WBSCR22基因在检测结直肠癌细胞中奥沙利铂耐受性中的应用及药物组合物的制作方法

本发明涉及治疗结直肠癌的药物技术领域，具体涉及wbscr22基因在检测结直肠癌细胞中奥沙利铂耐受性中的应用及药物组合物。

背景技术：

结直肠癌(crc)是消化道最常见的恶性肿瘤之一，在全世界与癌相关的死因中位居第三。

奥沙利铂是第一个在结直肠癌治疗中被证实有效的铂类药物。奥沙利铂通过与dna的相互作用，形成铂-dna加合物，阻止转录因子与dna的结合以抑制基因的转录，而且造成dna的链内、链外及与蛋白质的交联，从而阻断了dna的复制，导致细胞周期阻滞和细胞死亡。奥沙利铂还通过氧化应激反应生成过氧化氢等活性氧自由基(ros)产生细胞毒性，导致细胞dna氧化损伤。

尽管奥沙利铂是结直肠癌治疗中最有效的药物之一，但与其它临床常用抗癌药物如顺铂、阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶等一样具有获得性及固有性耐药性。药物耐受降低药物临床疗效，限制其在临床的使用。奥沙利铂耐受的产生是一个十分复杂的生物过程，影响因素、参与机制众多。奥沙利铂化疗耐受机制包括药物耐受相关蛋白过表达和/或缺失、基因突变、细胞内药物蓄积及铂-dna加合物形成减少、micrornas的作用及信号传导通路缺陷等。因此，全面分析其耐药性产生的机制，必将对恶性肿瘤临床化疗和药物耐受逆转的深人研究发挥重要的指导作用。

为了克服及逆转结直肠癌奥沙利铂耐受，需要使用准确、灵敏、特异性强的生物标记物辅助尽早判断结直肠癌是否奥沙利铂耐受及耐受程度，指导临床用药，以提高临床疗效，改善患者预后。

技术实现要素：

为了实现结直肠癌奥沙利铂耐受的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供了wbscr22基因在检测结直肠癌细胞中奥沙利铂耐受性中的应用及药物组合物，wbscr22基因作为用于结直肠癌奥沙利铂耐受诊断及治疗的生物标记物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

wbscr22基因在检测结直肠癌细胞中奥沙利铂耐受性中的应用。

wbscr22基因在检测离体结直肠癌细胞中奥沙利铂(治疗结直肠癌药物)耐受性中的应用，从而有利于检测治疗结直肠癌药物奥沙利铂耐受性。

wbscr22基因表达上调则奥沙利铂所致细胞生长抑制降低，奥沙利铂耐受性升高，表明wbscr22基因表达水平与奥沙利铂耐受程度呈正相关。

采用抑制剂抑制wbscr22基因表达，则奥沙利铂所致细胞生长抑制提高，则能使得奥沙利铂耐受性降低。

所述的wbscr22基因如seqidn0.1或seqidno.2所示。

进一步，所述检测采用芯片、印迹法、rt-pcr、rt-qpcr、fish法、cgh法、阵列cgh法、亚硫酸氢盐测序法或者cobra法，检测wbscr22基因表达水平变化以诊断结直肠癌奥沙利铂耐受的产品。

其中，印迹法包括northern、southern、western印迹法。southern印迹法是将从样本得到的基因组dna分离并固定，通过检测dna与wbscr22基因的杂交来测定样本中的wbscr22基因；northern印迹法是一种将由样本中获得的mrna分离、固定，通过检测mrna与wbscr22基因的杂交来检测该基因的mrna；western印迹法是一种将样本中的蛋白分离、固定，通过检测抗体与wbscr22蛋白的免疫反应来分析基因的表达水平。

其中，所述用rt-pcr诊断结直肠癌奥沙利铂耐受的产品至少包括一对特异扩增wbscr22基因的引物；所述用rt-qpcr诊断结直肠癌奥沙利铂耐受的产品至少包括一对特异扩增wbscr22基因的引物如seqidno.3及seqidno.4所示。即奥沙利铂耐受性检测中，采用一对特异扩增wbscr22基因的引物，如seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明提供了一种诊断结直肠癌奥沙利铂耐受的产品，所述产品能够通过检测样本中wbscr22基因的表达水平来诊断结直肠癌奥沙利铂耐受。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或制剂。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测wbscr22基因转录水平的针对wbscr22基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的wbscr22蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测wbscr22基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括wbscr22蛋白的特异性抗体。

