一种制备斜生栅藻细胞原生质体的方法与流程

本发明属于微藻生物技术领域，涉及一种制备斜生栅藻原生质体的方法，具体涉及利用水生生物消化酶消化藻细胞的细胞壁获得大量有活性的原生质体的方法。

背景技术：

微藻是一类广泛分类于陆地和海洋生态系统中的低等单细胞生物。微藻生长迅速，因其细胞内富含蛋白质、多糖、多不饱和脂肪酸、微量元素、色素和抗氧化物等多种营养物质，在生物能源、生物化工材料、医药与保健食品和水产养殖饵料等方面有着广泛应用，尤其是微藻可以利用太阳光能、无机盐、co2、海水、废水和非耕地大量积累有效的生物量，开发微藻资源对耕地和淡水资源相对紧缺的中国具有重大的战略价值。

原生质体是指去除细胞壁后裸露的生活细胞，原生质体在藻类生物学中有着十分广泛的应用，可进行各种生理生化研究以及细胞转化、细胞融合、转基因操作等研究工作。其中，生理生化方面研究包括质膜结构与功能、物质转运、信息传递和细胞间相互作用等研究。另一方面，细胞壁是阻止外源遗传物质进入细胞的重要屏障，而失去细胞壁的原生质体摄取病毒、细菌、蛋白质、核酸等遗传物质的效率大大提高，是研究基因的调控和表达，进行藻类遗传工程研究的基础。此外，通过原生质体进行细胞融合，可以改变体细胞的遗传物质，克服远缘杂交不亲和的缺陷，培育优良品种。

影响藻类原生质体制备率的因素主要包括预处理方式、酶的种类和浓度、酶解温度和时间、ph、酶解时的振荡、藻细胞的生长时期、以及稳渗剂的种类和浓度等。酶的种类是酶法制备藻类原生质体的重要影响因素之一，目前使用较多的是一些商业用途的酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶、蛋白酶、几丁质酶、蜗牛酶等的一种或几种酶的组合。藻类细胞壁的结构和化学组成复杂多变，不同藻的细胞壁化学组成和结构差异极大。藻类细胞壁主要成分包括纤维素、半纤维素、多糖和蛋白等，选择合适的酶对有效降解细胞壁至关重要。如褐藻和红藻细胞壁中纤维素的含量只占藻干重的1-8％，但在一些绿藻中纤维素含量却能达到70％。因此，需根据不同藻的细胞壁组成，针对性地选择相应的酶，通常还需要多种单酶进行复合使用。takeda等人发现用离析酶和果胶酶对小球藻(chlorellaprotothecoides)细胞壁的降解效果较差，可能是由于它们对该藻的细胞壁组成(严格的果糖-甘露糖结构)不敏感。而lu等人采用纤维素酶和蜗牛酶组合(2％纤维素酶r-10和1％蜗牛酶)，小球藻原生质体制备率几乎达到了100％。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的另一个重要因素。酶浓度较低时，原生质体的完全破壁率不高，原生质体膜的受损程度相应较低，制备率也不高。当酶浓度升高时，原生质体的完全破壁率逐渐升高，但是过量情况下易导致原生质体的活力下降、甚至细胞破裂、死亡。高渗溶剂也是酶解体系中不可或缺的一员，其作用是维持原生质体内外一定的渗透压，而不致细胞破裂。常用的高渗溶剂有甘露醇和山梨醇、葡萄糖、蔗糖、kcl等，但不同微藻的原生质体细胞对上述高渗溶剂的敏感性不同，在特定条件下，一些高渗溶剂甚至可能产生刺激性，使原生质体失活。此外，酶解过程中加入ca、mg、k等离子对原生质膜有稳定作用。

斜生栅藻(scenedesmusobliquus)是淡水单细胞真核绿藻，属于绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、栅藻科、栅藻属，通常由2或4个细胞组成定型群体。作为一种重要的经济微藻，斜生栅藻被广泛应用于水生生物饵料、污水处理、微藻能源等领域。此外，斜生栅藻还对毒物敏感，因其易获得、繁殖快、在较短时间内即可得到化学物质对其许多世代及种群水平的影响评价，是一种常用的生态毒理受试生物。因此，对斜生栅藻进行基因改造和在基因水平进行特殊代谢机制的研究也得到广泛开展。对斜生栅藻进行分子遗传学研究，建立稳定的遗传转化体系，是开发转基因微藻、深入发掘其应用潜力的重要手段之一。目前尚未见斜生栅藻细胞壁组分和结构的详细报道，klaudija报道了一种利用混合酶破坏斜生栅藻细胞壁，从而提高细胞内活性物质提取效率的方法。该方法使用萄聚糖酶、甘露聚糖酶、昆布多糖酶、纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和蛋白酶的一种或多种酶组合的方法破坏斜生栅藻细胞，但该方法仅破坏了部分细胞壁，并未完整或大部分去除细胞壁，其目的仅是通过酶解提取细胞内的生化成分。总体来说，斜生栅藻原生质体的制备技术这一块还是空白。探索一种高效的降解斜生栅藻细胞壁、并制备原生质体的方法，是进行栅藻细胞融合、基因工程操作、膜蛋白功能研究及内吞作用等生理生化研究的基础。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术制备微藻原生质体效率不高的问题，提供一种高效、简单的方法制备斜生栅藻原生质体。

