一种戊糖乳杆菌及其在抑制沙门氏菌方面的应用的制作方法

本发明涉及一种戊糖乳杆菌及其在抑制沙门氏菌方面的应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

沙门氏菌病(salmonellosis)是有沙门氏菌属细菌引起的各种动物和人的疾病的总称。沙门氏菌属的宿主包括哺乳类、禽类、爬虫类、鱼类和人等，宿主广泛，可引发各种各样的疾病。疾病的严重程度从慢性到急性，从局部感染到全身性败血症，严重的可引起死亡。沙门氏菌病作为全球性疾病，地理位置分布十分广泛，世界各国均有较多沙门氏菌病情发生，带来严重的经济损失和安全隐患。

人类沙门氏菌感染往往多见于急性感染病例，表现为绞痛、腹泻、恶心、呕吐和发热等。其发病程度与沙门氏菌血清型和感染剂量有关。

目前有多种用于治疗致病菌感染的药物如抗生素等，可有效减缓沙门氏菌等致病菌感染后的发病症状。也有一些中药配方可以有效缓解致病菌感染症状。但是，抗生素在治疗致病菌感染的同时也会杀死大量的肠道共生菌、造成肠道菌群紊乱，并且抗生素的使用不仅对人本身产生副作用，也会流入到环境中造成环境中抗生素压力增大、破坏生态平衡。而中药治疗的作用效果往往不理想，而且与抗生素治疗一样存在滞后性的问题。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)，已于2017年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13956，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有所述戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)和/或其代谢产物。

在本发明的一种实施方式中，所述戊糖乳杆菌的含量≥1×10⁸cfu/ml。

在本发明的一种实施方式中，所述戊糖乳杆菌的含量≥1×10⁸cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，所述代谢产物是将戊糖乳杆菌接种至mrs培养基中，离心后收集的上清。

在本发明的一种实施方式中，所述的药物组合物由戊糖乳杆菌菌剂与药学上可接受的载体组成。

在本发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的载体是一种或多种选自药学上通常使用的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂或矫味剂的载体。

本发明的第三个目的是提供所述戊糖乳杆菌在抑制沙门氏菌生物量方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述戊糖乳杆菌接种至mrs培养基中，35～37℃培养14～36h后，再加入至含沙门氏菌的液体、固体或半固体中。

在本发明的一种实施方式中，所述戊糖乳杆菌与沙门氏菌的菌浓比为1:1～100。

本发明还提供所述戊糖乳杆菌制备的食品或保健品。

有益效果：本发明的戊糖乳杆菌at6培养物上清与沙门氏菌共培养，能抑制沙门氏菌生长，使其生物量降低82.9％；戊糖乳杆菌at6能降低沙门氏菌对ht-29细胞的黏附、侵袭，能使其黏附率降低75.0％，侵袭率降低89.3％。摄入戊糖乳杆菌at6使小鼠肝脏、脾脏中沙门氏菌检出率从60％、50％分别降至0％、0％，回肠、盲肠、结肠内容物中的沙门氏菌数量分别降低了71.0％、67.7％、84.3％。戊糖乳杆菌at6能减缓沙门氏菌引起的小鼠死亡，15天时小鼠的存活率从40％提高至65％。

生物材料保藏

本发明所提供的戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)，已于2017年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13956，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为戊糖乳杆菌at6培养物上清在lb培养基中对沙门氏菌的抑制效果图；其中，at6组为戊糖乳杆菌at6与沙门氏菌共培养；lgg组为鼠李糖乳杆菌lgg与沙门氏菌共培养；mrs组为空白对照组，mrs培养基与沙门氏菌共培养；hcl-3.81组为用盐酸调ph至3.81的mrs与沙门氏菌共培养；la-3.81组为用dl-乳酸调ph至3.81的mrs与沙门氏菌共培养；

图2是戊糖乳杆菌at6抑制沙门氏菌黏附ht-29细胞的作用；其中，con组为对照组，六孔板中加入1640空白培养基，后加入1.0×10⁸cfu沙门氏菌；lgg组表示向六孔板中加入1.0×10⁸cfu鼠李糖乳杆菌lgg，后加入1.0×10⁸cfu沙门氏菌；at6组表示向六孔板中加入1.0×10⁸cfu戊糖乳杆菌at6，后加入1.0×10⁸cfu沙门氏菌；

