一种氮哌酮人工抗原的合成方法与流程

本发明涉及一种氮哌酮人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术：

氮哌酮（azaperone，又称阿扎哌隆）是一种丁酰苯类神经安定药。动物经肌肉注射此药后可消除紧张感，活动力下降，对环境淡漠并长期处于安静状态，有助于避免动物因“聚居应激”和在混群时发生互相攻击和打斗的现象，降低因应激及创伤引起的死亡率，因此在长途运输中常常给猪等动物使用该药。我国动物性食品中最高残留限量标准规定猪的肌肉、皮和脂肪、肝、肾中氮哌酮的最大残留限量值（mrl）分别为60，60，100，100mg/kg。因此，建立快速有效的检测氮哌酮含量的方法具有重要意义及市场价值。

酶联免疫法（elisa）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种氮哌酮人工抗原的合成方法，所制备的产品用于氮哌酮免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案：一种氮哌酮人工抗原的合成方法，其由4-苯丁酸甲酯与4-氯丁酰氯反应得到具有羧基的产物，即半抗原azap，用碳二亚胺法将半抗原azap与载体蛋白偶联，即得到氮哌酮人工抗原；步骤为：

（1）半抗原azap的合成：

合成路线如下：

将1.00g4-苯丁酸甲酯(化合物1)，4-氯丁酰氯1.19g，和氯化铝1.50g，加入10ml二硫化碳中，升温至室温并搅拌过夜；向反应液中加冰水，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得黄色油状中间产物2；

将1.20g中间产物2，碘化钾98.5mg，碳酸钾1.17g，加入12ml乙腈溶液中，加入1-（2-吡啶基）哌嗪700mg，反应液升温至70℃过夜；向反应液中加冰水，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩；经硅胶柱纯化得到黄色油状中间产物3；

将360mg中间产物3，氢氧化锂90.2mg，加入3ml四氢呋喃和1ml水；反应液升温至室温，搅拌过夜；用盐酸酸化至ph为6，饱和食盐水水洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体，制备得半抗原azap；

（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原azap，与bsa偶联得到偶联物完全抗原azap-bsa。

步骤（2）所述完全抗原azap-bsa制备方法如下：

a、称取步骤（1）制得的azap1.8mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐2.6mg，n-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，用300μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4～5h，称为a液；称取牛血清蛋白bsa10mg（azap与bsa摩尔比为30：1），加入等体积硼酸缓冲溶液（称为b液）；在室温条件，逐滴将a液加入到b液中，室温反应过夜，即得偶联物azap-bsa混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物azap-bsa混合液放入透析袋于0.01mol/l的pbs中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原azap-bsa。

氮哌酮人工抗原的鉴定

（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。

用pbs配制0.5mg/ml的蛋白溶液与完全抗原溶液，以pbs建立基线，在波长200~500nm间扫描，得到蛋白溶液与完全抗原溶液在半抗原的紫外吸收特征峰处的吸光值分别为a1，a2；用甲醇配制5~50μg/ml的半抗原即为xμg/ml，以甲醇建立基线，在波长200~500nm间扫描，得到半抗原紫外吸收特征峰处的吸光值a3，半抗原的相对分子质量为m1，蛋白的相对分子质量为m2，则偶联比=[(a2-a1)(x/m1)/a3]/(0.5/m2)

本发明的有益效果：本发明成功合成了氮哌酮的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径。

附图说明

图1半抗原azap的nmr鉴定图。

图2半抗原azap的lc-ms鉴定图。

图3azap-bsa人工抗原的免疫原紫外鉴定图。

具体实施方式

实施例1半抗原azap的合成

合成路线如下：

将1.00g4-苯丁酸甲酯(化合物1)，4-氯丁酰氯1.19g，和氯化铝1.50g，加入10ml二硫化碳中，升温至室温并搅拌过夜；向反应液中加冰水，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得黄色油状中间产物2；

将1.20g中间产物2，碘化钾98.5mg，碳酸钾1.17g，加入12ml乙腈溶液中，加入1-（2-吡啶基）哌嗪700mg，反应液升温至70℃过夜；向反应液中加冰水，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩；经硅胶柱纯化得到黄色油状中间产物3；

将360mg中间产物3，氢氧化锂90.2mg，加入3ml四氢呋喃和1ml水；反应液升温至室温，搅拌过夜；用盐酸酸化至ph为6，饱和食盐水水洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体，制备得半抗原azap；

实施例2完全抗原的制备

制备的半抗原azap与bsa偶联得到偶联物完全抗原azap-bsa；

a、称取制备的azap1.8mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐2.6mg，n-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，用300μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应4～5h，称为a液；称取牛血清蛋白bsa10mg（azap与bsa摩尔比为30：1），加入等体积硼酸缓冲溶液（称为b液）；在室温条件，逐滴将a液加入到b液中，室温反应过夜，即得偶联物azap-bsa混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物azap-bsa混合液放入透析袋于0.01mol/l的pbs中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原azap-bsa。azap-bsa免疫原的紫外鉴定图如图3所示；

实施例3氮哌酮人工抗原的鉴定

（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。

偶联物蛋白浓度测定：将反应前蛋白的质量除以透析后偶联物的体积即可得到偶联物中蛋白的含量。

偶联物azap-bsa的特征吸收峰在303nm处，此处的吸光值a2=0.589148，bsa在此处的吸光值a1=0.073550，azap的特征吸收峰a3=0.300935，azap的相对分子质量m1=495，bsa的相对分子质量m2=67000，x为50μg/ml，则根据偶联比公式：

偶联比=[(a2-a1)(x/m1)/a3]/(0.5/m2)，azap-bsa中半抗原azap与蛋白bsa的偶联比为697.8:1。