一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的SNP标记引物及分子标记方法与流程

文档序号：17221565发布日期：2019-03-27 12:01阅读：364来源：国知局

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的snp标记引物及分子标记方法。

背景技术：

甜瓜(cucumismelol.)为一年生葫芦科(cucurbitaceae)黄瓜属(cucumis)作物，其果实不仅色香味俱全，还具有很高的营养价值，是一种世界性的瓜果。甜瓜果肉颜色主要分为橘色、绿色和白色，橘色果肉甜瓜因其比绿色果肉及白色果肉甜瓜的颜色更加诱人，受到消费者的偏爱。培育合适果肉颜色的甜瓜品种，特别是橘色果肉的甜瓜品种，是当前甜瓜遗传育种的重要目标之一。

甜瓜果肉颜色由叶绿素和类胡萝卜素共同决定，类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素是决定甜瓜果肉颜色的关键色素。β-胡萝卜素广泛存在于新鲜蔬菜和水果中，丰富的β-胡萝卜素可以缓解维生素a缺乏引起的各种病症，并具有预防癌症、心脑血管疾病和眼部疾病的功效，还能抗氧化和预防衰老。甜瓜果肉颜色分别由gf(决定果肉绿色)、wf(决定果肉白色)两个等位基因决定，gf决定橘色果肉，同时对gf和wf呈显性上位效应。galiltzuri(2015,theplantjournal,vol82:267-279)在甜瓜中发现一个可以增加果肉β-胡萝卜素含量的基因cmor，是甜瓜中的gf位点，为控制甜瓜果肉颜色的关键因子，含有正常功能cmor基因的甜瓜表现为橘色的果肉，含有突变形式cmor基因的甜瓜表现为绿色或白色果肉。

当前对于橘色果肉甜瓜的选育，一般还采用传统方法，即鉴定育种材料成熟时的果实颜色，具有费时、费力、周期长等缺点。分子标记辅助育种直接从dna水平对性状进行选择，是传统育种技术的有力补充，具有省时、省力、不受环境影响等优点。snp(singlenucleotidepolymorphism)分子标记为第三代分子标记，具有数量多、遗传稳定等优点，基于caps(cleavedamplifiedpolymorphicsequence,酶切扩增多态性序列标记技术)的snp分子标记检测方法，主要是针对pcr扩增的含有snp位点的dna片段进行限制性酶切分析，检测snp位点的多态性，具有准确、成本低、快速等特点，是snp分子标记分析的重要方法之一。

开发合适的snp分子标记，用于选育橘色果肉的甜瓜品种或品系，能够降低育种成本，加快育种进程，具有重要的实际应用价值。

技术实现要素：

对于橘色果肉甜瓜的选育，育种材料成熟期的果实颜色进行鉴定的传统方法具有费时、费力、易受环境影响等缺点，为了克服现有技术中的这些缺点，本发明提供了一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的专用引物及分子标记方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的snp标记引物，其特征是所述引物为如序列表中seqidno.1所示，从5’端到3’端的第1-25位的单链dna序列的正向引物ttggagcacttgtttcacttccagg；和如序列表中seqidno.2所示，从5’端到3’端的第1-30位单链dna序列的反向引物agttcatgagaatagtccgtactactacgc。

利用本发明的分子标记专用引物，以待检测材料的基因组dna为模板，通过pcr扩增获得分子标记，通过测序可得到：

果肉为橘色的甜瓜材料的分子标记大小为739bp的pcr产物，如序列表中seqidno.3所示，从5’端到3’端的单链dna序列为：

ttggagcacttgtttcacttccaggttgaattctggtaaagaacggcagaagttgagctcgaggtggcgatggcgatccatggcctcggattctactgactcttcttcttcttcttcttttgctccgtctgttgaatctgatccttcggataaaacttcagccaggttggtgaattcttgcttctggtacctctgtatctggttgtggttgaagcattttgaggcaacgtctaggaagtgaaatgaatgttggtttgttgtgtttgatgttgatttacgtgatggaattgtaaaatgactggatagtttcttgtgttctttactttttgagcactgctacttgaaaatgctcgtgttatggttgaaggtttggattggattgattggtcgtttttgtcgtgatgatttgaagaatttgttatcagttcaatattgcgaataccataagttctgttcttatcctacaaacttttttatgcttattaagtcggccatctccttggttttcttcatgtgacaattaggaataatttatctgtaaattaaatgttaacttaacatgattttatgcagtttttgtatcatagagggaccggaaacagtacaagattttgcaaaaatggaactgcaagaagttcaggagaacattcgaagtcgtcgaaacaaaattttcttgcatatggaagaggtgagacttagtggacattttgcgtagtagtacggactattctcatgaact；