本发明所述的基因芯片或基因检测试剂盒可用于检测包括wbscr22基因在内的多个基因(例如，与结直肠癌奥沙利铂耐受相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括wbscr22蛋白在内的多个蛋白质(例如，与结直肠癌奥沙利铂耐受相关的多个蛋白质)的表达水平。将结直肠癌奥沙利铂耐受的多个标志物同时进行检测，可显著提高结直肠癌奥沙利铂耐受诊断的准确率。

本发明提供了wbscr22基因在制备治疗结直肠癌的药物组合物中的应用。

所述治疗结直肠癌的药物组合物包含wbscr22基因和/或其表达产物的抑制剂。

进一步，所述治疗结直肠癌的药物组合物包含wbscr22基因和/或其表达产物的抑制剂以及奥沙利铂。

进一步，所述药物组合物包括wbscr22基因和/或其表达产物的抑制剂。所述抑制剂包括抑制wbscr22基因表达的物质、抑制wbscr22基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制wbscr22基因表达产物活性的物质。

进一步，所述抑制剂是针对wbscr22基因的sirna及shrna，针对wbscr22蛋白的抗体；优选的，所述抑制剂为shrna如seqidno.8及seqidno.9所示。

一种治疗结直肠癌的药物组合物，所述药物包含wbscr22基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制wbscr22基因表达的物质、抑制wbscr22基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制wbscr22基因表达产物活性的物质。

一种克服或逆转结直肠癌奥沙利铂耐受的方法，所述方法是将针对wbscr22基因的sirna、shrna、反义寡核苷酸或功能缺失型基因在体外导入到癌细胞中。

一种组合药物，所述组合药物包括上述的药物组合物、和含抗癌剂的药物组合物。

进一步，抗癌剂的药物组合物包括但不限于免疫治疗剂如西妥昔单克隆抗体，化学治疗剂或化学放射性治疗剂如5-氟尿嘧啶、紫杉醇，或者是两者。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明首次发现了与结直肠癌奥沙利铂耐受相关的生物标记物wbscr22，通过检测样品中wbscr22基因表达水平，来实现结直肠癌奥沙利铂耐受的早期诊断。

本发明提供了诊断、克服或逆转结直肠癌奥沙利铂耐受的分子标记物，通过靶向于分子标志物来诊断、治疗结直肠癌奥沙利铂耐受具有敏感性和特异性。

本发明对结直肠癌奥沙利铂耐受的机制研究提供了一定的理论基础。

附图说明

图1：结直肠癌细胞wbscr22基因表达水平与奥沙利铂耐受程度呈正相关；图1中(a)为rt-qpcr检测结直肠癌细胞wbscr22基因表达水平；图1中(b)为mtt法检测奥沙利铂对结直肠癌细胞生长抑制作用；

图2：结直肠癌细胞wbscr22表达下调显著提高奥沙利铂作用敏感性；图2中(a)为shrna稳定转染显著敲低结直肠癌细胞wbscr22表达水平；图2中(b)为mtt法检测奥沙利铂对结直肠癌细胞生长抑制作用；wt：野生型结直肠癌细胞；shcon：阴性对照细胞；shwbscr22：wbscr22基因稳定敲低细胞；

图3：wbscr22表达下调显著提高奥沙利铂对裸小鼠异种移植结直肠癌的生长抑制作用；shcon：阴性对照细胞；shwbscr22：wbscr22基因稳定敲低细胞；rmtv：肿瘤相对平均体积；5％gs：5％葡萄糖溶液。

具体实施方式

本发明首次发现了wbscr22与结直肠癌奥沙利铂耐受的相关性，并验证了wbscr22在结直肠癌细胞中高表达。wbscr22可作为结直肠癌奥沙利铂耐受的独立预测因子，也可以和其他基因标志物联合应用。

本发明中术语“生物标记物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有seqidn0.1或seqidno.2指定的编码序列或氨基酸序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少85％相同或相似的cdna序列或氨基酸序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cdna序列或氨基酸序列。