本发明的目的通过以下方法实现：

一种制备斜生栅藻原生质体的方法，包括如下步骤：

(1)、收集培养至对数生长期的斜生栅藻藻液，用超声波振荡器振荡以打散斜生栅藻聚集所形成的细胞群体，离心，收集斜生栅藻细胞，用新鲜的bg11培养基重悬，得到斜生栅藻细胞悬液；

(2)、以大型溞(daphniamagna)为原料制得混合消化酶液；将所述的混合消化酶液与少量纤维素酶、果胶酶和高渗溶剂甘露醇和膜稳定剂cacl2混合后过滤除去不溶性杂质，再与步骤(1)制得的斜生栅藻细胞悬液混合，通过酶解消化斜生栅藻细胞壁，离心获取游离的原生质体。

步骤(1)中，斜生栅藻细胞采用bg11培养基培养10～14天至对数生长期，培养条件为：温度为26±1℃，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光暗周期为14：10h(光照/黑暗)。

斜生栅藻藻液用超声波振荡器振荡30秒；2000g离心，收集斜生栅藻细胞。

所述的斜生栅藻细胞悬液的细胞密度为3～6×10⁶个/ml。

步骤(2)中，所述的混合消化酶液的制备方法为：大型溞接种于ph为7.8的无氯自来水(用naoh和hcl调整ph)中，静置培养，每日光照时间内定时摇瓶6次，培养条件为26±1℃，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光暗周期14：10h；每日取斜生栅藻藻泥(日投饲量为5～7×10⁶个/ml培养液)饲喂大型溞，培养约96h；取500ml大型溞培养液，用200目筛绢过滤收获大型溞(密度为50～80ind/ml)，用少量0.05mol/l、ph6.0磷酸缓冲液将筛绢上的大型溞冲入研钵中，加入0.05mol/l、ph6.0磷酸缓冲液定容至12ml以保持酶的活性，在4℃低温研磨成匀浆后得到粗提液，过滤得到混合消化酶液；其中，粗提液依次经8μm，1μm滤膜分级过滤，所得滤液即为混合消化酶液。所述的斜生栅藻藻泥的制备方法为：取对数生长期的斜生栅藻藻液，5000rpm离心浓缩斜生栅藻培养液，调整成4～6×10⁹个/ml的藻泥。

所述的磷酸缓冲液的配方为：5.26g/lnah2po4，0.87g/lna2hpo4，8.0g/lnacl，0.2g/lkcl。

所述的混合消化酶液的用量为斜生栅藻细胞悬液体积的5～8％，优选为5％(体积比)；所述的纤维素酶和斜生栅藻细胞悬液的质量体积比为0.5～2：100g/ml，优选为0.5：100g/ml；所述的果胶酶和斜生栅藻细胞悬液的质量体积比为0.5～2：100g/ml，优选为0.5：100g/ml。纤维素酶活力在250～600u/ml，果胶酶活力在400～800u/ml。

所述的甘露醇的浓度为0.3～0.6mol/l，优选为0.5mol/l；所述的膜稳定剂cacl2的浓度为3～5mmol/l，优选为4mmol/l。

所述的酶解消化条件为：温度30±1℃，避光条件下，50～80rpm轻微振荡8～12h。

所述的酶解消化过程具体为：在所述的混合消化酶液中加入纤维素酶、果胶酶，添加高渗溶剂甘露醇和膜稳定剂ca²⁺，用0.45μm的滤膜过滤除去不溶性杂质后，与步骤(1)制得的斜生栅藻细胞悬液混合，在温度30±1℃、避光条件下，50～80rpm轻微振荡8～12h酶解消化斜生栅藻细胞壁，得到含有原生质体的混合酶解液。

酶解消化后，得到的混合酶解液2000g离心，将原生质体和混合酶液分离，原生质体用洗脱液洗脱3次；所述的洗脱液为含有0.3～0.6mol/l甘露醇和3～5mmol/lcacl2的水溶液，优选为含有0.5mol/l甘露醇和4mmol/lcacl2的水溶液；即将甘露醇和cacl2溶于去离子水中配制。

本发明的有益效果：

本发明制备斜生栅藻细胞的方法提取高效，可获得大量的原生质体，通过该方法制备原生质体的效率可达70％；且原生质体活性较强，再生能力强，既可为以斜生栅藻为目标的细胞融合及基因操作提供技术支持，亦可为研究微藻细胞的膜生理功能、内吞作用等生理生化过程提供可靠的原材料。