该pcr产物的序列在134bp与634bp附近处具有符合hinfi的酶切位点特征gantc的序列“gaatc”和“gattc”。

(切下的条带为500bp的原因是“gaatc”和“gattc”序列，序列符合hinfi的酶切位点gantc，该序列可利用酶切法用于区分正利用了这一性质。)

果肉为绿色或白色的甜瓜材料的分子标记大小为739bp的pcr产物，从5’端到4’端的单链dna序列为：

ttggagcacttgtttcacttccaggttgaattctggtaaagaacggcagaagttgagctcgaggtggcgatggcgatccatggcctcggattctactgactcttcttcttcttcttcttttgctccgtctgttgaatctgatccttcggataaaacttcagccaggttggtgaattcttgcttctggtacctctgtatctggttgtggttgaagcattttgaggcaacgtctaggaagtgaaatgaatgttggtttgttgtgtttgatgttgatttacgtgatggaattgtaaaatgactggatagtttcttgtgttctttactttttgagcactgctacttgaaaatgctcgtgttatggttgaaggtttggattggattgattggtcgtttttgtcgtgatgatttgaagaatttgttatcagttcaatattgcgaataccataagttctgttcttatcctacaaacttttttatgcttattaagtcggccatctccttggttttcttcatgtgacaattaggaataatttatctgtaaattaaatgttaacttaacatgattttatgcagtttttgtatcatagagggaccggaaacagtacaagattttgcaaaaatggaactgcaagaaattcaggagaacattcgaagtcgtcgaaacaaaattttcttgcatatggaagaggtgagacttagtggacattttgcgtagtagtacggactattctcatgaact；

该pcr产物的序列在134bp附近处具有符合hinfi的酶切位点gantc特征的序列“gaatc”。

利用上述两端dna序列含有hinfi的酶切位点序列所处位置的不同，可将待测材料经snp标记引物扩增的pcr产物利用hinfi进行酶切处理，在酶切处理后进行凝胶电泳，果肉为橘色的甜瓜材料的片段大小为500bp，果肉为绿色或白色的甜瓜材料的片段大小为605bp。

一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的分子标记方法，其特征是提取甜瓜待检测样品的基因组dna作为模板，利用上述snp标记引物进行聚合酶链式反应(pcr)扩增，对扩增的产物利用hinfi酶进行酶切处理后，再通过电泳对扩增产物进行检测。

具体步骤如下：

1)利用ctab法提取甜瓜待测样品任意组织或器官的基因组dna；

2)以步骤1所得的待测样品基因组dna为模板，利用分子标记专用引物对不同材料进行pcr扩增，获得扩增产物；

3)利用hinfi酶对步骤2中得到的扩增产物进行酶切处理；

4)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对步骤3所得的酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，使不同大小的pcr扩增产物处于不同的位置；

5)利用银染的方法检测凝胶电泳的结果，经过银染，通过肉眼观察可看到pcr扩增的dna片段在凝胶中的位置，距离上样孔距离远的，是小的dna片段500bp，距离上样孔近的，为大的dna片段605bp；

步骤4)和步骤5)也可以利用琼脂糖凝胶电泳，对酶切产物进行检测，然后利用步骤6)判断果肉颜色。

6)通过判断片段大小，pcr扩增片段较小的为果肉颜色为橘色的甜瓜材料，扩增片段较大的为果肉颜色为绿色或白色的甜瓜材料。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明方法特异性好，准确率可达到99.8％。

(2)本发明获得的分子标记及其特异性引物，在不同果肉颜色的甜瓜材料中可以对橘色果肉甜瓜材料进行很好的区分，因此，本发明获得了一个可以高效、准确区分厚皮甜瓜是否为橘色果肉甜瓜材料的分子标记。

(3)该方法利用了标记引物将甜瓜待测样品的基因组dna进行pcr扩增，并对pcr扩增的含有snp位点的dna片段进行限制性酶切分析，可以清晰的将区分甜瓜材料是否为橘色果肉材料，省时省力，不受环境因素影响。

附图说明

图1：本发明的分子标记专用引物以不同颜色果肉甜瓜高代自交系的基因组dna为模板进行pcr扩增结果；其中m表示dnamarker，1号-12号表示不同样品的pcr扩增的结果，其中1、ogenself；2、charentais；3、脆梨；4、nb682；5、nb683；6、nb684；7、nb685；8、nb686；9、nb687；10、nb688；11、nb689；12、nb690。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

以下实施例中的甜瓜材料ogenself、charentais、脆梨、nb682、nb683、nb684、nb685、nb686、nb687、nb688、nb689、nb690，公众可从天津大学植物资源及育种实验室获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其他用途使用。

