一种复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶的制备方法及其应用与流程

本发明涉及包含水凝胶的医疗材料，具体地，涉及一种复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶的制备方法及其应用。

背景技术：

胶原蛋白是对皮肤起支撑作用的物质，而玻尿酸则能保持肌肤的柔滑、湿润，因此将二者复合后开发医疗美容产品应用前景广阔。但大量资料及试验结果显示，仅将二者简单溶解后复合溶液会产生大量白色絮状聚电解质沉淀物，影响溶液性状。

因此，本领域迫切需要开发一种可以去除聚电解质沉淀物，并保持溶液均一性的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶的制备方法

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可以去除聚电解质沉淀物，并保持溶液均一性的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶的制备方法。

本发明第一方面提供了一种复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶，所述水凝胶包括：

玻尿酸，所述玻尿酸的浓度为0.05-5wt％，较佳地，0.1-4wt％，更佳地，0.3-3wt％，以所述水凝胶的总重计；

胶原蛋白，所述胶原蛋白的浓度为0.05-5wt％，较佳地，0.1-4wt％，更佳地，0.2-3wt％，以所述水凝胶的总重计。

在另一优选例中，所述玻尿酸与所述胶原蛋白的重量比为0.05－3：0.05－2.5，较佳地，0.1－2：0.2－1，更佳地，0.3－1：0.2－0.8。

在另一优选例中，所述水凝胶不含有细胞。

在另一优选例中，所述细胞选自下组：干细胞、皮肤成纤维细胞、表皮细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述水凝胶不含有交联物质。

在另一优选例中，所述交联物质选自下组：小分子物质、螯合剂、或其组合。

在另一优选例中，所述小分子物质选自下组：edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)、mes(2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物)、bdde(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)、氨基酸、或其组合。

在另一优选例中，所述胶原蛋白选自下组：从动物组织提取的全长活性胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶、或其组合。

在另一优选例中，所述胶原蛋白为全长活性胶原蛋白。

在另一优选例中，所述玻尿酸的分子量为30-300万da，较佳地，120-300万da，更佳地，200-280万da。

在另一优选例中，所述水凝胶还包括缓冲体系。

在另一优选例中，所述缓冲体系选自下组：碳酸盐缓冲体系、磷酸及磷酸盐缓冲体系、氨基酸缓冲体系、碳酸盐缓冲体系、柠檬酸缓冲体系、或其组合。

在另一优选例中，所述缓冲体系的浓度为0.01－5m，较佳地，0.03－2m，更佳地，0.05－0.5m。

在另一优选例中，所述水凝胶中的聚电解质的沉淀含量为0.01－5wt％，较佳地，0.02－2wt％，更佳地，0.03－0.5wt％。

本发明第二方面提供了一种制备复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶的方法，所述方法包括：

(a)提供第一混合液，所述第一混合液包括玻尿酸和水；

(b)提供第二混合液，所述第二混合液包括胶原蛋白和水；和

(c)在缓冲体系存在下，将所述第一混合液和所述第二混合液等比例混合，从而获得本发明第一方面所述的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶。

在另一优选例中，所述水为纯水。

在另一优选例中，所述水的浓度为70－99.9wt％，较佳地，85－99.5wt％，更佳地，90－99wt％，以所述第一混合液的总重计。

在另一优选例中，所述水的浓度为70－99.9wt％，较佳地，85－99.5wt％，更佳地，90－99wt％，以所述第二混合液的总重计。

在另一优选例中，所述玻尿酸与所述胶原蛋白的重量比为0.05－3：0.05－2.5，较佳地，0.1－2：0.2－1，更佳地，0.3－1：0.2－0.8。

在另一优选例中，所述玻尿酸的浓度为0.05-5wt％，较佳地，0.1-4wt％，更佳地，0.3-3wt％，以所述第一混合液的总重计。

在另一优选例中，所述胶原蛋白的浓度为0.05-5wt％，较佳地，0.1-4wt％，更佳地，0.2-3wt％，以所述第二混合液的总重计。

在另一优选例中，所述缓冲体系选自下组：碳酸盐缓冲体系、磷酸及磷酸盐缓冲体系、氨基酸缓冲体系、碳酸盐缓冲体系、柠檬酸缓冲体系、或其组合。

在另一优选例中，所述缓冲体系的浓度为0.01－5m，较佳地，0.03－2m，更佳地，0.05－0.5m。

本发明第三方面提供了一种水凝胶医疗器材，所述医疗器材包含本发明第一方面所述的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶。