本文所述的生物标记物包括基因和蛋白。此类生物标记物包括含有编码生物标记物的核酸序列或此序列的互补序列的完整或部分序列的dna。生物标记物核酸还包括含有所关注的任何核酸序列的完整或部分序列的rna。生物标记物蛋白是由本发明的dna生物标记物编码的或对应于本发明的dna生物标记物的蛋白。生物标记物蛋白包含任何生物标记物蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。生物标记物基因和蛋白的片段和变体也包括在本发明的范围内。所谓“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列并因而编码的蛋白的一部分。为生物标记物核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300或1400个连续的核苷酸，或最多存在于本文所公开的全长生物标记物多核苷酸中的核苷酸个数。生物标记物多核苷酸的片段将通常编码至少15、25、30、50、100、150、200或250个连续氨基酸，或存在于本发明的全长生物标记物蛋白中的氨基酸的总数。“变体”旨在表示基本上相似的序列。一般来讲，本发明的特定生物标记物的变体将具有通过序列比对程序测定的与所述生物标记物至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录或翻译水平上检测生物标记物的表达水平。

在一些实施方案中，在转录水平上检测生物标记物的表达水平。利用核酸杂交技术进行具体dna和rna测量的多种方法是本领域技术人员已知的。一些方法涉及电泳分离(例如，用于检测dna的southern印迹和用于检测rna的northern印迹)，但是也可以在不利用电泳分离的情况下进行dna和rna的测量(例如，通过斑点印迹)。基因组dna(例如，来自人)的southern印迹可用于筛选限制性片段长度多态性(rflp)，以检测影响本发明多肽的遗传病症的存在。可以检测所有形式的rna，包括但不限于信使rna(mrna)、微rna(mirna)、核糖体rna(rrna)和转运rna(trna)。

本发明中的药物组合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本发明的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、ph控制剂及表面活性剂。

缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如<l％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。稳定剂包括人类血清蛋白、l-氨基酸、糖及纤维素衍生物。l-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。

本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括opadry；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(peg)、丙二醇等。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的ph以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话，可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时，可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如，通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋，也可制备所述制剂已延长或维持释放。

本发明的药物还可与其他治疗结直肠癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明所述的药物组合物也可以脂质体输送系统形式给药，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可有多种磷脂形成，如胆留醇、硬脂基胺或磷脂酰胆碱。

本发明药物组合物可以局部给药的药物组合物，可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

本发明中术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对癌检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定癌检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的癌检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。

术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

在本发明中，术语“抗体”是指选择性结合目标抗原的天然或合成抗体。该术语包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子外，那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及选择性结合目标抗原的免疫球蛋白分子的人类或人源化形式也包括在术语“抗体”的范围内，只要它们展现出期望的生物学活性即可。“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。

单克隆抗体还包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性即可。

多克隆抗体包含对产生人抗体的动物(例如，小鼠)免疫wbscr22蛋白质而得的抗体。当制备了嵌合抗体或人源化抗体之后，可以将可变区(例如，fr)和/或恒定区中的氨基酸用其他氨基酸替换等。

氨基酸的替换例如是小于15个、小于10个、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下、或2个以下的氨基酸、优选1-5个氨基酸、更优选1或2个氨基酸的替换，替换抗体应与未替换抗体在功能上等同。期望替换是保守的氨基酸替换，这是电荷、侧链、极性、芳香族性等性质类似的氨基酸之间的替换。性质类似的氨基酸例如可以分类为碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、无极性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸)、支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸)等。

本发明中术语“治疗”是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症为目的对患者进行的医学管理。该术语包括积极疗法，即专门以改善疾病、病理状态或病症为目的的治疗，并且还包括病因治疗，即以除去相关疾病、病理状态或病症的病因为目的的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理状态或病症的治疗；预防性治疗，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症的发展为目的的治疗；以及支持性治疗，即用于补充另一种以改善相关疾病、病理状态或病症为目的的特定疗法的治疗。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1结直肠癌细胞wbscr22基因差异表达与奥沙利铂耐受相关性分析

