一种由基因组被编辑的CHO宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体及其制备方法与流程

本发明属于生物工程与技术领域，涉及到一种由基因组被编辑的cho宿主细胞用于产生的具有独特糖谱的重组抗体及其该宿主细胞和抗体制备方法。

背景技术：

cho细胞是中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovary，cho)，1957年美国科罗拉多大学dr.theodoret.puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是cho-k1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。atcc保存cho-k1细胞株，编号为ccl-61，被广泛地用于重组dna蛋白的表达。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。cho细胞容易发生基因突变，也较易进行基因转染。早期的研究也证明，与其他工程细胞株比较，用cho细胞产生的抗体与人类血清抗体糖型最为接近，因此cho细胞是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞。

治疗性抗体的作用机制是与靶分子形成复合物，引起靶标抗原中和或者通过抗体fc段的免疫效应清除抗原或者病原体。抗体药物与靶分子的特异性结合和活性作用的发挥依赖其复杂的多级结构和翻译后修饰，而糖基化作为抗体最重要的翻译后修饰，对于抗体的生物活性、体内代谢和免疫原性有着重要的作用。抗体药物的糖基化形式主要为n-糖基化，涉及的单糖主要有：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、岩藻糖、唾液酸(nana、ngna)。根据末端半乳糖数量,抗体分子fc段asn297连接的二分支或多分枝双触角复合型寡糖可分为g0、g1(1，3)、g1(1，6)和g2等多种类型，每一种类型又根据是否具有岩藻糖(f)或者平分型半乳糖(b)分为16种。因此，即使不考虑末端是否存在唾液酸化和高甘露糖型，抗体重链的寡糖类型至少有36种，且随着抗体两条重链的随机组合，可能存在的糖型达400多种，使抗体呈现出高度的异质性。

不同糖型对治疗性抗体的药学性质有不同的影响。高甘露糖糖型(man5)含量，导致抗体在血液中的快速清除，半衰期缩短(mabs，2012，4(4):509－520)。g0f促进补体通路作用，加快清除速率。g2f在孕妇和新生儿脐带中含量增加。唾液酸修饰对静脉注射免疫球蛋白的炎症作用影响明显。岩藻糖的降低导致adcc活性明显增强(jbc(2003)chemistry278,3466-3473)。因此，根据治疗性抗体的主要作用机制和药物用途，设计和优化抗体的糖链是有必要的。

与蛋白合成不同，抗体的糖基化并没有模板可遵循，其糖基化类型和各寡糖组分的比例受到宿主细胞类型及培养条件的影响。通过工程化宿主细胞来改造单克隆抗体的寡糖组分增强其fc介导的效应的方法散见于不同的文献、专利报道。例如用β(1,4)-n-乙酰葡糖胺转移酶iii(gntiii)过表达的cho细胞制备的抗体表现出比亲本细胞中表达的抗体更高的adcc活性，而且活性的差异大约为10到20倍(biotechnolbioeng.(2001)aug20；74(4):288-94)，但gntiii的过度表达对于cho细胞有毒性并且由于是外源表达往往随着培养过程中传代次数增加，gntiii表达量会下降，用此作为宿主细胞产生的抗体的岩藻糖含量会变化，从而影响抗体药物的均一性。产生脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子还包括蛋白质岩藻糖化缺陷的lec13cho细胞(ripkaetal.arch.biochem.biophys.249:533-545(1986),但由于其极低的蛋白产量不适合作为治疗性抗体生产的宿主细胞(yutakakandaetalbiotechnolbioeng.(2006)jul5；94(4):680-8)。α-1-6岩藻糖基转移酶基因fut8敲除的cho细胞(yamane-ohnukietal.(2004),biotech.bioeng.87:614)也导致生产的抗体岩藻糖含量降低。在如yamane-ohnuki和kyowahakko专利所述的fut8敲除细胞系中，公开了一种控制抗体岩藻糖化水平和提高adcc(抗体依赖性细胞毒性)效应的方法，该方法就是用特异的sirna抑制宿主细胞中fut8基因的表达从而降低该宿主细胞所生产抗体的岩藻糖水平，该方法与前述gntiii过度表达的cho细胞系有一样的缺点，首先宿主细胞需要引入外源序列，其次sirna抑制目的基因的效率最多只能到70％左右，最后sirna表达的稳定性可能影响抗体药物的质量属性。