在另一优选例中，所述水凝胶医疗器材选自下组：活性物质的控制释放基材、活性物质的包裹基材、止血材、创伤敷材、引导组织再生基材、组织抗粘连基材、组织工程基材、或其组合。

本发明第三方面提供了一种本发明第一方面所述的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶的用途，用于制备水凝胶医疗器材。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了两种组分复合后未经调节产生的白色絮状聚电解质沉淀物。

图2显示了组分经调节缓冲体系后混合液状态澄清，絮状沉淀＜0.05wt％。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，在不含交联物质的条件下，将玻尿酸和胶原蛋白以一定比例混合，可获得水凝胶，其具有极低含量(＜0.05wt％)的聚电解质沉淀物，并且本发明获得的水凝胶还既可提高玻尿酸水凝胶的保湿润滑皮肤的功能，又能发挥胶原蛋白具有引导组织修复的功能，在医疗美容产品开发上表现出更大的优势，可应用到包括食品、医药、组织工程、化妆品等多个领域。在此基础上，本发明人完成了本发明。

玻尿酸(透明质酸)

透明质酸是一种酸性粘多糖，又称糖醛酸，是由两个双糖单位d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的天然高分子聚合物。它的分子可以携带500倍以上的水分，是皮肤和其他组织中广泛存在的天然生物分子，具有极好的保湿作用，被国际上称为理想的天然保湿因子。透明质酸作用于皮肤表面，大分子透明质酸可在皮肤表面形成一层透气的薄膜，使皮肤光滑湿润，并可阻隔外来细菌、灰尘、紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害；小分子透明质酸能渗入真皮，具有轻微扩张毛细血管、增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收作用，具有较强的祛皱功能，可增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。透明质酸还能促进表皮细胞的增殖和分化、清除氧自由基，可预防和修复皮肤损伤。透明质酸的水溶液具有很高的粘度，可使水相增稠；与油相乳化后的膏体均匀细腻，具有稳定乳化作用。透明质酸是高档化妆品最好的天然保湿成分，它相容性好，几乎可以添加到任何美容化妆品中，广泛用于膏霜、乳液、化妆水、精华素、洗面奶、浴液、洗发扩发剂、摩丝、唇膏等化妆品中。

本发明所述“透明质酸(hyaluronan)”是指存在于自然界中、具有阴离子且未经硫酸化的葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan)，其包含n-乙酰葡萄糖胺(n-acetylglucosamine)、d-葡萄糖醛酸(d-glucuronicacid)及其衍生物的双醣分子重复单元。自然存在的透明质酸(也可称之为玻尿酸)可以利用现有的技术从天然的物质中分离出来，例如链球菌的荚膜、鸡冠、软骨、关节液、脐带、皮肤组织以及眼睛的玻璃体，可参考如guillermolagoetal.carbohydratepolymers62(4):321-326,2005以及ichikaamagaietal.fisheriesscience75(3):805-810,2009等文献。除此之外，透明质酸亦可为市售产品，例如genzymecorporation、lifecorebiomedicalllc以及hyaluroncontractmanufacturing。

天然透明质酸的衍生物包括,但不限于：透明质酸酯(hyaluronanesters)、经己二酸二酰肼修饰的透明质酸(adipicdihydrazide-modifiedhyaluronan)、透明质酸胺产物(hyaluronanamideproducts)、交联透明质酸(cross-linkedhyaluronicacid)、琥珀酸半酯(hemiestersofsuccinicacid)或其重金属盐类的透明质酸、部分或整体的透明质酸酯、硫化透明质酸(sulphatedhyaluronicacid)、n-硫化透明质酸(n-sulphatedhyaluronicacid)、以及经胺基或二胺基修饰的透明质酸。上述物质可通过对一个或多个以上的官能基(例如：羧基、氢氧基、还原端基团、n-乙酰基)进行化学修饰而获得。其中，对羧基进行修饰的方式可通过酯化反应或经过碳二亚胺(carbodiimide)及双酰肼(bishydrazide)等中间物的反应达成；氢氧基的修饰包括，但不限于：硫酸化反应、酯化反应、异脲偶合(isoureacoupling)反应、溴化氰活化(cyanogenbromide)反应、过碘酸盐氧化(periodateoxidation)反应；对还原端基团进行修饰可通过还原胺化反应(reductiveamination)达成,亦可连结磷脂(phospholipid)、染料(例如：荧光基团或发色基团)或一适用于制备亲和性基质的试剂。天然透明质酸的衍生物可通过使用交联剂进行交联反应，或者可通过内酯化(internalesterification)、光交联反应(photocross-linking)或表面电浆处理(surfaceplasmatreatment)。所述交联剂例如：双环氧化物(bisepoxide)、二乙烯基砜(divinylsulfone)、碳二亚胺(biscarbodiimide)、小型同质双功能链接剂(smallhomobifunctionallinker)、甲醒、环己基异氰化物(cyclohexylisocyanide)以及赖氨酸醚酯、金属阳离子、酰肼交联反应或其混合物。