附图说明

图1为光学显微镜观察斜生栅藻细胞(a)和酶解后获得的原生质体(a)。

图2为斜生栅藻原生质体再生后fv/fm值测定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步阐释本发明的技术方案。

实施例1

斜生栅藻细胞(来源于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，武汉)用bg11培养基培养，培养基组成为：1.5g/lnano3，0.04g/lk2hpo4，0.075g/lmgso4.7h2o，0.036g/lcacl2.2h2o，0.006g/l柠檬酸，0.006g/l柠檬酸铁铵，0.001g/lna2edta，0.02g/lna2co3，2.86mg/lh3bo3，1.81mg/lmncl2.4h2o，0.22mg/lznso4.7h2o，0.39mg/lna2moo4.2h2o，0.08mg/lcuso4.5h2o，0.05mg/lco(no3)2.6h2o。培养条件为：温度为26±1℃，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光照周期14：10h条件，培养10～14天至对数生长期，藻液用超声振荡器振荡30秒以打散斜生栅藻聚集所形成的细胞群体，2000g离心，收集斜生栅藻细胞，用新鲜的bg11培养基重悬得到细胞密度为5×10⁶个/ml的斜生栅藻细胞悬液(见图1a)。

取对数生长期的斜生栅藻藻液，5000rpm离心浓缩成4～6×10⁹个/ml的藻泥；大型溞(来源于中国科学院水生研究所)接种于ph为7.8的无氯自来水(用naoh和hcl调整ph)中，静置培养，每日光照时间内定时摇瓶6次，培养条件为26±1℃，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光暗周期14：10h；每日取斜生栅藻藻泥(日投饲量为5～7×10⁶个/ml培养液)饲喂大型溞，培养约96h；取500ml大型溞培养液，用200目筛绢过滤收获大型溞(密度为57ind/ml)，用少量0.05mol/l、ph6.0磷酸缓冲液(5.26g/lnah2po4，0.87g/lna2hpo4，8.0g/lnacl，0.2g/lkcl)将筛绢上的大型溞冲入研钵中，加入0.05mol/l、ph6.0磷酸缓冲液定容至12ml，在4℃低温研磨成匀浆后得到粗提液，粗提液依次经8μm，1μm滤膜分级过滤得到混合消化酶液。

在混合消化酶液中加入纤维素酶、果胶酶，添加高渗溶剂甘露醇和膜稳定剂cacl2，用0.45μm的滤膜过滤除去不溶性杂质后，与制得的斜生栅藻细胞悬液混合，其中，混合消化酶液为斜生栅藻细胞悬液体积的5％，纤维素酶、果胶酶与混合消化酶液质量体积比(g/ml)均为0.5％，甘露醇在酶解体系中的浓度为0.5mol/l，膜稳定剂cacl2在酶解体系中的4mmol/l；将藻细胞与酶的混合液在30±1℃，避光条件下，以60rpm轻微振荡进行酶解12h，酶解结束后混合酶解液离心，将原生质体和混合酶液分离，原生质体用洗脱液(含有0.5mol/l甘露醇和4mmol/lcacl2水溶液)洗脱3次，即制得原生质体(见图1b)。

计算原生质体制备率

分别采用低渗爆破法和染色体法计算原生质体制备率。

低渗爆破法：向制备的原生质体中分别加入蒸馏水和高渗溶液，被较完整去除细胞壁的原生质体在蒸馏水中细胞涨大，甚至破裂，表明较为完整地去除藻细胞的细胞壁，在实验最优条件下，原生质体制备率达70％。

原生质体制备率(％)＝(处理后细胞总数－蒸馏水中完整的细胞数)/处理前细胞总数×100％。

考察原生质体再生能力

配制高渗固体平板培养基，配方为：bg11+8％海带渣酶解提取液+1.5％琼脂，其中海带渣酶解提取物采用zheng酶解法提取(effectofkelpwasteextractsonthegrowthandlipidaccumulationofmicroalgae.bioresourcetechnology,2016,201:80-88)。

将制备好的原生质体(0.5ml)接种至高渗固体平板培养基上，26±1℃下弱光条件(10μmol·m^-2·s^-1)培养3天后转至光照强度为50μmol·m^-2·s^-1条件下培养至平板上长出绿色藻落。挑取绿色藻落接种至bg11液体培养基中，培养至对数生长期后测定叶绿素荧光参数fv/fm值，发现其与正常细胞无显著差异(见图2)，表明原生质体再生后的其细胞活力不受影响。

综合分析以上结果，利用大型溞提取的混合消化酶液，能有效地降解斜生栅藻的细胞壁，获得大量原生质体，原生质体制备率高，再生后细胞活力高。

以上所述仅是本发明的较佳实施的案列而已，并非是对本发明的技术内容作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。