一种用于未知核酸浓度样品PCR定量的装置的制作方法

本发明涉及数字pcr定量技术领域，特别是涉及一种用于未知核酸浓度样品pcr定量的装置。

背景技术：

聚合酶链式反应(pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，数字pcr是第三代pcr技术，被誉为最先进的核酸定量技术，主要采用微流控方法将dna或者rna溶液大量稀释后，分散至芯片的微型液滴中，每个液滴的dna模板数少于或者等于1个，经过pcr循环之后，根据产生荧光信号的液滴数目，实现核酸分子的绝对定量。

根据统计学规律，为保证数字pcr的准确度，往往需要具有荧光信号的微液滴数目占液滴总数的比例介于合适的范围，这样才可以认为每个具有荧光信号的微液滴的样本中只含有一个dna分子。

但是，当定量未知核酸浓度的样品时，由于不知道样品中究竟含有多少个核酸分子，所以无法确定需要产生多少个液滴才能保证具有荧光信号的微液滴占液滴总数的比例满足要求，为此，需要对同一个样本进行多次试验，找到上述比例满足要求的实验结果，并以该实验结果作为标定的依据，进而确定核酸溶液的浓度。

目前，由于对同一个样本进行多次试验需要重复很多相同的试验操作，所以会占用工作人员较多的时间，因此，如何能简化试验操作，以节省劳动时间、提高工作效率，成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种用于未知核酸浓度样品pcr定量的装置，利用该装置对未知核酸浓度的样品进行pcr定量时可以简化试验操作，从而有效地节省劳动时间，提高工作效率。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于未知核酸浓度样品pcr定量的装置，包括：

多个密闭容器，所述密闭容器用于放置样品；

与所述密闭容器数量相等的多个连接管，多个所述连接管的一端汇合连通，另一端分别与不同的所述密闭容器连通，多个所述密闭容器的容积各不相同，而多个所述连接管流道体积均相等，或者多个所述密闭容器的容积均相同，而多个所述连接管流道体积各不相等；

加压器，所述加压器用于向多个所述密闭容器和多个所述连接管组成的系统内充气加压；

油相容器，所述油相容器与所述连接管的汇合连通端连通。

优选地，在上述装置中，还包括：

导热片，与所述连接管的汇合连通端连通的微管道以预设匝数缠绕布设在所述导热片上，且所述微管道循环往复地经过所述导热片的上表面和下表面；

位于所述导热片的上表面一侧或下表面一侧的恒温器，所述恒温器用于使所述导热片靠近所述恒温器的一面加热至pcr扩增的高温变性温度，而使所述导热片相对的另一面加热至pcr扩增的低温复性温度。

优选地，在上述装置中，所述预设匝数为20匝～80匝。

优选地，在上述装置中，还包括：

用于作为热源的恒温器；

导热片，所述导热片的一部分搭接在所述恒温器上，其余部分悬在所述恒温器之外，与所述连接管的汇合连通端连通的微管道布设在所述导热片的相对所述恒温器的另一面上，且所述微管道以预设次数循环往复地经过所述导热片与所述恒温器搭接的部分和悬在所述恒温器之外的部分。

优选地，在上述装置中，所述预设次数为20次～80次。

优选地，在上述装置中，所述导热片为pdms芯片，所述导热片上集成有与所述微管道的出口连通的收集器。

优选地，在上述装置中，所述导热片的材质为铝合金或不锈钢。

优选地，在上述装置中，所述微管道的出口一端连通有透气管或流量可调的排气阀。

优选地，在上述装置中，所述密闭容器、所述油相容器和所述加压器中的至少一者为注射器。

本发明提供的用于未知核酸浓度样品pcr定量的装置的工作原理为，首先向密闭容器、连接管和油相容器组成的系统内充气加压，使系统的内部压强大于外部压强，然后通过液体的封堵分别截住一部分高压强的气体，最后将连接管的汇合连通端与系统的外部导通，使密闭容器与连接管之间形成压差，于是液体在高压气体的作用下自发流动，而由于各个密闭容器容积各不相同时，各个连接管的流道体积均相等，或者各个密闭容器容积均相同时，各个连接管的流道体积各不相等，所以不同密闭容器内的样品到达连接管的汇合连通端的时间不同，从而实现多份样品的顺序流动。

由上述工作原理可知，本发明提供的装置能够实现多份样品的自发顺序流动，因此可以通过一次试验对待测样品(未知核酸浓度)的多种不同稀释比例情况进行pcr定量，与现有技术中对未知浓度样品进行pcr定量需要采用多次试验相比，该装置可以简化试验操作，从而有效地节省劳动时间，提高工作效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例一提供的一种用于未知核酸浓度样品pcr定量的装置的示意图；

图2是本发明实施例二提供的一种用于未知核酸浓度样品pcr定量的装置的示意图。

图中标记为：

a、样品顺序流动区；b、液滴生成区；c、pcr扩增区；d、收集区；1、加压器；2、密闭容器；3、管接头；4、连接管；5、通气阀；6、油相容器；7、四通管；8、恒温器；9、导热片；10、微管道；11、收集器；12、排气阀。

具体实施方式

为了便于理解，下面结合附图对本发明作进一步的描述。

参见图1，为本发明实施例一提供的一种用于未知核酸浓度样品pcr定量的装置的示意图，该装置包括加压器1、多个密闭容器2、多个连接管4和油相容器6。

其中，密闭容器2用于放置样品，多个密闭容器2的容积各不相同；

连接管4与密闭容器2数量相等，多个连接管4的流道体积均相等，且多个连接管4的一端汇合连通，另一端分别与不同的密闭容器2连通；

加压器1用于向多个密闭容器2和多个连接管4组成的系统内充气加压；

油相容器6与连接管4的汇合连通端连通。

由图1可见，在实施例一中，微管道10的进口连通四通管7的第一接口，油相容器6的出口与四通管7和微管道10之间的管路连通，四通管7的第二接口和第三接口分别通过连接管4及管接头3与密闭容器2连通，四通管7的第四接口依次连接通气阀5和加压器1。