在一优选实施方式中，所述玻尿酸的分子量为30-300万da，较佳地，120-300万da，更佳地，200-280万da。

胶原蛋白

胶原蛋白存在所有多细胞动物体内，是一种生物高分子蛋白质，一般呈白色、不透明的纤维状，是决定结缔组织韧性的主要因素。胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸。胶原蛋白动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。

任何自然产生的胶原蛋白或具有其功能性的胶原蛋白变异体均可被用来制备本发明的水凝胶。目前已经发现至少有28种带有不同遗传讯息的胶原蛋白。胶原蛋白可以从富含胶原蛋白的组织(例如皮肤、肌腱、韧带及人类或动物的骨头)中单独分离或纯化出来。分离及纯化胶原蛋白的方法为本领域技术人员皆知的方法，亦可参见所附的文献：美国第5,512,291号专利、美国第2004/0138695号专利、methodsinenzymology,vol.82,pp.33-64,1982、thepreparationofhighlypurifiedinsolublecollagen,oneson,i.,etal.,am.leatherchemistsassoc.,vol.lxv,pp.440-450,1970以及美国第6,090,996号专利。胶原蛋白也可通过重组技术，如advancedtissuesciences(lajolla,calif.)所述的重组技术制备而成，或市售购得，例如fibergen或southsanfrancisco,calif.。

在一优选实施方式中，所述胶原蛋白选自下组：从动物组织提取的全长活性胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶、或其组合。

复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶

在本发明中，所述复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶含有以下组分：玻尿酸、胶原蛋白。

其中，所述玻尿酸的选择没有特别限制，在一优选实施方式中，所述玻尿酸的分子量为30-300万da，较佳地，120-300万da，更佳地，200-280万da。

所述胶原蛋白的选择没有特别限制，在一优选实施方式中，所述胶原蛋白选自下组：从动物组织提取的全长活性胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶、或其组合。

在本发明中，所述玻尿酸的浓度没有特别限制。一优选实施方式中，所述玻尿酸的浓度为0.05-5wt％，较佳地，0.1-4wt％，更佳地，0.3-3wt％，以所述水凝胶的总重计。

在本发明中，所述胶原蛋白的浓度没有特别限制。在一优选实施方式中，所述胶原蛋白的浓度为0.05-5wt％，较佳地，0.1-4wt％，更佳地，0.2-3wt％，以所述水凝胶的总重计。

在一优选实施方式中，所述水凝胶不含有细胞(如干细胞、皮肤成纤维细胞、表皮细胞等)。

在一优选实施方式中，所述水凝胶不含有交联物质(如，小分子物质(如edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)、mes(2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物)、bdde(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)、氨基酸等)、螯合剂等)。

在一优选实施方式中，所述水凝胶还包括缓冲体系(如碳酸盐缓冲体系、磷酸及磷酸盐缓冲体系、氨基酸缓冲体系、碳酸盐缓冲体系、柠檬酸缓冲体系等)。

在本发明中，所述缓冲体系的浓度没有特别限制。

在一优选实施方式中，所述缓冲体系的浓度为0.01－5m，较佳地，0.03－2m，更佳地，0.05－0.5m。

在本发明中，所述水凝胶中的聚电解质的沉淀含量非常低，为0.01－5wt％，较佳地，0.02－2wt％，更佳地，0.03－0.5wt％。

在本发明中，以所述复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶的总重计，所述玻尿酸和所述胶原蛋白的重量比没有特别限制。在一优选实施方式中，以所述复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶的总重计，所述玻尿酸和所述胶原蛋白的重量比为0.05－3：0.05－2.5，较佳地，0.1－2：0.2－1，更佳地，0.3－1：0.2－0.8。

在一优选实施方式中，本发明的水凝胶用如下方法制备：

将玻尿酸溶解于纯化水中，或者溶解于缓冲体系中，搅拌时期完全溶解，使混合溶液中玻尿酸浓度为0.05wt％-5wt％；

将胶原蛋白原液用水或缓冲体系稀释至浓度为0.05wt％-5wt％；

将上述两种溶液混合反应，调节混合后缓冲体系酸碱度至沉淀消失备用；

其中，玻尿酸分子量为30-200万，胶原蛋白选自从动物组织提取的全长活性胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶。