最近，利用新兴的基因组编辑技术对宿主细胞目的基因进行编辑，失活胞内的fut8酶，降低抗体的岩藻糖水平在不同的文献、专利中屡有报道。如malphettesetal(2010)报道了采用锌指酶(zfn)技术敲除亲本细胞dg44，得到fut8基因纯合敲除的dg44衍射生克隆，用该细胞系生产的抗体完全不含岩藻糖。beurdeleyetal(2012)报道了采用talen技术对cho-k1细胞的fut8基因进行编辑，使宿主细胞丧失fut8酶活性；再如sunetal(2015)报道了用crispr/cas9技术对fut8基因的10号外显子编辑，使cho-k1细胞丧失fut8酶活性。利用这些新兴的基因编辑技术对宿主细胞进行改造相比以前的技术有明显的优势。首先，改造后的宿主细胞基因组不含任何外源序列，除被改造的目标基因发生变化外，基因组其他序列不受任何影响。其次，不像sirna或过表达gntiii，由于去岩藻糖效率不高，工程化的宿主细胞生产的抗体仍含有少量岩藻糖，但用基因编辑技术获得目的基因突变的纯合子后，fut8酶活性彻底丧失，生产的抗体不含有岩藻糖。

技术实现要素：

基于此，有必要针对现有抗体药物基本限于fc的单一n-糖基化修饰，但因糖型组分和含量不一致且易变化而影响生产稳定性等问题，提供一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体以及该抗体的制备方法。本发明的上述目的通过以下的技术手段实现：

第一方面，本发明提供一对多肽，具有seq.no.10和seq.no.11所示的氨基酸序列。在一些实施例中，seq.no.10和seq.no.11所示的一对多肽分别为talen的上游和下游的dna结合域的氨基酸序列，其可以特异地与基因的特定碱基区域结合。

第二方面，本发明提供了一对多核苷酸，该一对核苷酸分别编码seq.no.10和seq.no.11所示的一对多肽。在一些实施例中，所述的一对多核苷酸具有seqidno.12和seqidno.13所示的核酸序列。

第三方面，本发明提供了一对融合蛋白，该融合蛋白由上述的一对多肽与转录激活子样效应因子(foki)的dna切割域的氨基酸序列融合而成。在一些实施例中，转录激活子样效应因子(foki)的dna切割域的氨基酸序列为天然的或者经过人工改造的。在一些实施例中，所述的一对融合蛋白具有如seqidno.14和seqidno.16所示氨基酸序列。在一些实施例中，该对融合蛋白可以特异性识别cho的fut8基因的两段核苷酸序列。在一些实施例中，所述的fut8基因的两段核苷酸序列为fut8基因的外显子1(exon1，seqidno.7)上的两段核苷酸序列。在一些实施例中，所述的fut8基因的两段核苷酸序列分别具有seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列。在一些实施例中，seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列之间，有一段space，其具有seqidno.5所示的序列。

第四方面，本发明还提供了一对核苷酸，所述的一对核苷酸分别编码上述的一对融合蛋白。在一些优选的实施例中，所述一对核苷酸具有seqidno.15和seqidno.17所示的核酸序列。

第五方面，本发明还提供了上述任意一对多核苷酸中的至少任意一条多核苷酸的载体。在一些实施例中，所述的载体为质粒。

第六方面，本发明还提供了一种利用上述载体转化的宿主细胞。

在其中一些实施例中，这些被上述载体转化细胞为基因组被编辑的cho宿主细胞，其亲本细胞来源于cho-k1细胞系。

在其中一些实施例中，所述一种基因组被编辑的cho宿主细胞，其亲本细胞适应无血清悬浮培养；所述亲本细胞命名为cho-bat。

在其中一些实施例中，所述一种基因组被编辑的cho宿主细胞，其亲本细胞cho-bat是满足如下一项或者多项特征而选择的cho-k1的亚克隆：

所述细胞具有高转染效率；

所述细胞具有短对倍生长时间；

所述细胞具有在cd-cho培养中达到高细胞密度的能力。

在其中一些实施例中，所述一种基因组被编辑的cho宿主细胞，其特征在于：所述细胞相对于亲本细胞由于fut8基因的某些区域存在碱基缺失、插入、无义突变导致该细胞内源性α1,6—fucosyltransferase(fut8)失去酶活性；

所述细胞不含有外源dna序列；

所述细胞作为宿主细胞表达的重组抗体具有独特的糖谱特征。

在其中一些实施例中，所述一种基因组被编辑的cho宿主细胞，其特征在于：所述细胞fut8基因的外显子1的基因组被编辑，导致该细胞内源性fut8失去酶活性；所述细胞不包含使fut8基因产生碱基缺失、无意突变的过程中引入的表达载体的dna序列；

所述细胞作为宿主细胞表达的重组抗体具有独特的糖谱特征，其特征主要包括具有非岩藻糖基化n-连接寡糖链，同时包括抗体的其它糖谱特征。

在其中一些实施例中，所述一种基因组被编辑的cho宿主细胞，其fut8基因被敲除；所述细胞与凝集素lca结合呈阴性；所述细胞命名为cho-bat-kf。

第七方面，本发明提供了一种试剂盒，其含有上述的一对多肽中的至少任意一条；或者含有上述一对多核苷酸中的至少任意一条；或者含有一对融合蛋白中的至少任意一个；或者含有上述的载体；或者含有上述的宿主细胞。

