一种蝶啶叶酸的制备方法及其应用与流程

本发明属于有机合成领域，具体涉及一种蝶啶叶酸的制备方法及其在叶酸质量控制中的应用。

背景技术：

蝶啶叶酸(6-pterinylfolicacid)

英文名：n,n-bis-[4-[(2-amido-4-oxo-1,4-dihydro-6-terene)methylamino]]benzoyl-l-glutamicacid

中文名：n,n-二-(4-((2-氨基-4-羟基-6-蝶啶基)甲基氨基))苯甲酰-l-谷氨酸

蝶啶叶酸，即为ep药典叶酸杂质e。

叶酸(folicacid)也叫维生素b9，是一种水溶性维生素，是米切尔(h.k.mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化的，故而命名至叶酸。有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，对孕妇尤其重要。

叶酸的摄入不足可引起多种相应的缺乏症，如新生儿畸形、巨红细胞贫血、心血管疾病、老年痴呆症、寄生虫病、坏血症和类风湿性关节炎等。叶酸和叶酸的相关制品已经广泛应用于食品、药品、饲料、科研和化工业。

叶酸成品在进入欧盟市场的时候，应符合欧洲药典ep的质量要求，即叶酸成品中杂质蝶啶叶酸的含量≤0.5％。在叶酸质量研究中，需得到纯度大于95％的蝶啶叶酸对照品，用于叶酸成品中杂质定性及定量研究。目前蝶啶叶酸的制备方法尚未见报道，而蝶啶叶酸的标准品也无法购到。

现有技术中对叶酸杂质的研究仅限于采用控制蝶酸含量等纯化的方法，如cn102432610b以及cn104098569a等中国专利文献的记载。但是这些方法都仅仅是从怎么去除蝶酸杂质的角度，并没有深入研究叶酸成品中其它杂质如蝶啶叶酸的产生机理及控制方法。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种蝶啶叶酸的制备方法及其应用，以n-(4-对氨基苯甲酰)-l-谷氨酸(本发明中也称至对氨基苯甲酰谷氨酸)、2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐(本发明中也称至三氨基嘧啶硫酸盐)、1,1,3-三氯丙酮(本发明中也称至三氯丙酮)至原料，经化学合成的方法，显著提升杂质的含量，再经制备色谱法分离，得到纯度大于95％的蝶啶叶酸。本发明的研究有利于进一步研究蝶啶叶酸的产生机理及控制方法，有效提高叶酸质量控制水平。

蝶啶叶酸反应方程式如下：

在本发明的优选的实施方式中，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)蝶啶叶酸粗品的合成

将对氨基苯甲酰谷氨酸、三氨基嘧啶硫酸盐、三氯丙酮溶于水中，其中基于质量比计，对氨基苯甲酰谷氨酸：三氨基嘧啶硫酸盐：三氯丙酮：水＝1：2～4：3～5：100～150，控制反应液ph至0.5～3，加热至50～100℃，保温1～10小时，降温至10～40℃，过滤，滤液调节ph至2～5，过滤，得到粗品，纯度15～30％；

(2)蝶啶叶酸的提纯

粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯化水稀释1～5倍后，再进半制备色谱，用质量分数5～20％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得蝶啶叶酸，所述的蝶啶叶酸的纯度至95～98％。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(1)中采用naoh或hcl控制反应液ph以及调节ph值。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(1)中，基于质量比计，对氨基苯甲酰谷氨酸：三氨基嘧啶硫酸盐：三氯丙酮：水＝1：2：3：100。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(1)中，控制反应液ph至1～2，加热至80～100℃，保温5～8小时，降温至20～40℃，过滤，滤液调节ph至3～5。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(2)中，采用北京创新通恒的lc3000高效液相色谱仪进行制备，柱子型号c1810μm100a。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(2)中，半制备流动相配制方法至三水合磷酸氢二钾55g，磷酸氢二钾75g，用8000ml纯化水溶解，另加900ml无水甲醇。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(2)中，半制备检测器波长至280nm，流速为20ml/min，进样量每次10ml。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(2)中，所述浓缩为真空浓缩，优选浓缩温度45℃、真空度≤-0.09mpa、时间12小时。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(2)中，所述浓缩液用纯化水稀释1～4倍后，甲醇的质量分数为10～20％。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(2)中，所述浓缩液用纯化水优选稀释2倍。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(2)中，所述浓缩液用纯化水优选稀释2倍后，再进半制备色谱，用质量分数5～20％甲醇洗出，收集流出液。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(2)中，所述浓缩液用纯化水优选稀释2倍后，再进半制备色谱，优选用质量分数为10％的甲醇洗出，收集。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(2)中，所述干燥为冷冻干燥。

在本发明的优选的实施方式中，步骤(2)中，所述冷冻干燥为温度≤-30℃、真空度≤-10pa。

经检测，步骤(2)中，所述蝶啶叶酸杂质，按照欧洲药典叶酸液相分析方法，叶酸保留时间约8.5min，蝶啶叶酸保留时间约为叶酸的1.24倍，与药典中杂质e的相对保留时间(约1.27)一致。

本发明还保护上述方法制备得到的蝶啶叶酸在叶酸质量控制中的运用。

与现有技术相比，本发明采用全新的角度，即从制备高纯度蝶啶叶酸的角度去研究其产生机理及控制方法，所制备得到的蝶啶叶酸具有高达95％～98％的纯度，适用于对蝶啶叶酸的性质和产生机理进行深入的研究过程，为有效提高叶酸质量控制水平奠定了坚实的基础。