在本发明中，将玻尿酸、胶原蛋白以一定比例混合，可显著降低所形成的水凝胶中的聚电解质沉淀物，并且本发明通过调节缓冲体系使两种天然大分子复合，所获得的水凝胶还既可提高玻尿酸水凝胶的保湿润滑皮肤的功能，又能发挥胶原蛋白具有引导组织修复的功能，在医疗美容产品开发上表现出更大的优势，可应用到包括食品、医药、组织工程、化妆品等多个领域。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明将玻尿酸和胶原蛋白以一定比例混合，首次发现，所获得的水凝胶中的具有极低含量的聚电解质沉淀物。

(2)本发明应用的胶原分子为动物组织中提取的全长胶原蛋白大分子，具有生物活性、引导修复的作用，应用的玻尿酸为药用级合成原料，通过调节缓冲体系使两种天然大分子复合，即可提高玻尿酸水凝胶的保湿润滑皮肤的功能，又能发挥胶原蛋白具有引导组织修复的功能，在医疗美容产品开发上表现出更大的优势。

(3)本发明获得的水凝胶可在多个领域中应用，包括食品、医药、组织工程、化妆品等领域。

(4)本发明首次通过调节溶液的缓冲体系，从而去除聚电解质沉淀物，并保持溶液均一性，以保证未来溶液用于医疗美容产品开发应用。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

聚电解质沉淀物的含量(wt％)：已过滤获得的聚电解质沉淀物的质量/原混合液总质量×100％。

实施例1

将玻尿酸(5.0g)溶解于纯化水(95.0g)中，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中玻尿酸浓度为5wt％；

玻尿酸分子量为30-300万da；

将胶原蛋白原液用纯化水稀释至浓度2wt％，搅拌均匀；

将上述两种溶液等比例(质量比1:1)混合，加入碳酸盐缓冲体系(0.2m)，均匀搅拌至沉淀消失备用，从而获得本发明的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶，其中，图1显示了两种组分复合后未经碳酸盐缓冲体系调节产生的白色絮状聚电解质沉淀物(肉眼观测)。

如图2所示，所述本发明的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶中，聚电解质沉淀物的含量为＜0.2wt％。

实施例2

将玻尿酸(2.0g)溶解于纯化水(98.0g)中，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中玻尿酸浓度为2wt％；

玻尿酸分子量为30-300万da；

将胶原蛋白原液用纯化水稀释至浓度1wt％，搅拌均匀；

将上述两种溶液等比例(质量比1:1)混合，加入碳酸盐缓冲体系(0.1m)，均匀搅拌至沉淀消失备用，从而获得本发明的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶，其中，图1显示了两种组分复合后未经碳酸盐缓冲体系调节产生的白色絮状聚电解质沉淀物(肉眼观测)。

如图2所示，所述本发明的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶中，聚电解质沉淀物的含量为＜0.1wt％。

实施例3

将玻尿酸(0.5g)溶解于纯化水(99.5g)中，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中玻尿酸浓度为0.5wt％)；

玻尿酸分子量为30-300万da；

将胶原蛋白原液用纯化水稀释至浓度0.5wt％)，搅拌均匀；

将上述两种溶液等比例(质量比1:1)混合，加入碳酸盐缓冲体系(0.05m)，均匀搅拌至沉淀消失备用，从而获得本发明的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶，其中，图1显示了两种组分复合后未经碳酸盐缓冲体系调节产生的白色絮状聚电解质沉淀物(肉眼观测)。

如图2所示，所述本发明的复合玻尿酸胶原蛋白水凝胶中，聚电解质沉淀物的含量为＜0.05wt％。

对比例

将玻尿酸(5.0g)溶解于纯化水(95.0g)中，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中玻尿酸浓度为5wt％；

玻尿酸分子量为30-300万da；

将胶原蛋白原液用纯化水稀释至浓度2wt％，搅拌均匀；

将上述两种溶液等比例(质量比1:1)混合，加入小分子物质(如edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)/nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)mes(2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物)、bdde(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)、氨基酸)，使其终浓度为2wt％，反应温度40℃，反应时间6小时；

得到产物在生理盐水中平衡3小时，得到水凝胶。其中，所述水凝胶中，聚电解质沉淀物的含量为1-2wt％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。