为了实现pcr扩增，现有技术中一般需要配置热循环仪，由于热循环仪进行温度循环控制普遍需要较为复杂的控制系统，所以使得整个数字pcr装置的成本较高，而且，由于控制系统结构的需要，一般也会造成数字pcr装置的体积很大。为此，本发明实施例一提供的数字pcr装置还包括恒温器8和导热片9，其中，微管道10以预设匝数缠绕布设在导热片9上，且微管道10循环往复地经过导热片9的上表面和下表面，如图1所示，恒温器8既可以位于导热片9的上表面一侧，也可以位于导热片9的下表面一侧，恒温器8用于使导热片9靠近恒温器8的一面加热至pcr扩增的高温变性温度，而使导热片9相对的另一面加热至pcr扩增的低温复性温度。

微管道10缠绕导热片9的预设匝数可以为20匝～80匝，例如缠绕40匝或60匝。

如图1所示，微管道10的出口连通有收集器11，收集器11连通有排气阀12，荧光检测仪可以放置在微管道10的末端，用于对液滴总数和具有荧光的液滴进行计数。整个数字pcr装置包括样品顺序流动区a、液滴生成区b、pcr扩增区c和收集区d，与传统技术相比，利用该数字pcr装置可以将液滴生成，pcr扩增、检测三个过程一次连续进行，在时间上是连续的，省去了复杂的中间操作，如样品的设备间转移等操作。

具体实际应用中，油相容器6、密闭容器2和加压器1均可采用注射器。

下面以油相容器6、密闭容器2和加压器1均为注射器时的情形为例介绍该数字pcr装置的工作原理：

将除了油相容器6、密闭容器2和加压器1以外的部分如图1所示连接起来后，将缠绕了微管道10的导热片9放置在恒温器8上，设置恒温器8的温度为pcr扩增的高温变性温度，例如95℃。导热片9的上、下表面的温差随材质导热率和导热片9的几何尺寸改变，因此可以通过合理的设计使导热片9远离恒温器8的一面的温度为pcr扩增的低温复性温度，例如65℃。

取两个20ml注射器分别作为加压器1和油相容器6，加压器1初始位置为20ml刻度，油相容器6固定在10ml位置，内部加入4ml矿物油。取四个5ml注射器作为密闭容器2，将四个密闭容器2分别固定在1ml、2ml、3ml、4ml位置(实现容积各不相同)，取样品溶液50微升3份，分别稀释10倍、100倍和1000倍，然后取原溶液、稀释10倍、100倍、1000倍溶液各50微升，并按照浓度由高到低分别放置在四个密闭容器2内。

待导热片9上表面温度平衡后，将六个注射器接入系统，关闭末端排气阀12，打开通气阀5，将密闭容器2和油相容器6水平放置(液体不淹没注射器出口即可)，将加压器1由20ml位置压缩到5ml位置并固定，此时系统内部压力高于外界大气压，一段时间(10s即可)后，关闭通气阀5，将密闭容器2和油相容器6竖直放置(液体淹没注射器出口)，缓慢打开排气阀12，矿物油(油相)和样品(水相)即可流向微管道10并在微管道10内产生微小液滴，液滴沿着微管道10循环往复地经过导热片9的上表面和下表面，最后进入收集器11。

在图1所示的样品顺序流动区a这一部分，由于多个密闭容器2的容积各不相同，而多个连接管4流道体积均相等，所以各份样品(仅浓度不同)到达连接管4的汇合连通端的时间不同，从而实现不同浓度样品的顺序流动。由此可见，该装置可以通过一次试验对待测样品(未知核酸浓度)的多种不同稀释比例情况进行pcr定量，与现有技术中对未知浓度样品进行pcr定量需要采用多次试验相比，该装置可以简化试验操作，从而有效地节省劳动时间，提高工作效率。

为了控制液滴的pcr扩增时间。可以通过改变排气阀12的空气通量来改变液滴的流速，因此排气阀12可以选用流量可调的排气阀。具体实际应用中，还可以用透气性材料制成的管件来代替排气阀12，如在微管道10的出口一端连通微型透气管道、硅胶管等。

参见图2，为本发明实施例二提供的一种用于未知核酸浓度样品pcr定量的装置的示意图，实施例二与实施例一工作原理相同，结构上存在以下两点不同：

第一，在实施例二中，多个密闭容器2的容积均相同，而多个连接管4的流道体积各不相等；

第二，在实施例二中，导热片9的一部分搭接在恒温器8上，其余部分悬在恒温器8之外，与连接管4的汇合连通端连通的微管道10布设在导热片9的相对恒温器8的另一面上，且微管道10以预设次数(一般为20次～80次，例如40次或60次)循环往复地经过导热片9与恒温器8搭接的部分和悬在恒温器8之外的部分。

具体实际应用中，导热片9可以为pdms芯片，并可将与微管道10的出口连通的收集器11集成到pdms芯片上。导热片9可以根据需要选用不同导热属性的基片，例如导热片9的材质可以为铝合金或不锈钢，还可以为高热阻材料。当仅用空气就能满足要求时，可以用空气层代替导热片9。

除了实施例一和实施例二所示的对系统进行充气加压的方式以外，加压器1还可以通过排气阀12向系统内充入气体，即采用末端加压的方式。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。