第八方面，本发明提供了上述的一对多肽/一对多核苷酸/一对融合蛋白/载体在对cho细胞的fut8基因编辑的应用。

第九方面，本发明提供了上述的一对多肽/一对多核苷酸/一对融合蛋白/载体/宿主细胞在在生产抗体，尤其是具有独特糖谱的抗体中的应用，或者利用上述的一对多肽/一对多核苷酸/一对融合蛋白/载体/宿主细胞生产的抗体。

第十方面，本发明提供了一种cho的fut8基因编辑的方法，其包含以下步骤：将上述一对融合蛋白或者一对多核苷酸或者载体转入cho细胞，于37℃条件下培养14天，经加压筛选、有限稀释得到fut8基因被敲除的cho细胞，具体方法参照woodetal.,jimmunol.145:3011(1990)。

第十一方面，本发明提供了由基因组被编辑的cho宿主细胞产生具有独特糖谱的重组抗体的制备方法或由该方法产生的抗体，其包含以下步骤：

(1)将上述的一对融合蛋白或者一对多核苷酸或者载体转染野生型cho细胞，经加压筛选、有限稀释得到fut8基因被敲除的cho细胞；

(2)将编码抗体基因表达盒的质粒电转染fut8基因被敲除的cho细胞，加压筛选、有限稀释得到分泌抗体的稳定cho细胞株；

作为优选的实施方式，步骤(1)中将载体转染野生型cho细胞；更优选地，将质粒稳定转染野生型cho细胞；

作为优选的实施方式，所述的cho细胞为cho-k1；更优选地，所述的cho-k1适应无血清培养。

作为优选的实施方式，所述的抗体为抗cd20；更优选地，所述的抗体为人源化或者全人源抗抗cd20抗体；更优选地，所述的抗体为bat4306f；更优选地，所述的抗体bat4306f具有两条seqidno.20所示的轻链和两条seqidno.21所示的重链；但不限制与抗cd20载体。发明人采用了本发明的方法、细胞、多肽等用于制备多种类型的抗体，经研究发现，制备出的不同类型的抗体均表现出高度一致的糖型，且糖型异质化程度。表明本发明方法、细胞等适用于所有类型的抗体的制备。在一个实施方案中，所述抗体结合cd20。在一个实施方案中，cd20结合抗体是人源化抗体。在优选的实施方案中，所达人源化抗体bat4306f是来自专利wo2005044859里b-ly1抗体序列的重链可变区b-hh6氨基酸序列和轻链可变区b-kv1氨基酸序列。bat4306f抗体包含以下序列的一对轻链和重链:seqidno.20和seqidno.21。在一个实施方案中，cd20结合抗体是全人源化抗体bat4406f，其包含以下序列的一对轻链和重链seqidno.22和seqidno.23。在一个实施例方案中，所述的抗体是bat1206，bat1206抗体具有两条seqidno.18所示的轻链和两条seqidno.19所示的重链。在一个实施例方案中，所述的抗体是bat0206，bat0206结合egfr，抗体具有两条seqidno.24所示的轻链和两条seqidno.25所示的重链。在一个实施方案中，所述的抗体是bat0806，其结合trop2，bat0806具体两条seqidno.26所示的轻链和两条seqidno.27所示的重链。在一些实施方案中，所述经修饰的糖蛋白由宿主细胞分泌。在一些实施方案中，所述经修饰的糖蛋白为抗体。

作为一个示范性的具体的实施方式，本发明的由基因组被编辑的cho宿主细胞产生具有独特糖谱的重组抗体的制备方法或由该方法产生的抗体具体的步骤为：

将上述的一对融合蛋白或者一对多核苷酸或者载体转入野生型cho细胞，转染后细胞加入含植物凝集素(lca)的cdcho(sigma)+10％fbs(胎牛血清)进行加压筛选、14天后将存活细胞按0.5个细胞/孔接种96孔细胞培养板，血清浓度降到5％，7天后将细胞转入24孔细胞培养板，放回co2培养箱，7天后取部分细胞，1000rpm,5min离心，pbs换液一次，取2μl荧光素标记的lca与细胞混合，冰上孵育30min，pbs洗一次，在流式细胞仪(bd，c6)上读取荧光，用未经转染的野生型cho细胞作为阴性对照，阳性细胞转到6孔细胞培养板，血清浓度降为1％，7天后将细胞转到小摇瓶，培养基无血清的cdcho，完成驯化过程。取部分细胞用质粒提取试剂盒(omega)提取cho基因组，以基因组为模板，用引物l130for(seqno.1)、l130rev(seqno.2)、taq酶进行聚合酶链式反应(pcr)，pcr产物与t载体(promega)连接转化涂板，次日，挑取单菌落用t7引物测序，用dnastar分析软件分析序列，与野生型cho基因组序列相比，出现碱基缺失的cho细胞扩大培养，命名为cho-bat-kf，将处在对数生长期的cho-bat-kf建立细胞库，用含7.5％dmso的cdcho冻存液冻存细胞，转入液氮罐长期保存；取编码抗体基因的质粒线性化，测定od260，取50μg质粒与107cho-bat-kf在电转杯混匀，用电转仪(biorad)转染，铺96孔细胞培养板，48h后加入蛋氨酸亚氨基代砜(methioninesulfoximine,msx)，14天后用抗fc多抗包elisa板，3％bsa封闭后，取上清加入板中37℃孵育2h，pbst洗涤5次，加入抗辣根过氧化物酶标记羊抗人kappa/lambda轻链，2mh2so4，在酶标仪上读取od450值。滴度高者克隆扩大培养，离心收集细胞上清，得到敲除岩藻糖的抗体蛋白。