1.细胞培养：人结直肠癌细胞系ht-29、caco-2、rko、hct116及colo205购自中科院上海细胞库。肿瘤细胞生长在含体积分数10％胎牛血清dmem培养基(gibco公司产品)，于37℃、体积分数5％co2饱和湿度的培养箱中传代培养，实验用细胞均处于对数生长期。2-3天换液1次，使用质量分数0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

2.提取细胞总rna：质量分数0.25％胰蛋白酶消化收对数生长期，收集细胞于1.5mlep管中，每管中加入lmltrizol(invitrogen公司产品)，吹打，室温25℃放置5min。每个ep管加入0.2ml三氯甲烷，振荡15sec，室温25℃放置3min，4℃离心12000rpm×15min。将上层水相移到另一新的离心管中(注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质)，加入等体积-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，室温25℃放置10min，4℃离心12000rpm×10min，弃上清液，按lml/mltrizol的比例加入体积分数75％depc配制预冷乙醇，振荡混匀，4℃离心12000rpm×5min。弃去乙醇液体，室温25℃放置5min，加入depc水溶解沉淀。nanodrop2000紫外分光光度计(thermoscientific公司产品)测量rna纯度及浓度，-70℃保存。

3.逆转录合成cdna：reveretranscriptionsystem为promega公司产品。取1μg总rna，逆转录引物为oligo(dt)，总体系20μl，逆转录合成cdna。逆转录条件：42℃×60min，95℃×5min，4℃×30min，cdna分装后-20℃保存。普通pcr为abi公司9700型pcr仪。

4.qpcr：实时荧光定量pcr仪为abi公司7500fast荧光定量pcr仪，采用sybrgreeni(roche公司产品)及δδct相对定量法。qpcr反应体系：2×sybergreenimix10μl，10μm上下游引物各0.3μl，cdna模板(1：100倍稀释)5μl，无酶去离子水4.4μl，反应总体系为20μl。每个反应设置3个复孔，同时设置无模板对照。经优化qpcr的反应条件如下：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火及延伸60sec，40个循环。设置在延伸阶段收集荧光信号，经软件sds2.05分析得到样本中各基因的循环域值(cq值)。qpcr反应结束后进行熔解曲线检测：加热qpcr扩增产物从60℃至95℃，每隔0.35℃检测1次荧光强度变化。软件sds2.05自动读取相关数据。每个样本实验重复3次。

5.qpcr扩增引物：由上海生物工程公司合成。引物具体序列如下：wbscr22基因正向引物为5'-catttgatggttgcatcagc-3'(seqidno.3)；反向引物为5'-cttggcagggttttcagact-3'(seqidno.4)。管家基因actin正向引物为5'-catcgagcacggcatcgtca-3'(seqidno.5)；反向引物为5'-tagcacagcctggatagcaac-3'(seqidno.6)。

6.奥沙利铂对结直肠癌细胞系生长抑制作用：采用mtt法。将2000个对数生长期结直肠癌细胞接种于96孔板，完全培养基100ml/孔。设置4个复孔。24h后加入奥沙利铂(终浓度10、50μm)作用24h。加入无血清dmme培养基配制1mg/mlmtt(sigma公司产品)溶液100ml/孔，置于细胞培养箱孵育3h。悬浮细胞colo205室温离心5000rmp×10min(贴壁细胞不用离心)，弃上清，加异丙醇250ml/孔，振荡30min，酶标仪检测od值(570nm)，计算细胞生长抑制率。实验至少重复3次。

7.结果：如图1所示，结直肠癌细胞wbscr22基因表达上调则奥沙利铂所致细胞生长抑制降低，表明wbscr22基因表达水平与奥沙利铂耐受程度呈正相关。

实施例2shrna介导的结直肠癌细胞wbscr22基因表达下调显著提高奥沙利铂作用敏感性

1.细胞培养：人结直肠癌细胞系ht-29、caco-2、rko培养同实施例1。

2.构建靶向人wbscr22基因的shrna质粒

1)退火：靶向人wbscr22基因的单链dna序列为5'-gccctgttacctgctggat-3'(seqidno.7)，shrna载体为rnai-readypsiren-retroq(clontech公司产品)。参照操作指南，合成wbscr22shrna寡核苷酸(上海生物工程公司合成)，包括top链(5'-gatccggccctgttacctgctggatttcaagagaatccagcaggtaacagggcttttttacgcgtg-3')(seqidno.8)及bottom链(5'-aattcacgcgtaaaaaagccctgttacctgctggattctcttgaaatccagcaggtaacagggccg-3')(seqidno.9)。1×te缓冲液溶解上述寡核苷酸为100μm，各取2.5μl混匀，经pcr反应退火。pcr的反应条件如下：95℃×30sec，72℃×2min，37℃×2min，25℃×2min。退火产物放置冰上，1×te缓冲液稀释至0.5μm，-20℃保存。

