本发明属于烟草醇化发酵技术领域，具体是涉及一种利用新发现的细菌(洞穴芽球菌)提升烟叶品质的方法。
背景技术：
烟草是我国财政的重要支柱之一，对我国的社会和经济发展作出了巨大贡献。要推进我国烟草进程，实现卷烟工业可持续发展，就必须走烟草科技创新之路。烟叶的品质直接影响着卷烟的内在吸味。国家烟草专卖局明确指出，要“攻克影响烟叶香气质、香气量的关键技术”，缩小与国外烟叶质量差距，以提高国内外市场竞争力。
烟叶发酵是烟草加工过程中的主要工艺环节。在醇化发酵过程中,烟叶主要化学成分会发生相应的变化,青杂气和刺激性逐渐降低,香气显露,吃味醇和,色泽均匀并加深，故而烟叶醇化发酵对烟叶质量的改变起着非常重要的作用。改进烟叶发酵技术，增进烟叶的香吃味质量，已成为卷烟工业提高加工工艺技术水平的重要手段。
微生物种类丰富，长期以来，人们利用纯培养技术对环境中的微生物进行调查研究和开发利用。随着科学技术的发展，微生物资源在科技研究及生物产业中的重要性日益凸显。世界上许多国家都在搜集、保存各种微生物资源，其不断丰富将为我国生物技术的发展奠定坚实的物质基础。国内外烟草工作者在烟草微生物分离和利用微生物发酵改善烟草品质、改进烟叶发酵进程、缩短烟叶发酵周期等方面做了很多工作,特别是通过施加选育的微生物及制剂于烟草中,通过微生物的代谢活动降低烟碱等有害成分,增加烟草香吃味,提高烟草质量等。但所涉及的微生物多限于产香酵母。
本发明首次从自然界分离得到一种洞穴芽球菌，经鉴定为微生物新种，目前未有任何关于所述洞穴芽球菌及其用途的公开报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用洞穴芽球菌提升烟叶品质的方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。
一种利用洞穴芽球菌提升烟叶品质的方法，其特征在于：将洞穴芽球菌制成菌剂后与烟叶共同发酵；所述的洞穴芽球菌分类命名为洞穴芽球菌sysuzl-2(blastococcuscavernaesp.sysuzl-2)，该菌株于2016年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno：m2016739。
所述的共同发酵具体为：将洞穴芽球菌扩大发酵培养后制成菌剂，称取预先平衡水分至13％的烟丝，喷施洞穴芽球菌菌剂，以烟丝重量计，每1000克烟丝喷施菌剂量为10～30ml，然后将处理后的烟丝置于22℃，湿度60％的恒温恒湿环境中发酵48h，120℃烘干烟丝。
本发明的洞穴芽球菌(blastococcuscavernaesp).sysuzl-2，由下述方法筛选得到：
从云南省石林县印象烟庄烟田土壤中分离得到，固体培养过程中，发现绝大部分的微生物具有产生挥发性物质的能力，经液体发酵后产生的气息明显不同。在获得的纯培养分离菌株中，筛选得到可在含有简单碳氮源的培养基上产生挥发性、且为特殊香味气息的菌株sysuzl-2。gc-ms鉴定结果显示，菌株sysuzl-2产生几类主要挥发性化合物，香茅醇、香叶醇以及莰醇、萜品醇、芳樟醇。莰醇临床上有抗炎止痛的功效，芳樟醇具有清甜气息可用于卷烟加香除杂，香茅醇具有抗真菌、抗氧化活性，集中应用在医药方面。萜品醇可用作食物香精和化妆品底物，运用广泛。
所述的洞穴芽球菌sysuzl-2在大多数培养基上生长良好，基内菌丝灰色至黄褐色。明胶液化、淀粉水解、硝酸还原呈阳性，牛奶凝固、胨化呈阴性，不产生硫化氢，不产生黑色素。能利用葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖、肌醇、甘露醇、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸。细胞壁含有meso-dap，全细胞水解物含有半乳糖和阿拉伯糖。
经过微生物学特性分析和16srrna基因序列分析表明，所述的洞穴芽球菌sysuzl-2是一种新的细菌，其16srrna基因核苷酸序列如序列表所示。
本发明的有益效果是：
1.微生物学特性分析和16srdna基因序列分析表明，所述的洞穴芽球菌sysuzl-2一种新的细菌，实验证明该菌株能有效提高烤烟内在品质、增加烟叶香气。本发明成功地将生物技术引入烟草生产中，是烟草生产技术的一个重要突破。
2.通过改善烟叶品质，大大提高烟叶可用性。加速烟叶发酵，提高烟叶等级质量，使烟叶可溶性还原糖含量增加，而蛋白质、纤维素、总氮、烟碱含量下降，内在化学成分更为协调，烟叶抽吸品质得到明显提升。
3.工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，对促进卷烟工业健康发展具有积极意义。
保藏生物材料的说明
本发明的菌株，已于2016年12月9日，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，该中心地址：中国.武汉.武汉大学，该菌株分类命名为洞穴芽球菌sysuzl-2(blastococcuscavernaesp.sysuzl-2)，保藏编号cctccno：m2016739。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不是对本发明技术方案的限定。
实施例1
——洞穴芽球菌sysuzl-2在提升烟叶品质中的应用，具体步骤如下：
(1)斜面培养：培养基：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；琼脂15g；蒸馏水1000ml，ph7.2；培养温度为28℃，培养时间为48h。