本发明同时提供了一种细胞，其为基因组被编辑的cho宿主细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：c2017127，保藏日2017.8.10，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学；分类命名为：中国仓鼠卵巢细胞cho-bat-kffut8(-/-)。

第十二方面，本发明提供一种抗体，该抗体由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体，所述抗体为人源化或者全人源抗体，其具有独特的糖基化方式，n-糖基化异质性程度低，且adcc效应显著增加。

在其中一些实施例中，所述一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体，是结合细胞膜表面cd20的人源化抗体。

在其中一些实施例中，所述一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体，具有独特的糖基化方式，所述糖基化方式的特征在于，所述抗体n-连接的多糖中的一个或多个糖部分的水平发生改变，其中所述糖部分选自由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺，具有独特的糖基化方式，所述糖基化方式的特征满足如下优选条件中的一种或者多种：

所述抗体岩藻糖含量很低；(0-5％)

所述抗体半乳糖水平较低；(≤5％)

所述抗体甘露糖水平较低；(≤5％)

所述抗体葡萄糖g0水平较高。(>80％)

在其中一些实施例中，所述一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体，满足优选条件：岩藻糖含量为0。

在其中一些实施例中，所述一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体，所述抗体n-多糖异质程度极低，有均一的糖链。

在其中一些实施例中，所述一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体，其fc的adcc效应较强。

在其中的一些实施例中，所述的抗体具有如说明书附图10中上方的bat4306f所示的糖谱。

在其中的一些实施例中，所述bat4306f具有两条seqidno.22所示的轻链和两条seqidno.23所示的重链；但也不排除该序列发生了突变，只要这些突变并不影响该抗体的作用。

与现有抗体药物相比，本发明具有以下优势：

目前，上市的抗体药物基本限于fc的单一n-糖基化修饰，但因其糖型组分和含量不一致且易变化，仍有一定复杂性，尤其给生产稳定性带来了挑战。本发明提供的一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体，一方面n-糖基化异质性程度低，糖链均一性好；同时adcc效应增强，极大地改善了抗体药物的质量属性和药学特性。

与对应的由未修饰的cho-k1(atcc#ccl-61)或悬浮适应的亲本细胞cho-bat产生的抗体相比，所述抗体对fcγriiia受体的结合亲和性增加。

所述经修饰的宿主细胞产生抗体，与由对应的未修饰的宿主细胞产生的对应的抗体相比，该抗体与fcγriiia亲和力增强。

附图说明

图1显示的是贴壁生长的cho-k1(atcc#ccl-61)和适应在无血清培养基悬浮生长的细胞株cho-bat。

图2talen表达质粒pcs2-fok1的图谱。

图3tlen蛋白的功能验证，电泳图左边为野生型，基因编辑后细胞基因组pcr产物显示为500bp及750bp两条带，而野生型只有750bp单一条带，符合预期结果，证明talen蛋白对是有功能的；其中，lane1:100bpmarker；lane2:wt；lane3:pool。

图4facs分析了24孔板生长的细胞，基因被编辑的细胞克隆fitc标记的lca结合呈阴性的细胞，野生型细胞fitc标记的lca结合呈阳性结合。

图5用糖链芯片分析显示，送检的被基因编辑的41，43号克隆岩藻糖含量降低到0-10％，野生型抗体1206的岩藻糖含量为80％。

图6talen蛋白的靶向序列通过pcr扩增之后测序，结果用lasergenemegalign序列分析软件比对。

图7cho-bat-kf与亲本细胞cho-bat生长密度的比较。

图8cho-bat-kf与亲本细胞cho-bat生长活力的比较。

图9采用maldi-tofms质谱仪对bat4306f和4306抗体分子的n-多糖进行maldi-tofms分析，每个来自于bat4306f的n-多糖都比来自于4306的n-多糖少了1个岩藻糖，左图是亲本细胞生产的抗体分子4306，右面图是bat4306f抗体分子

图10.bat4306f比gazyva(obinutuzumab)有更低的岩藻糖含量，糖链的异质性程度更低，产品的均一性更好。

图11用raji作为靶细胞，pbmc作为效应细胞，比较了bat4306野生型，糖链修饰的bat4306f，obinutuzumab，rituximab等抗cd20抗体的adcc效应。

