白，所用高分子复合胶束，其亲水环境响应性链段混聚了疏水类单体和带负电荷类单体。

3)将制备的含有高分子复合胶束的复性缓冲溶液于一定条件下稳定一定时间以获得呈核-壳-冠结构的高分子复合胶束，然后将上述溶液与变性的蛋白溶液混合均匀，于适当条件下进行复性实验。

4)室温下随时间监测酶的活性。

一种可大幅提高包涵体蛋白复性效率的高分子复合胶束，用于促使包涵体蛋白的复性，其连续复性工艺包括如下步骤：

1)将包涵体蛋白溶解到到变性缓冲溶液中制得变性蛋白溶液，所述变性缓冲液含有6m盐酸胍、edta和dtt。

2)制备含有高分子复合胶束的复性缓冲溶液，针对带正电荷的包涵体蛋白，所用高分子复合胶束，其亲水环境响应性链段混聚了疏水类单体和带正电荷类单体；针对带负电荷的包涵体蛋白，所用高分子复合胶束，其亲水环境响应性链段混聚了疏水类单体和带负电荷类单体。

3)将制备的含有高分子复合胶束的复性缓冲溶液于于一定条件下稳定一定时间以获得呈核-壳-冠结构的高分子复合胶束，然后将一定量的变性蛋白质以2-10μl/s的流速分批稀释到复性缓冲液中，并将分批复性完毕的活性蛋白分离出来。

4)室温下监测酶的活性。

该高分子复合胶束促使包涵体蛋白高效率复性的原理：

在生物体内，新生多肽链的从头折叠到具有活性的状态需要一系列的分子伴侣发挥调控作用。当缺少分子伴侣辅助时，新生肽链中的疏水氨基酸残基之间容易相互聚集，从而形成没有活性的不溶的包涵体。本发明开发出一种新的带电荷的具有核-壳-冠结构的复合胶束，在适当的环境刺激下，处于壳层的环境响应性亲水部分发生相分离，疏水塌缩形成新的壳层，而不带环境响应性的亲水部分则作为冠层，阻止了复合胶束之间的聚集，使这种带有疏水表面的核-壳-冠纳米结构能够稳定存在，从结构和功能上精确模拟天然分子伴侣，从而可以促使包涵体蛋白高效率复性。以带正电的包涵体蛋白为例，使用变性剂和还原剂使包涵体蛋白完全变性以模拟新生肽链。没有复合胶束存在时，当把变性的包涵体蛋白快速稀释到复性缓冲液中时，多肽链之间由于疏水相互作用快速聚集，形成无活性的聚集体，自发复性效率非常低(图1，过程i)。当把变性的包涵体蛋白快速稀释到含有带正电荷的高分子复合胶束复性缓冲液中时，在疏水作用力的推动下，多肽链快速吸附到复合胶束表面的疏水受限空腔中，从而阻止了多肽链之间的聚集；同时，在同种电荷相斥作用下，多肽链中的正电片断可以从复合胶束的疏水受限空腔表面解离，从而逐渐带动多肽链的整体正确折叠，最终折叠成活性状态(图1，过程ii)。当把变性的包涵体蛋白快速稀释到含有带负电荷的高分子复合胶束复性缓冲液中时，虽然复合胶束抑制的多肽链之间的聚集，但是由于异性电荷相吸作用，多肽链紧密的吸附在复合胶束的疏水受限空腔表面，从而抑制了多肽链自发调节复性(图1，过程iii)。但是，当底物为带负电的包涵体蛋白时，带负电荷的高分子复合胶束能够很好的发挥促使其复性作用(原理同图1，过程ii)。

本发明的优点是：

由两种双亲性嵌段共聚物形成的核-壳-冠结构的复合胶束，能够在水体系中稳定存在，同时表面具有疏水性质和电荷性质可调节的受限空腔；针对不同特性的包涵体蛋白，通过加入相应的复合胶束，可以显著提高包涵体蛋白的复性效率；当变性蛋白复性完成时，可以自发的从胶束表面的受限空腔内解离，从而其能够连续多次的发挥作用；其制备方法及复性工艺简单、易于操作，适用底物蛋白范围广，复性设备成本低，效率高，易于推广应用。

附图说明

图1为复合胶束促使包涵体蛋白复性作用机制原理图。

图2为peg/p(ni-co-ntb-co-gua)复合胶束辅助变性溶菌酶复性动力学图。

图3为peg/p(ni-co-ntb-co-aac)复合胶束辅助变性碳酸酐酶复性动力学图。

具体实施方式

以下通过非限定性实例进一步详细说明本发明。

实施例1：peg/p(ni-co-ntb-co-gua)复合胶束辅助变性溶菌酶复性

采用raft和rop的方法合成了嵌段共聚物pcl82-b-peg114和pcl78-b-p(ni60-co-ntb18-co-gua9)，室温下将两种嵌段共聚物超声溶解在超干四氢呋喃中，过夜，共聚物溶液浓度均为5mg/ml，按照pcl-b-peg溶液和pcl-b-p(ni-co-ntb-co-gua)溶液体积比1:6均匀混合两种共聚物溶液，充分混匀后将上述混合溶液快速加入到适量冰水中，冰浴状态下超声10min后将上述混合溶液用冰水进行透析以除去四氢呋喃，透析完毕后，加水定容，最后制得嵌段共聚物的浓度为0.5mg/ml的peg/p(ni-co-ntb-co-gua)高分子复合胶束溶液。

