一种用于提取葛根黄酮的复合酶及采用该复合酶进行提取的方法与流程

本发明属于复合酶领域，尤其涉及一种用于提取葛根黄酮的复合酶及采用该复合酶进行提取的方法。
背景技术：
：葛根是一种食用草本植物，富含黄酮类化合物。葛根黄酮具有抗菌、活血、抗癌防癌，同时有降血压降低心肌耗氧量及促进视网膜血液流通、抑制血小板聚集、抗心率失常、抗氧化和增强机体免疫力等多种药理作用，是葛根主要的活性成分。提取过程对葛根黄酮的产量至关重要。目前，葛根黄酮提取方法主要有溶剂浸取法、回流提取法等。由于传统的水、有机溶剂提取黄酮类物质方法是利用浓度梯度将植物纤维组织内的有效成分溶解到提取溶剂中。传统方法的提取率较低，提取时间长，资源利用不充分。超声波辅助提取以及微波辅助提取制备葛根总黄酮虽然时间短，但由于设备投资大，运行和维护成本很高，难以用于大规模工厂化生产。现代生物技术的发展促进了外源生物酶在天然活性成分提取加工技术中的应用，也是目前植物提取加工生产的总体发展趋势。技术实现要素：发明目的：本发明的第一目的是提供一种能够应用于提取葛根黄酮且能够有效提高提取率的复合酶；本发明的第二目的是提供采用该复合酶进行提取的方法。技术方案：本发明用于提取葛根黄酮的复合酶，包括果胶酶及β葡萄糖苷酶，两者的总加酶量为150～400iu，其中，β葡萄糖苷酶的酶活占总加酶量的20％～80％。优选的，所述β葡萄糖苷酶的酶活可占总加酶量的30％～50％。进一步说，该复合酶可包括纤维素酶、果胶酶及β葡萄糖苷酶，其中，所述纤维素酶酶活为150～350iu，果胶酶酶活为150～350iu，β葡萄糖苷酶酶活为150～350iu。优选的，纤维素酶酶活可为300～350iu，果胶酶酶活可为300～350iu，β葡萄糖苷酶酶活可为300～350iu。本发明采用复合酶进行提取的方法，包括如下步骤：(1)称取葛根粉碎并过筛，按液料比10～40:1加入ph4.0～6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液；(2)按酶活加入果胶酶及β葡萄糖苷酶，在40～60℃条件下反应0.5～2.5h后，抽滤，即可。优选的，反应时间可为1～2.5h。更进一步说，本发明采用复合酶进行提取的方法，包括如下步骤：(1)称取葛根粉碎并过筛，按液料比10～40:1加入ph3.0～5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液；优选的，液料比可为25～35:1；ph可为4.5～5.5。(2)按酶活加入纤维素酶、果胶酶及β葡萄糖苷酶，在40～60℃条件下反应0.5～2.5h后，抽滤，即可。优选的，反应温度可为40～50℃。有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为：该复合酶能够应用于葛根黄酮的提取，且同时能够有效提高提取率，安全环保、无污染；该提取方法简便，易于操作。附图说明图1为葛根黄酮测定的标准曲线图；图2为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶复合酶时，ph对葛根黄酮提取率的影响图；图3为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶复合酶时，温度对葛根总黄酮提取率的影响图；图4为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶复合酶时，提取时间对葛根总黄酮提取率的影响图；图5为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶复合酶时，酶添加量对葛根黄酮提取率的影响图；图6为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶复合酶时，β葡萄糖苷酶所占比例对葛根黄酮提取率的影响图；图7采用β葡萄糖苷酶-果胶酶复合酶时，料液比对葛根黄酮提取率的影响图；图8为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶-纤维素酶复合酶时，纤维素酶添加量对黄酮提取率的影响图；图9为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶-纤维素酶复合酶时，果胶酶添加量对葛根提取率的影响图；图10为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶-纤维素酶复合酶时，β葡萄糖苷酶对葛根黄酮提取率的影响图；图11为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶-纤维素酶复合酶时，液料比对葛根黄酮提取率的影响图；图12为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶-纤维素酶复合酶时，ph对葛根黄酮提取率的影响图；图13为采用β葡萄糖苷酶-果胶酶-纤维素酶复合酶时，温度对葛根黄酮提取率的影响图。具体实施方式下面结合附图及实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。实施例1称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，按照液料比30:1加入ph5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，加入β葡萄糖苷酶(100iu/g)-果胶酶(20000iu/g)复合酶，复合酶添加量为350iu，β葡萄糖苷酶酶活占总酶活的比例为40％，在45℃水浴1h后抽滤。滤饼按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤，合并前后两次滤液，混匀后测定葛根总黄酮含量。实施例2称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，加入β葡萄糖苷酶(100iu/g)300iu、果胶酶(20000iu/g)300iu，加入纤维素酶(30000iu/g)300iu。按照液料比30:1加入ph5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，50℃水浴1h后抽滤。