图12比较了糖链修饰的bat4306f，obinutuzumab,，rituximab三种抗体，在50，25，10ng/ml浓度下清除体外全血中b细胞的能力。

图13比较了用cho-bat-kf细胞生产的抗cd20抗体bat4306f、bat4406f，抗egfr的抗体bat0206，抗trop的抗体bat0806的糖谱。

本发明基因组被编辑的cho宿主细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：c2017127，保藏日2017.8.10，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学；分类命名为：中国仓鼠卵巢细胞cho-bat-kffut8(-/-)。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

需要说明的是，本发明中抗体名称中携带“f”表示敲除fut8基因的cho产生的抗体，如bat4306f为敲除fut8基因的cho产生的抗体，bat4306则为没有敲除fut8基因的cho产生的抗体，二者具有相同的氨基酸序列，其他抗体情况相同。

实施例1适应无血清悬浮培养的亲本细胞的筛选

用含10％fbs的dmem/f12培养基培养的cho-k1，当细胞汇合度达到80％-90％时，用pbs洗涤，胰酶消化，5％fbs的dmem/f12培养基终止，计数并离心。用含5％fbs的dmem/f12培养基重悬细胞，以1×10⁵个细胞/毫升的密度接种细胞。当细胞的汇合度达到80％-90％，用pbs洗涤，胰酶消化，2％fbs的培养基dmem/f12终止，计数并离心。用含2％fbs的培养基dmem/f12重悬细胞，以1×10⁵个细胞/毫升的密度接种细胞。待上述细胞汇合度达到80％-90％，按照之前步骤把上述细胞胰酶消化，用含1％fbs的dmem/f12培养基终止，传代3-4代。cdcho培养基与dmem/f12按1：1(v/v)的比例进行混合，终浓度调整为6mm谷氨酰胺，血清含量调整为1％。把上述获得的低血清适应了的cho-k1细胞以3×10⁵cells/ml密度接种到t25方瓶，在37℃、5％co2培养箱进行培养。当细胞汇合度80-90％，胰酶消化，用含1％fbs的dmem/f12与cdcho培养基混合培养基(体积比为1:2)终止，计数并离心，以3×105cells/ml密度接种到t25方瓶，在37℃、5％co2培养箱进行培养。逐步降低混合液培养基中dmem/f12比例至(1:8)，当细胞存活率大于90％，此时可将细胞培养基中的dmem/f12成分完全剔除，建立起了适应化学成分限定的cdcho培养基包含1％血清培养的cho-k1细胞。用含1％fbs的化学成分限定的cdcho培养基培养的cho-k1，当细胞汇合度达到80％-90％时，用pbs洗涤，胰酶消化，用含0.5％fbs的cdcho培养基终止，计数并离心。用含0.5％fbs的cdcho培养基重悬细胞，以1×105个细胞/毫升的密度接种于t25方瓶，当细胞的活力达到80％-90％，用pbs洗涤，胰酶消化，0.25％fbs的cdcho培养基终止，计数并离心。用含0.25％fbs的cdcho培养基重悬细胞，以1×105个细胞/毫升的密度接种细胞。直到细胞在该阶段生长健康才开始下一阶段降低血清浓度。把适应了无血清的cdcho培养的cho-k1细胞，进行有限稀释，接种到30个96孔板，调整细胞密度到1个细胞/孔。2周后镜检观察，标记出长出单克隆的细胞。把细胞面积较大的克隆转到24孔板，1周后镜检观察，标记出生长密度较高，细胞大小一致的细胞克隆转到6孔板继续培养，1周后镜检观察，标记完全悬浮，结团不严重的，细胞密度较大的克隆转到100ml三角瓶，培养体积10ml。记录每株细胞的细胞密度，活力。把经过驯化适应无血清培养的cho-k1细胞重新命名为cho-bat。

实施例2fut8talen重组质粒构建

分析中国仓鼠卵巢癌细胞cho-k1的基因组全序列(nw-003613860)，由此得到fut8基因组序列(geneid:100751648)和它的cdna(见表1，seqno.8)序列，fut8基因组由9个外显子及11个内含子组成，因为fut8酶活性中心是由外显子1(seqno.7)所编码的氨基酸(seqno.9下划线氨基酸序列)组成，设计fut8基因外显子1左右两翼作为talen的靶向序列。根据talen设计指导原则及编辑基因作用机制，设计了fut8talen蛋白l130p(seqno.10)，r184p(seqno.11)。l130p与foki内切酶形成融合蛋白l130-foki(seqno.14)，此融合蛋白识别外显子1左翼碱基l130ptn(seqno.3)，融合蛋白l130-foki相应的核酸序列l130-fokin见seqno.15，长度是19bp。r184p与foki内切酶形成融合蛋白r184p-foki(seqno.16)，此融合蛋白识别外显子1右翼碱基r184ptn(seqno.4)，融合蛋白r184p-foki相应的核酸序列r184p-fokin见seqno.17，长度是17bp。含有编码针对外显子1左翼l130ptn和右翼r184ptn的talen蛋白的质粒载体(见图2)构建如tomascermaketal.(2011)所述。在l130-fokin、r184p-fokin两端加入限制性核酸内切酶ncoi和xbai酶切位点，合成这两段序列，采用ncoi和xbai克隆进pcs2-peas-t载体(图2)。左翼结合序列和右翼结合序列中间有个19bp长度的间隔序列(space，seqno.5)。fut8talen的两个质粒l130n和r184n的dna测序结果见表1，seqno.12、seqno.13，l130n、r184n核酸序列翻译成氨基酸，相应序列氨基酸序列l130p、r184p见表1，seqno.10、seqno.11。