另一方面，本发明在制备蝶啶叶酸的过程中，对合成步骤与提纯步骤进行了系统的优化，两者有机结合，并通过制备过程参数以及提纯过程操作参数的密切配合，实现了产物的高收率和高纯度。本发明针对提纯过程的设计细致入微，由于色谱分离是很精密的提纯方法，具体的操作有所偏差都会很大程度地影响产物的纯度，本发明针对蝶啶叶酸的合成和色谱分离纯化进行了长期研究，获得了一整套成体系的适用于制备高纯度蝶啶叶酸的方法，有重要的现实意义。

附图说明

下面结合附图进行进一步说明。

图1至叶酸干粉的hplc图。

图2至实施例1中蝶啶叶酸粗品的hplc图。

图3至实施例1中纯化后的蝶啶叶酸的hplc图。

具体实施方式

至了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚，本发明用以下具体实施例进行说明，但本发明绝非限于这些例子。

在下面具体的实施过程中，采用北京创新通恒的lc3000高效液相色谱仪进行制备，柱子型号c1810μm100a；半制备检测器波长至280nm，流速至20ml/min；半制备进样量每次10ml；半制备流动相配制方法至三水合磷酸氢二钾55g，磷酸氢二钾75g，用8000ml纯化水溶解，另加900ml无水甲醇。

实施例1

(1)蝶啶叶酸粗品的合成

将对氨基苯甲酰谷氨酸、三氨基嘧啶硫酸盐、三氯丙酮溶于水中，其中基于质量比计，对氨基苯甲酰谷氨酸：三氨基嘧啶硫酸盐：三氯丙酮：水＝1：2：3：100，控制反应液ph至1，加热至80℃，保温5小时，降温至20℃，过滤，滤液用naoh调节ph至5，过滤，得到粗品，纯度26.23％；

(2)蝶啶叶酸的提纯

粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯化水稀释2倍后，再进半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、冷冻干燥得蝶啶叶酸，所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度45℃、真空度≤-0.09mpa，所述冷冻干燥为温度≤-30℃、真空度≤-10pa、时间12小时。

得到的蝶啶叶酸的纯度为97.99％。

如图1所示叶酸干粉中，叶酸保留时间至8.565，与ep药典中叶酸保留时间约8.5min基本一致，其含量为98.0188；蝶啶叶酸保留时间为10.348，含量为0.1426；蝶啶叶酸相对叶酸的保留时间为1.21，与ep杂质e相对保留时间约1.27基本一致。

如图2所示蝶啶叶酸粗品中，叶酸保留时间为8.632，与ep药典中叶酸保留时间约8.5min基本一致，含量为12.3940；蝶啶叶酸保留时间为10.865，含量为26.2321；蝶啶叶酸相对叶酸的保留时间为1.26，与ep杂质e相对保留时间约1.27基本一致。

图3所示蝶啶叶酸纯品中，叶酸保留时间为8.432，与ep药典中叶酸保留时间约8.5min基本一致，含量为0.7315；蝶啶叶酸保留时间为10.482，含量为97.9909；蝶啶叶酸相对叶酸的保留时间为1.24，与ep杂质e相对保留时间约1.27基本一致。

实施例2

(1)蝶啶叶酸粗品的合成

将对氨基苯甲酰谷氨酸、三氨基嘧啶硫酸盐、三氯丙酮溶于水中，其中基于质量比计，对氨基苯甲酰谷氨酸：三氨基嘧啶硫酸盐：三氯丙酮：水＝1：3：4：120，控制反应液ph至2，加热至90℃，保温8小时，降温至30℃，过滤，滤液用naoh调节ph至3，过滤，得到粗品，纯度22.51％；

(2)蝶啶叶酸的提纯

粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯化水稀释2倍后，再进半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、冷冻干燥得蝶啶叶酸，所述浓缩至真空浓缩，浓缩温度45℃、真空度≤-0.09mpa，所述冷冻干燥至温度≤-30℃、真空度≤-10pa、时间12小时。

得到的蝶啶叶酸的纯度为96.82％。

实施例3

(1)蝶啶叶酸粗品的合成

将对氨基苯甲酰谷氨酸、三氨基嘧啶硫酸盐、三氯丙酮溶于水中，其中基于质量比计，对氨基苯甲酰谷氨酸：三氨基嘧啶硫酸盐：三氯丙酮：水＝1：3：5：150，控制反应液ph至2.5，加热至93℃，保温9小时，降温至35℃，过滤，滤液用naoh调节ph至4，过滤，得到粗品，纯度18.47％；

(2)蝶啶叶酸的提纯

粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯化水稀释4倍后，再进半制备色谱，用质量分数20％甲醇洗出，收集流出液浓缩、冷冻干燥得蝶啶叶酸，所述浓缩至真空浓缩，浓缩温度45℃、真空度≤-0.09mpa，所述冷冻干燥至温度≤-30℃、真空度≤-10pa、时间12小时。

得到的蝶啶叶酸的纯度至97.31％。

实施例4

(1)蝶啶叶酸粗品的合成

将对氨基苯甲酰谷氨酸、三氨基嘧啶硫酸盐、三氯丙酮溶于水中，其中基于质量比计，对氨基苯甲酰谷氨酸：三氨基嘧啶硫酸盐：三氯丙酮：水＝1：2：4：150，控制反应液ph至3，加热至100℃，保温5小时，降温至40℃，过滤，滤液用hcl调节ph至2，过滤，得到粗品，纯度15.67％；

(2)蝶啶叶酸的提纯

粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯化水稀释3倍后，再进半制备色谱，用质量分数5％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、冷冻干燥得蝶啶叶酸，所述浓缩至真空浓缩，浓缩温度45℃、真空度≤-0.09mpa，所述冷冻干燥至温度≤-30℃、真空度≤-10pa、时间12小时。

得到的蝶啶叶酸的纯度至95.5％。

尽管通过参照本发明的优选实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。