抽滤时滤饼按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并前后两次滤液，混匀后测定葛根总黄酮含量。葛根黄酮的测定(1)标准曲线的绘制准确称取0.0010g芦丁，用30％乙醇溶解，完全移250ml容量瓶中定容。取此芦丁标准液0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5ml分别放入6支25ml容量瓶中，用30％乙醇补至12.5ml，加入0.7ml5％的nano2溶液摇匀放置5min；加入0.7ml10％的al(no3)3溶液摇匀，放置5min；加入5ml10％的naoh溶液摇匀，用30％乙醇定容放置10min，于波长510nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示，回归方程为y＝6.2514x+0.0024r2＝0.9995。(2)提取液中黄酮含量测定精密移取3ml葛根黄酮提取液于25ml容量瓶中，参照制备标准曲线的显色方法进行显色，根据标准曲线方程计算出提取液中黄酮浓度，换算为提取出的黄酮的质量，算出黄酮提取率。提取率公式为：式中a为吸光度。对比例1称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，按液料比20:1加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。分别加入150iu的半纤维素酶、纤维素酶、脂肪酶、β葡萄糖苷酶、蛋白酶、果胶酶六种酶在各自最适条件下(最适温度和最适ph见表1)处理葛根1h提取葛根黄酮。过滤，滤饼按液料比20:1，用70％乙醇80℃回流提取1h后抽滤。合并前后两次滤液，测定葛根总黄酮含量，计算提取率。表1所使用的酶制剂最适条件名称最适条件提取率/％β葡萄糖苷酶45℃、ph4.55.07纤维素酶50℃、ph4.84.80果胶酶50℃、ph5.55.03半纤维素酶50℃、ph5.03.73脂肪酶40℃、ph6.03.52中性蛋白酶45℃、ph4.84.41对比例2称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，按液料比20:1加入ph4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，50℃水浴1h后抽滤。滤饼按液料比20:1，用70％乙醇80℃回流提取1h后抽滤。合并前后两次滤液，混匀后测定葛根总黄酮含量，计算提取率。对比例3称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，按液料比20:1，用70％乙醇80℃回流提取2h后抽滤。测定滤液中葛根总黄酮含量，计算提取率。将实施例1-2及对比例1-3的提取率进行测定可知，采用β葡萄糖苷酶-果胶酶复合酶对葛根先进行处理，可以有效提高葛根黄酮的提取率。所得葛根黄酮提取率为815％，与未经酶处理相比提高222倍，是醇提两小时提取率的192倍，是β葡萄糖苷酶的1.60倍，是果胶酶的1.62倍，是纤维素酶提取效果的1.70倍。采用β葡萄糖苷酶-果胶酶-纤维素酶复合酶对葛根进行处理，其葛根提取率为9.44％，与未经酶处理相比提高2.57倍，是醇提两小时提取率的2.23倍，是β葡萄糖苷酶的1.86倍，是果胶酶的1.88倍，是纤维素酶的1.97倍。实施例3β葡萄糖苷酶-果胶酶复合酶处理提取葛根黄酮3-1ph对葛根黄酮提取率的影响(1)称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，按照液料比20:1分别加入ph4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，复合酶添加量为300iu，β葡萄糖苷酶所占比例为50％，在50℃水浴1h后抽滤。滤饼按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并前后两次滤液。葛根黄酮提取率如图2所示，随着ph的增加，葛根黄酮的提取率先升高后降低，当ph为5.0时葛根黄酮提取率最高。3-2温度对葛根总黄酮提取率的影响称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，按照液料比20:1加入ph5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，复合酶添加量为300iu，β葡萄糖苷酶所占比例为50％，分别在40、45、50、55和60℃水浴1h后抽滤。滤饼按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并前后两次滤液。葛根黄酮提取率如图3所示，随着温度升高，提取率先增加后降低，当温度为45℃时提取率最高。3-3提取时间对葛根总黄酮提取率的影响称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，按照液料比20:1加入ph5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，复合酶添加量为300iu，β葡萄糖苷酶所占比例为50％，分别在45℃水浴酶解0.5、1、1.5、2以及2.5h后抽滤。滤饼按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并前后两次滤液。葛根黄酮提取率如图4所示，提取时间1h最好，这是由于酶解时间太短，酶解不充分，提取率不高，而酶解时间太长会导致生产周期加大，同时酶活也会逐渐降低，故将酶解时间限定在0.5-2.5h范围内。随着时间的延长，葛根黄酮提取率先升高后降低。当提取时间超过1h时，提取率趋于平缓。3-4酶添加量对葛根黄酮提取率的影响称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，按照液料比20:1加入ph5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，复合酶添加量分别为150iu、200iu、250iu、300iu、350iu和400iu，β葡萄糖苷酶所占比例为50％，分别在45℃水浴提取1h后抽滤。滤饼按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并前后两次滤液。