表1序列表

实施例3fut8talen蛋白的功能有效性分析

cel-i酶是一种核酸酶，它能识别双链dna中错配的碱基并从错配处剪断双链dna。如果靶向序列被fut8talen编辑了，那么把从母本基因组扩增出的包含靶向序列的区域与从被转化的细胞的基因组扩增的包含靶向序列的区域混合在一起变性、退火后，退火的双链dna存在碱基错配，这样cel-i酶能把退火后的双链dna切断，表现为琼脂糖电泳结果为两条带。取5×10⁵个cho-bat细胞于转染前一天接种于6孔板，培养基为含10％胎牛血清的dmem/f12。质粒l130n和r184n被按试剂说明提供的方法瞬时转染进入细胞。转染3天后，离心收获细胞，用基因组抽提试剂盒提取基因组。以此为模板，用引物l130for(seqno.1)和引物l130rev(seqno.2)进行pcr反应。亲本细胞包含靶向序列的区域的pcr扩增同上。两个pcr产物各取20μl混合在一起，加热到94℃然后自然冷却至室温。向200ng退火的dna加入0.5μlcel-i酶42℃孵育30分钟，pcr反应产物跑琼脂糖凝胶电泳。该反应产物用琼脂糖电泳分析，结果见图3。

结果表明：与野生型相比，基因编辑pcr产物能看到500bp及750bp两条带，而野生型只有750bp单一条带，符合预期结果，证明talen蛋白对是有功能的。

实施例4fut8talen蛋白对抗体岩藻糖含量的影响

为了确定设计的fut8talen蛋白对宿主基因组的调整是否影响到生产的抗体的糖链(岩藻糖含量是否变化)。l130n和r184n质粒瞬时转化到先前已经建立的稳定表达抗cd20抗体的细胞系。方法参考lipofectamine2000(invitrogen)试剂说明提供的方法，简单描述如下；在10cm的细胞培养皿内，向1×10⁶细胞加入24μl包装有l130n和r184n各4μg质粒dna的脂质体。转染两天后，更换为包含有10％(v/v)fbs(gbico)和400μg/mllca(vector)的dmem/f12培养基。1周后，大部分细胞变圆并悬浮于培养基，另一些细胞正常贴壁生长。弃去上清，用胰酶0.25％(v/v)消化lca抗性的细胞，离心后重悬于含10％(v/v)fbs的dmem/f12培养基。以每孔0.5个的密度接种于96孔板。生长2周后，单克隆的细胞被挑选转入24孔板。facs分析了24孔板生长的细胞，fitc标记的lca结合呈阴性的细胞(图4)被扩大培养生产抗体。两种细胞生产的抗体的寡糖含量由北京爱德诺生物公司测定，结果如图5所示。

结果表明：瞬时转化l130和r184质粒到抗体生产细胞降低了抗体岩藻糖含量。

实施例5基因组被调整的宿主细胞的建立

为了建立一个基因组调整了的cho-k1细胞，以便用它作为宿主细胞生产的蛋白、抗体无岩藻糖，l130和r184质粒瞬时转化到cho-k1的细胞系。抗lca的单克隆细胞的筛选同实施例3所述，候选的细胞克隆的基因组分别被提取，用引物l130for(见表1，seqno.1)和引物l130rev(见表1，seqno.2)进行pcr反应，对候选的细胞克隆包含靶向序列的区域的pcr扩增产物进行cel-1碱基错配分析。如果候选克隆是杂合子，那么cel-1酶切后是琼脂糖电泳是两条带，如果是纯合子，那么cel-1酶切该退火片段切不动，琼脂糖电泳是一条带。该pcr片段直接克隆至t载体(pgem-teasyvector)然后测序。测序结果与亲本细胞该区域的片段序列对比如图6，根据比对结果，挑选两个基因组被编辑的纯合子，记为cho-2g8,cho-1d6。