(2)种子培养：从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养。种子培养基：糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，ph7.2，培养温度为28℃，培养时间36小时。
(3)发酵培养：按10％的接种量接到种子培养基中，摇瓶培养。培养基：大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000ml，ph7.2，在全温振荡器中振荡(121r/min)发酵48h，培养温度为28℃。
(4)取发酵培养液1l，以3500r/min离心10min，去上清，用无菌水洗涤沉淀、离心，去上清，重复2次，最后用100ml无菌水振荡均匀，使用时稀释10倍即为菌剂。
(5)烟叶发酵
本研究采用昆明k326b2f和昆明红大c2f烟叶为处理对象。处理浓度为每1000克烟丝喷施菌剂量10ml，对照组喷施等量无菌水，三次重复。将处理后的烟叶样品放入22℃，湿度60％的恒温恒湿箱内发酵48h，取样品测其主要化学成分，测得数据取平均值进行分析。
——样品处理及烟叶主要化学成分分析
1)样品处理：取烟叶样品，先用旋风磨粉碎，烟末样品在40℃下干燥约3h(含水率6％-8％)，过40目筛，装入样品瓶，盖紧瓶盖，常温下避光贮存。
2)烟叶主要化学成分分析：nicoletantaris型傅立叶变换近红外光谱仪,配备tqanalyst6.2定量分析软件(美国thermonicolet公司)。
——化学成分测定结果
烟叶的化学成分检测结果如下(详见表1，2)，实验结果表明，从单一化合物看，经菌剂处理的烟叶内在化学成分发生了明显变化。总糖、还原糖含量比对照增加较大，总氮、纤维素、蛋白质、烟碱含量与对照相比均有所下降。糖氮比、糖碱比、氮碱比均有所改善。系统的试验数据说明，经菌剂处理的各类烟丝各项指标均优于对照，烟丝内各成分趋于平衡。有利于改善烟叶内在品质，提高烟叶香气。
表1菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表2菌剂对烟叶的糖/氮、糖/烟碱、氮/烟碱比值的影响
——处理烟样感官评吸
将处理组和对照组的烟丝分别卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％，温度22℃条件下平衡24h后，由12位卷烟专业评吸专家组成的评吸小组进行评吸。专家评吸认为：利用洞穴芽球菌sysuzl-2处理后的烟叶样品，具有明显提调烟香、减少杂气、降低刺激的良好效果，结果见表3。
表3菌剂对感官评吸的影响
实施例2
重复实施1，有以下不同点：处理浓度为每1000克烟丝喷施菌剂量20ml。
——化学成分测定结果
烟叶的化学成分检测结果如下(详见表4，5)，实验结果表明，从单一化合物看，经菌剂处理的烟叶内在化学成分发生了明显变化。总糖、还原糖含量比对照增加较大，总氮、纤维素、蛋白质、烟碱含量与对照相比均有所下降。糖氮比、糖碱比、氮碱比均有所改善。系统的试验数据说明，经菌剂处理的各类烟丝各项指标均优于对照，烟丝内各成分趋于平衡。有利于改善烟叶内在品质，提高烟叶香气。
表4菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表5菌剂对烟叶的糖/氮、糖/烟碱、氮/烟碱比值的影响
——处理烟样感官评吸
将处理组和对照组的烟丝分别卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％，温度22℃条件下平衡24h后，由12位卷烟专业评吸专家组成的评吸小组进行评吸。专家评吸认为：利用洞穴芽球菌sysuzl-2处理后的烟叶样品，具有明显提调烟香、细腻醇和烟气、降低刺激、提升津甜感的良好效果，结果见表6。
表6菌剂对感官评吸的影响
实施例3
重复实施1，有以下不同点：处理浓度为每1000克烟丝喷施菌剂量30ml。
——化学成分测定结果
烟叶的化学成分检测结果如下(详见表7，8)，实验结果表明，从单一化合物看，经菌剂处理的烟叶内在化学成分发生了明显变化。总糖、还原糖含量比对照增加较大，总氮、纤维素、蛋白质、烟碱含量与对照相比均有所下降。糖氮比、糖碱比、氮碱比均有所改善。系统的试验数据说明，经菌剂处理的各类烟丝各项指标均优于对照，烟丝内各成分趋于平衡。有利于改善烟叶内在品质，提高烟叶香气。
表7菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表8菌剂对烟叶的糖/氮、糖/烟碱、氮/烟碱比值的影响
——处理烟样感官评吸
将处理组和对照组的烟丝分别卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％，温度22℃条件下平衡24h后，由12位卷烟专业评吸专家组成的评吸小组进行评吸。专家评吸认为：利用洞穴芽球菌sysuzl-2处理后的烟叶样品，具有明显提升香气量、增加香气丰富性，降低刺激，提升津甜感的良好效果，结果见表9。
表9菌剂对感官评吸的影响
序列表
<110>云南中烟工业有限责任公司
<120>利用洞穴芽球菌提升烟叶品质的方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>3
<212>dna
<213>洞穴芽球菌(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1