实施例1、分子标记的获得

甜瓜基因cmor是调节甜瓜果实颜色的重要调控因子，利用甜瓜基因组重测序信息，在该基因所在染色体的位置附近区域，筛选合适的snp位点，最终获得了1个具有多态性的snp标记，该位点为甜瓜(cucumismelol.)基因组第09染色体上的第20549181位的核苷酸。为利用该snp位点，设计了合适的特异性引物，包括上游引物f和下游引物r，引物序列如下：

上游引物f：ttggagcacttgtttcacttccagg(seqidno.2)

下游引物r：agttcatgagaatagtccgtactactacgc(seqidno.3)

实施例2、高代自交系甜瓜果肉颜色的鉴定

不同颜色果肉甜瓜高代自交系ogenself、charentais、脆梨、nb682、nb683、nb684、nb685、nb686、nb687、nb688、nb689、nb690，在田间正常种植、管理，将成熟后的甜瓜果实，从中间切开，观察果肉颜色，上述高代自交系的果肉颜色统计如下：

表1.甜瓜材料果肉颜色鉴定统计结果

实施例3、分子标记在鉴定甜瓜是否为橘色果肉甜瓜中的应用

对实施例2中的甜瓜材料，利用ctab法提取叶片的基因组dna，具体的步骤为：取甜瓜幼嫩叶片0.2g入1.5ml离心管中，加50μl2％ctab提取缓冲液，研磨，后补齐至400μl，65℃水浴30min；加入400μl氯仿：异戊醇(24:1)，轻摇5min。12000rpm离心5min；取上清200μl，加入预冷的异丙醇200μl混匀，-20℃放置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入150μl预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000rpm离心5min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100μl溶解dna，室温放置1h；用蒸馏水将dna稀释到50ng/μl，作为pcr模板使用或-20℃保存备用。

以上述甜瓜基因组dna为模板，实施例1中的上游引物f和和下游r为引物，进行pcr扩增，采用10μl的反应体系，包括：

pcr扩增采用的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。

利用限制性内切酶hinfi对上述pcr扩增产物进行酶切，反应体系为：pcr扩增产物8.9μl，10×hinfibuffer1.0μl，hinfi(10u/μl)0.1μl。37℃酶切2h。对酶切产物在1.5％的琼脂糖凝胶中，150v恒压电泳30min，eb染色后，用凝胶成像系统观察结果。也可以制成试剂盒，用于鉴定甜瓜是否为橘色果肉甜瓜。其中，在橘色果肉甜瓜，电泳条带为505bp或者含有505bp的条带，在非橘色果肉的甜瓜，电泳条带为605bp，。根据电泳结果图，统计如表2和图1。

表2.甜瓜材料分子标记鉴定统计结果

将每个高代自交系甜瓜材料的果肉颜色鉴定结果与snp分子标记的鉴定结果进行统计，发现其结果完全一致。

综合以上结果可知，利用序列表中序列所示的snp标记，即甜瓜基因组第09染色体上的第20549181位的snp标记，及其特异引物对待鉴定的甜瓜材料进行pcr扩增，限制性内切酶酶切、电泳分离检测后，发现甜瓜果实颜色的分子水平鉴定结果与表型鉴定结果一致，表明序列表中所示的snp标记与甜瓜果肉颜色的表型紧密连锁，该snp标记及其特异引物可以用于对甜瓜果肉颜色进行辅助筛选和鉴定，筛选或者辅助筛选具有橘色果肉的甜瓜品系或品种。

以上对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110>天津大学

<120>一种用于鉴定甜瓜果肉颜色的snp标记引物及分子标记方法

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttggagcacttgtttcacttccagg25

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agttcatgagaatagtccgtactactacgc30

<210>3

<211>739

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ttggagcacttgtttcacttccaggttgaattctggtaaagaacggcagaagttgagctc60

gaggtggcgatggcgatccatggcctcggattctactgactcttcttcttcttcttcttt120

tgctccgtctgttgaatctgatccttcggataaaacttcagccaggttggtgaattcttg180

cttctggtacctctgtatctggttgtggttgaagcattttgaggcaacgtctaggaagtg240

aaatgaatgttggtttgttgtgtttgatgttgatttacgtgatggaattgtaaaatgact300

ggatagtttcttgtgttctttactttttgagcactgctacttgaaaatgctcgtgttatg360

gttgaaggtttggattggattgattggtcgtttttgtcgtgatgatttgaagaatttgtt420

atcagttcaatattgcgaataccataagttctgttcttatcctacaaacttttttatgct480

tattaagtcggccatctccttggttttcttcatgtgacaattaggaataatttatctgta540

aattaaatgttaacttaacatgattttatgcagtttttgtatcatagagggaccggaaac600

agtacaagattttgcaaaaatggaactgcaagaagttcaggagaacattcgaagtcgtcg660

aaacaaaattttcttgcatatggaagaggtgagacttagtggacattttgcgtagtagta720

cggactattctcatgaact739

<210>4

<211>739

<212>dna

<213>人工序列

<400>4