实施例6宿主细胞生长特性评价

选定fut8基因被敲除的克隆cho-2g8为宿主细胞，重新命名为cho-bat-kf。分别取30ml含终浓度为6mmgln的cdchoagt^tm，接种细胞密度为30万/ml的3株cho-bat-kf与1株cho-bat于125ml小摇瓶，在d0、d3、d6、d7分别取0.5ml细胞计数，测定细胞密度及细胞活率，评价敲除fut8基因后细胞生长特性变化情况。细胞生长密度如图7，细胞生长活力如图8，由图7和图8可知，被敲除fut8基因的cho-bat-kf与没有敲除fut8基因的cho-bat细胞生长密度和活性没有显著的差别。

实施例7宿主细胞生产抗体的糖基化谱图分析

为了确定用本发明所述的基因组调整了cho-2g8细胞系生产的抗体的糖链具有变异了的n-多糖的修质a亲和柱从培养基纯化cho-2g8细胞所产生的bat4306f和cho-k1细胞所产生的4306，并通过紫外uv280进行定量。脱盐的单克隆抗体(1毫克)与pngasef在37℃孵育过夜，让n-聚糖从抗体中释放。被释放的n-聚糖通过30k的amicon超滤与抗体分离，流穿液冷冻干燥并重悬于200μl去离子水。采用maldi-tofms质谱仪对如前所述来自两个抗体分子的n-多糖进行maldi-tofms分析。来自cho-2g8所产生的抗体bat4306f的寡糖以单峰存在，并且基本上同种群，该群与由母本宿主细胞产生的抗体4306寡糖的谱图不同(图9)。

结果表明：4306的n-多糖的三个峰分别是g0f、g1f、g2f。基于bat4306f的n-多糖的出峰时间和分子量，推断n-多糖的3个峰分别是g0、g1、g2，即每个来自于bat4306f的n-多糖都比来自于4306的n-多糖少了1个岩藻糖。

同时，对市售的gazyva与bat4306f的糖链进行对比，分析其糖链的异质性程度，如图10所示。结果说明：bat4306f的n-多糖异质程度更低，有更均一的糖链。

实施例8宿主细胞生产抗体的adcc活性分析

为了确定具有本发明n-多糖的抗体的修饰是否能够提高其生物功能(如adcc活性)，使用靶向cd20的经纯化的抗体以测定它们在体外的adcc活性(ldh法promega)。抗体通过蛋白质a亲和柱从培养基纯化cho-2g8细胞所产生的bat4306f，并通过紫外uv280进行定量。母本未修饰的4306在野生型cho细胞中表达，并以同样方式纯化。为了进行adcc检测，用含10％fbs的rpmi-1640培养液培养wil2-s细胞状态良好(4-7天)。取对数生长期的细胞，1000转离心10分钟弃上清。加入a液(含10％fbs的无酚红的rpmi-1640培养液)混匀，同上离心洗两次，计数，用a液调整细胞为3×10⁵个/ml，加入u-96孔细胞培养板中，每孔100μl。调节抗体的终浓度孔依次为1.2、0.24、0.048、0.0096、0.00192、0.000384、0.0000768、0.00001536(μg/ml)。置于37℃、5％co2培养箱孵育30min。收集效应细胞pbmc，加入b液(不含血清的无酚红的rpmi-1640培养液)同上离心洗两次，计数，用b液调整细胞为3×10⁵个/ml，混匀加入上述u-96孔细胞培养板，每孔50ul。置于37℃、5％co2培养箱孵育3小时。离3h的孵育时间还有45min时，在靶细胞最大释放孔中加入20μl裂解液，继续置于37℃、5％co2培养箱孵育45min。将u-96孔细胞培养板置于离心机中，250g离心4min。取50μl/孔上清至另一平底96孔板中，加入已经配好的显色底液50μl/孔，轻轻震荡混匀，于室温避光反应30min。加入终止液50μl/孔，轻轻震荡混匀。在酶标仪od490处读取结果。

结果表明：与母本cho细胞产生的未修饰的4306相比，具有在无血清培养基中cho-2g8细胞克隆所产生的n-多糖的bat4306f对raji细胞和wil2-s细胞的adcc活性显著提高(图11)。

实施例9宿主细胞生产抗体对cd20的亲和力分析

为了确定如本发明所述细胞产生的n-多糖经过修饰的抗体是否对结合cd20阳性的细胞的能力有影响，参考klervieven-desrumeauxetal(2012)方法，通过fasc方法检定了bat4306f、4306，对照rituximab对不同细胞表面cd20的亲和力。简单描述如下：收集对数生长期细胞wil2-s，离心800rpm/min，5min，弃上清。用pbs洗一遍，计算密度，用pbs重悬，分装到1.5ml离心管中，使每管50万细胞。离心，1200rpm/min，5min，弃上清。配置抗体浓度分别为30、3.33、1.11、0.37、0.1、0.04、0.014、0.0046μg/ml，依次加入200ul抗体到上述细胞中，重悬细胞并混匀。同时加相同体积的pbs作为阴性对照。4℃，避光放置2h。离心，1200rpm/min，5min，弃上清，用pbs洗一遍。加入100μlpbs重悬细胞，加入2μlfitc-羊抗人igg1fab的二抗，4℃，避光放置30min。离心，1200rpm/min，5min，弃上清，用pbs洗一遍。上流式细胞仪c6检测。结果计算公式：kd＝[ab]*{fmax/(f-fback)-1}，结果如下表所示。