葛根黄酮提取率如图5所示，复合酶总添加量为350iu最好，这是由于加酶量太少，酶解不充分，提取率不高。而加酶量太大则会极大的增加成本，造成浪费，故将加酶量限定在150-400iu范围内。随着酶添加量的增加，葛根黄酮提取率逐渐升高，且在酶添加量为350iu时，提取率最大，之后趋于平缓。3-5β葡萄糖苷酶所占比例对葛根黄酮提取率的影响称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，按照液料比20:1加入ph5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，复合酶添加量为300iu，β葡萄糖苷酶酶活占总酶活所占比例分别为20％、30％、40％、50％、60％和80％，分别在45℃水浴提取1h后抽滤。滤饼按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并前后两次滤液。葛根黄酮提取率如图6所示，复合酶中β葡萄糖苷酶所占比例为40％时最好，这是由于果胶主要存在于细胞间，并且果胶是构成植物细胞壁最外层次生壁的主要成分，所以一定量的果胶酶对葛根黄酮提取率的提高有很大帮助。而一定量的β葡萄糖苷酶可以使黄酮类物质的前体降解，从而有效提高葛根总黄酮的提取率。故将复合酶中β葡萄糖苷酶所占比限定在20-80％范围内。随着β葡萄糖苷酶所占比例的增加，葛根黄酮提取率先升高后降低。当β葡萄糖苷酶所占比例为40％时，葛根黄酮提取率最高。3-6料液比对葛根黄酮提取率的影响称取3.0g粉碎并过40目筛的葛根，按照液料比10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1和40:1加入ph5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，复合酶添加量为350iu，β葡萄糖苷酶所占比例为40％，分别在45℃水浴提取1h后抽滤。滤饼按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并前后两次滤液，提取率如图7所示，液料比在30:1葛根黄酮提取率最高，这是由于液料比太小，酶液对原料葛根的润湿不充分，导致酶解效果下降，降低提取率；而液料比过大，单位体积酶解液的酶活较低，水解效果不好，也会降低提取率，同时会造成浪费。故将料液比限定在10-40:1范围内。随着液料比的增加，葛根黄酮提取率先升高后降低，当液料比为30:1时，提取率最高。实施例4β葡萄糖苷酶-果胶酶-纤维素酶协同作用提取葛根黄酮4-1纤维素酶添加量对黄酮提取率的影响称取3.0g葛根粉，加入β葡萄糖苷酶150iu、果胶酶酶150iu，分别加入纤维素酶150iu、200iu、250iu、300iu和350iu。按照液料比20:1加入ph4.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，50℃水浴1h后抽滤。滤渣按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并前后两次滤液，混匀后测定葛根总黄酮含量，提取率如图8所示，纤维素酶添加量为300iu提取率最高。4-2果胶酶添加量对葛根提取率的影响称取3.0g葛根粉，加入β葡萄糖苷酶150iu、纤维素酶300iu，分别加入果胶酶150iu、200iu、250iu、300iu和350iu。按照液料比20:1加入ph4.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，50℃水浴1h后抽滤。滤渣按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并两次滤液，混匀后测定总黄酮含量，提取率如图9所示，果胶酶添加量为300iu时提取率最高。4-3β葡萄糖苷酶对葛根黄酮提取率的影响称取3.0g葛根粉，加入果胶酶300iu、纤维素酶300iu，分别加入β葡萄糖苷酶150iu、200iu、250iu、300iu和350iu。按照液料比20:1加入ph4.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，50℃水浴1h后抽滤。滤渣按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并两次滤液，混匀后测定总黄酮含量，提取率如图10所示，β葡萄糖苷酶酶添加量为300iu时提取率最高。4-4液料比对葛根黄酮提取率的影响称取3.0g葛根粉，加入果胶酶300iu、纤维素酶300iu，β葡萄糖苷酶300iu。按液料比分别为10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1和40:1加入ph4.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，50℃水浴1h后抽滤。滤渣按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并两次滤液，混匀后测定总黄酮含量，提取率如图11所示，当液料比为30:1时提取率最高。4-5ph对葛根黄酮提取率的影响称取3.0g葛根粉，加入果胶酶300iu、纤维素酶300iu，β葡萄糖苷酶300iu。液料比30:1加入ph3、3.5、4、4.5、5和5.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，50℃水浴1h后抽滤。滤渣按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并两次滤液，混匀后测定总黄酮含量，提取率如图12所示，当ph为5时提取率最高。4-6温度对葛根黄酮提取率的影响称取3.0g葛根粉，加入果胶酶300iu、纤维素酶300iu，β葡萄糖苷酶300iu。液料比30:1加入ph5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，分别再40、45、50、55和60℃水浴1h后抽滤。滤渣按液料比20:1加入70％乙醇，80℃回流提取1h，抽滤。合并两次滤液，混匀后测定总黄酮含量，提取率如图13所示，当温度为50℃时提取率最高。当前第1页12