同时设置阴性对照序列，阴性对照寡核苷酸由clontech公司提供。

2)连接：反应体系为线性化shrna载体rnai-readypsiren-retroq(25ng/μl)2μl，上述步骤1)中退火产物(0.5μm)1μl，10×t4dna连接缓冲液1.5μl，牛血清白蛋白(bsa，10mg/ml)0.5μl，t4dna连接酶(350u/μl，takara公司产品)9.43μl。室温反应3h，连接产物-20℃保存。

3)连接产物转化大肠杆菌：100μl感受态大肠杆菌jm109(promega公司产品)放置冰上融解后，加入上述步骤2)中连接产物2μl，冰上放置30min，42℃×90sec，4℃×2min。加入lb培养基900μl，37℃振荡孵育200rmp×1h。

4)涂板、挑取克隆及质粒小量抽提：制备lb氨苄青霉素(100μg/ml)抗性平板。取上述步骤3)中转化产物涂布于lb平板，37℃振荡孵育200rmp×16h，观察平板上克隆形成情况，4℃保存。挑取克隆置于lb培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)，37℃振荡孵育200rmp×16h，离心4800g×15min，弃上清。参照质粒小抽试剂盒(qiagen公司产品)操作指南抽提质粒，nanodrop2000紫外分光光度计测量质粒纯度及浓度，-20℃保存。

5)鉴定阳性克隆：特异性内切酶酶切质粒，酶切反应体系：上述步骤4)中抽提的质粒500ng，mlui内切酶(takara公司产品)0.5μl，10×h缓冲液1μl，加灭菌双蒸水至反应体系为10μl。37℃水浴酶切过夜。酶切产物加入上样缓冲液(takara公司产品)质量分数1％琼脂糖凝胶电泳，80v×80min，凝胶成像系统留图。根据电泳图，挑选阳性克隆。阳性克隆质粒大量扩增及抽提(质粒大抽试剂盒为qiagen公司产品)。

3.shrna质粒稳定转染敲低结直肠癌细胞wbscr22基因表达

1)确定嘌呤霉素最适剂量：将0.5-1×10⁵对数生长期结直肠癌细胞接种于6孔板，按2-4ml/孔加入完全培养基，细胞贴壁后各孔分别加入不同剂量嘌呤霉素(merk公司产品)，每日倒置显微镜下观察细胞生长状态，选择3-5天致所有结直肠癌细胞死亡的嘌呤霉素剂量作为筛选阳性克隆所需嘌呤霉素的最适剂量；所述的完全培养基为添加有胎牛血清的dmem细胞基础培养基，胎牛血清体积分数为10％。

2)转染：将0.5-1×10⁵对数生长期结直肠癌细胞接种于6孔板，按2-4ml/孔加入完全培养基，24h后将20μllipofectaminetm2000(invitrogen公司产品)转染试剂加入230μl无血清细胞基础培养基室温25℃孵育5-20min，再加入含2-5μgshrna质粒的250μl无血清细胞基础培养基室温25℃孵育20min后加入6孔板，置于细胞培养箱培养4-6h后弃培养基，加入2-4ml新鲜完全培养基继续培养，24h后按步骤1)获得的最适剂量加入嘌呤霉素培养。

3)6孔板单克隆形成法筛选阳性克隆：3-4天后胰酶消化细胞并计数，按300-500个/孔将获得的结肠癌细胞接种于6孔板，加入2-4ml/孔促生长培养基并按最适剂量加入嘌呤霉素继续培养，所述的促生长培养基为添加有同种野生型癌细胞培养基的过滤液及胎牛血清的dmem细胞基础培养基，同种野生型癌细胞培养基的过滤液的体积分数为1/3-1/2，胎牛血清体积分数为20％，5-8天后挑取8-10个单克隆置于24孔板，加入0.5-1ml/孔新鲜完全培养基，并按最适剂量加入嘌呤霉素继续培养，3-5天后westernblot检测wbscr22表达，挑选出wbscr22显著敲低阳性单克隆。