将溶菌酶加入到变性缓冲溶液中制得变性溶菌酶溶液，具体为称取5mg溶菌酶、0.5732g盐酸胍、5μl1mdtt、40μl0.5mph＝8.0tris-cl溶液，然后用灭菌超纯水定容至1ml，37℃变性12h备用。

制备含有高分子复合胶束的复性缓冲溶液。具体为取1850μlpeg/p(ni-co-ntb-co-gua)复合胶束、80μl0.5mph＝8.0tris-cl溶液、10μl1medta、20μl150mmgsh、20μl50mmgssh，将上述溶液混合均匀后40℃下温浴20min，然后取20μl上述已变性的溶菌酶溶液快速稀释到上述复性缓冲溶液中，于40℃下进行复性实验。室温下随时间监测酶的活性。对照组将peg/p(ni-co-ntb-co-gua)复合胶束替换成灭菌超纯水，其余步骤一样。

溶菌酶的活性测试以容壁微球菌为底物，称取3mg容壁微球菌，用10ml66mmph＝6.5的磷酸缓冲溶液溶解，向500μl容壁微球菌溶液中加入50μl复性溶液，快速混合，室温检测反应液在450nm处的吸光值变化，1min内的吸光值下降速率(扣除空白实验中底物水解速率后)，与酶活性成正比，求出变化斜率，与100％酶活性相比得到相对酶活性。

测试结果如图2所示，测试结果表明：peg/p(ni-co-ntb-co-gua)复合胶束能够显著提高溶菌酶的复性产率，复性完成时，实验组的复性产率高达97％，而对照组仅仅为34％。结果表明，带正电荷的peg/p(ni-co-ntb-co-gua)复合胶束能够高效率的促使带正电荷的包涵体蛋白复性。

实施例2：peg/p(ni-co-ntb-co-aac)复合胶束辅助变性碳酸酐酶复性

采用raft和rop的方法合成了嵌段共聚物pcl82-b-peg114和pcl78-b-p(ni54-co-ntb16-co-aac8)，室温下将两种嵌段共聚物超声溶解在超干四氢呋喃中，过夜，共聚物溶液浓度均为5mg/ml，按照pcl-b-peg溶液和pcl-b-p(ni-co-ntb-co-aac)溶液体积比1:6均匀混合两种共聚物溶液，充分混匀后将上述混合溶液快速加入到适量冰水中，冰浴状态下超声10min后将上述混合溶液用冰水进行透析以除去四氢呋喃，透析完毕后，加水定容，最后制得嵌段共聚物的浓度为0.5mg/ml的peg/p(ni-co-ntb-co-aac)高分子复合胶束溶液。

将碳酸酐酶加入到变性缓冲溶液中制得变性溶菌酶溶液，具体为称取5mg碳酸酐酶、0.5732g盐酸胍、40μl0.5mph＝8.0tris-cl溶液，然后用灭菌超纯水定容至1ml，37℃变性12h备用。

制备含有高分子复合胶束的复性缓冲溶液。具体为取4750μlpeg/p(ni-co-ntb-co-aac)复合胶束、200μl0.5mph＝7.5tris-cl溶液，将上述溶液混合均匀后40℃下温浴20min，然后取50μl上述已变性的溶菌酶溶液快速稀释到上述复性缓冲溶液中，于40℃下进行复性实验。室温下随时间监测酶的活性。对照组将peg/p(ni-co-ntb-co-aac)复合胶束替换成灭菌超纯水，其余步骤一样。

碳酸酐酶的活性测试以4-硝基苯基乙酸酯(pnpa)为底物为底物，称取0.0725gpnpa，用5ml重蒸处理过的乙腈溶液溶解，取20μlpnpa溶液，加入600μl复性溶液，快速混合，室温检测反应液在400nm处的吸光值变化，1min内的吸光值升高速率(扣除空白实验中底物水解速率后)，与酶活性成正比，求出变化斜率，与100％酶活性相比得到相对酶活性。

测试结果如图3所示，测试结果表明：peg/p(ni-co-ntb-co-aac)复合胶束能够明显提高碳酸酐酶的复性产率，复性完成时，实验组的复性产率达58％，而对照组仅仅为30％。结果表明，带负电荷的peg/p(ni-co-ntb-co-aac)复合胶束能够高效率的促使带负电荷的包涵体蛋白复性。