表2抗体对细胞结合实验的ic50值及kd值结果统计

结果表明：n-多糖经过修饰的抗体是没有影响抗体结合cd20的亲和力。

实施例10体外评价bat4306f在不同nhl病人全血中清除b细胞的能力

尽管抗cd20抗体在b淋巴瘤患者体内的作用机制有adcc、cdc、直接诱导的b细胞凋亡等多种机制，但一个抗cd20抗体的效果如何，最终反映在这个抗体清除患者体内的b细胞能力，而不是单单在于提高了某一种作用机制。为了确定具有本发明n-多糖的抗体的修饰是否能够提高其清除b细胞的能力，体外评价了bat4306f在不同nhl病人全血中清除b细胞的生物功能。简单描述如下：用肝素钠抗凝管取新诊断为nhl病人的血3ml左右。室温静止保存，待实验人员来取。分别取待测血样90μl分装到新的facs管，向各管样品中加入10μl不同浓度的bat4306f抗体稀释液，使抗体在各管待测样品中的终浓度为10nm、1nm、0.1nm、0.01nm、0.001nm。37℃培养箱静止放置3-4小时，然后从各管取50ul血样加入bdtrucounttubes，向血样中加入bd的b细胞计数抗体混合物(抗cd45(lymphocytepopulation),抗cd3(tcells),和抗cd19(bcells))。室温下暗处静放15min,加入bdfacs裂解液，然后上机测量(bdc6)，结果如图12所示。

结果表明：在被测试的三个浓度水平中，bat4306f抗体清除b细胞的能力都强n-多糖未经修饰的抗体rituximab。

实施例11bat4306f与fcγriiia分子的亲和力增强

为了验证基因组被编辑的cho-bat-kf细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体与fcγriiia亲和力变增强，分别测定了bat4306f、市售gazyva和rituximab与fcγriiia的亲和力。传感器置pbs中预湿10min。将生物素标记的fcγriiia158v，fcγriiia158f用ab稀释至2.5μg/ml；loading：生物素标记的fcγriiia158v稀释液中loading10min(至信号约1.3nm)；3.6.3与fcγriiia158v亲和力检测将待测药物bat4306f、obinutuzumab用ab稀释至500nm，rituximab用ab稀释至3000nm，之后用同样缓冲液做2倍梯度稀释7个点。将ab、fcγriiav158、再生缓冲液、药物稀释液、中和缓冲液依次加入96孔板相应相应列中，sa传感器运行如下步骤：baseline：ab中检测基线，150s；association：在梯度浓度的药物稀释液样品及空白(ab)，结合90s,dissociation：在ab中解离120s；regeneration：在ph10.5naoh中再生5s；neutralization：ab中和5s。再生、中和循环进行3次。采集数据后，用仪器的数据分析软件acquisition8.2对数据进行分析，以baseline采集所得信号为基线、扣减参比信号(进行样品空白和传感器空白双扣除)，对所得数据进行群组分析并进行拟合。

表3bat4306f与对fcγriiia158f的亲和力结果统计

结果表明：在被测试的三个抗体中，cho-bat-kf细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体与fcγriiia亲和力最强。

实施例13

为了验证其他抗体序列在所述cho-bat-kf宿主细胞表达生产的抗体的糖谱是稳定的，一致的，我们在cho-bat-kf细胞分别表达了另外几种抗体，一种是具有两条seqidno.22所示的轻链和两条seqidno.23所示的重链的bat4406f抗体，一种是具有两条seqidno.24所示的轻链和两条seqidno.25所示的重链的抗egfr抗体bat0206，一种是具有两条seqidno.26所示的轻链和两条seqidno.27所示的重链的抗trop2抗体bat0806抗体。具体实验参照产品说明书进行(ludgertagtmproc(procainamide)glycanlabelingkit)，对样品进行变性还原后利用糖苷酶把样品的糖链从糖基化位点切除，经过普鲁卡因酰胺盐酸盐荧光素偶联标记后，然后上hilic色谱柱进行分离，用流动相a为ph4.5的100mm的甲酸铵和流动相b为乙腈进行洗脱分离，洗脱梯度为0-36分钟从28％a-38％a，用荧光检测器进行检测。系统适应性溶液中，糖型g1与g1’的分离度不得低于1.0。结果如图13显示，4种抗体的糖型高度一致，糖链的均一性良好。表明本发明的方法或者细胞具有普遍适用性，不仅适用于生产抗cd20抗体，可以用于生产其他作用位点的抗体，使目标抗体具有均一性和增强的adcc活性。

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<110>百奥泰生物科技(广州)有限公司

<120>一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体及其制备方法

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