4)扩增培养：将步骤3)中挑选出的阳性单克隆细胞继续扩增培养，培养时在完全培养基中仍需按最适剂量加入嘌呤霉素，每2-3天换液一次。

上述技术方案中，在步骤2)中设有shrna质粒阴性对照实验及未转染阴性细胞对照实验。

4.奥沙利铂对结直肠癌细胞生长抑制作用：采用mtt法。将1000-2000个对数生长期结直肠癌细胞接种于96孔板，完全培养基100ml/孔，设置4个复孔。24h后加入系列浓度奥沙利铂作用72h。加入无血清dmme培养基配制1mg/mlmtt溶液100ml/孔，置于细胞培养箱孵育3h。弃上清，加异丙醇250ml/孔，振荡30min，酶标仪检测od值(570nm)，计算细胞生长抑制率。实验至少重复3次。

5.统计学方法：采用graphpadprism5.0(graphpadsoftware公司产品)软件计算ic50值，表示为mean±sd。两者之间的差异釆用t检验，p<0.05表示具有统计学差异。

6.结果：如图2所示，与野生型及阴性对照细胞比较，shwbscr22细胞wbscr22表达显著降低。ht-29shcon及shwbscr22细胞奥沙利铂ic50值分别为12.39±0.66、3.78±0.14μm，caco-2细胞为43.31±2.67、14.05±1.09μm，rko细胞为5.76±0.20、1.41±0.21μm。ic50值分别降低3.28、3.08及4.09倍。上述结果表明shrna介导的wbscr22表达下调提高结直肠癌细胞奥沙利铂敏感性，具有显著性差异(p<0.05)。

实施例3wbscr22表达水平对裸小鼠异种移植结直肠癌奥沙利铂耐受的影响

1.建立裸小鼠异种移植结直肠癌模型：caco-2shcon及shwbscr22细胞培养同实施例1。收集细胞，无血清dmem培养基稀释细胞，终浓度1×10⁷/ml。细胞皮下注射接种于裸小鼠(雌性，4-5周)右侧腋下，200μl/只。接种后第8天，裸小鼠移植瘤体积(tv)达100-300mm³，随机分为对照组及治疗组，每组5只。

2.奥沙利铂对裸小鼠异种移植瘤的生长抑制作用：奥沙利铂溶于5％葡萄糖溶液(5％gs)，浓度为0.625g/l，-20℃保存。治疗组裸小鼠于上午10时腹腔注射给药，剂量为7.5mg/kg，每周给药2次，总共3周。对照组裸小鼠腹腔注射5％gs。每5天测量1次tv。tv＝π/6×(长径×短径²)，同时计算平均肿瘤体积(mtv)、相对平均肿瘤体积(rmtv)及肿瘤生长抑制率(ir)。rmtv＝mtvn/mtv0；

3.统计学方法：graphpadprism5.0软件分析mtv(重复测量方差检验)，rmtv(mannwhitney检验)，p<0.05表示具有统计学差异。mtv及rmtv表示为mean±se。

4.结果：实验期间荷瘤小鼠无死亡，给药第25天处死所有裸小鼠。如图3所示，caco-2shwbscr22移植瘤治疗组rmtv(481.50±84.49mm³)显著小于对照组(772.70±66.27mm³；p<0.05)，治疗组奥沙利铂ir为45.08％，caco-2shcon移植瘤对照组及治疗组rmtv分别为949.61±56.50mm³，962.70±73.28mm³，奥沙利铂对caco-2shcon移植瘤生长无抑制作用。实验结果表明结直肠癌细胞wbscr22表达下调显著提高奥沙利铂治疗敏感性，与体外实验结果相符。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

sequencelisting

<110>浙江省医学科学院

<120>wbscr22基因在检测结直肠癌细胞中奥沙利铂耐受性中的应用及药物组合物

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1307

<212>dna

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<400>1

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