图3是戊糖乳杆菌at6抑制沙门氏菌侵袭ht-29细胞的作用；其中，con组为对照组，六孔板中加入1640空白培养基，后加入1.0×10⁸cfu沙门氏菌；lgg组表示向六孔板中加入1.0×10⁸cfu鼠李糖乳杆菌lgg，后加入1.0×10⁸cfu沙门氏菌；at6组表示向六孔板中加入1.0×10⁸cfu戊糖乳杆菌at6，后加入1.0×10⁸cfu沙门氏菌；

图4是戊糖乳杆菌at6对沙门氏菌感染小鼠肝脏和脾脏中沙门氏菌载量的影响；其中，liver-con表示模型组肝脏沙门氏菌载量；liver-lgg表示鼠李糖乳杆菌lgg处理组肝脏沙门氏菌载量；liver-at6表示戊糖乳杆菌at6处理组肝脏沙门氏菌载量；spleen-con表示模型组脾脏沙门氏菌载量；spleen-lgg表示鼠李糖乳杆菌lgg处理组脾脏沙门氏菌载量；spleen-at6表示戊糖乳杆菌at6处理组脾脏沙门氏菌载量；

图5是戊糖乳杆菌at6对沙门氏菌感染小鼠肠道内容物中沙门氏菌载量的影响；其中，ileum-con表示模型组回肠内容物中沙门氏菌载量；ileum-lgg表示鼠李糖乳杆菌lgg处理组回肠内容物中沙门氏菌载量；ileum-at6表示戊糖乳杆菌at6处理组回肠内容物中沙门氏菌载量；cecum-con表示模型组盲肠内容物中沙门氏菌载量；cecum-lgg表示鼠李糖乳杆菌lgg处理组盲肠内容物中沙门氏菌载量；cecum-at6表示戊糖乳杆菌at6处理组盲肠内容物中沙门氏菌载量；colon-con表示模型组结肠内容物中沙门氏菌载量；colon-lgg表示鼠李糖乳杆菌lgg处理组结肠内容物中沙门氏菌载量；colon-at6表示戊糖乳杆菌at6处理组结肠内容物中沙门氏菌载量；

图6是戊糖乳杆菌at6的摄入提高鼠伤寒沙门氏菌感染后小鼠的存活率；其中，control组灌胃pbs；model组灌胃沙门氏菌；lgg组先灌胃鼠李糖乳杆菌lgg，后灌胃沙门氏菌；at6组先灌胃戊糖乳杆菌，后灌胃沙门氏菌。

具体实施方式

mrs液体培养基(每1l)：胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、柠檬酸氢二铵2g、无水乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、一水硫酸锰0.25g、吐温801ml，加水至1000ml，ph调至6.2-6.4，115℃、20min湿热灭菌。

mrs固体培养基(每l)：液体培养基中添加琼脂粉15g/l。

lb培养基(每l)：酵母粉5.0g，胰蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g。加水1l，121℃15min湿热灭菌。

菌种活化：用接种环从保菌管中挑取少量菌液，在mrs固体平板中划线。放在37℃恒温培养箱中培养，直至长出单菌落。

菌种培养：用接种环挑取mrs固体培养基上的单菌落至mrs液体培养基中，37℃静置培养14-18h。之后，1％接种量转移至液体mrs培养基中，37℃静置培养14-18h。每次活化，都以1％接种量接种，37摄氏度培养14-18h。

菌载量测定：小鼠麻醉、处死后，取回肠、盲肠、结肠内容物，称重，梯度稀释，计数；取肝脏、脾脏，匀浆，梯度稀释，计数。

计数方法：样品在含有50mg/l链霉素的麦康凯琼脂平板上涂布，37℃培养12h左右至长出菌落。

本发明所提供的戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)在以下实施例中简写为戊糖乳杆菌at6。由于目前未见关于戊糖乳杆菌抑制沙门氏菌的文献报道，以能够抑制沙门氏菌的鼠李糖乳杆菌为对照。

实施例1：戊糖乳杆菌at6培养物上清与沙门氏菌共培养

(1)戊糖乳杆菌at6培养物上清的制备

戊糖乳杆菌at6、鼠李糖乳杆菌lgg(即鼠李糖乳杆菌atcc53103)传代之后，37℃培养18h后离心，测培养物上清ph，同时用盐酸或dl-乳酸调节mrs液体培养基至与at6培养物上清相同ph(ph3.81)作为对照组。培养物上清及对照组用孔径为0.22微米的无菌滤膜过滤待用。

(2)沙门氏菌培养物的制备

鼠伤寒沙门氏菌sl1344的培养基为lb培养基，沙门氏菌以2％(2ml/100ml)的接种量在lb培养基中进行活化培养后，37℃225rpm震荡培养12h。

(3)戊糖乳杆菌at6培养物上清与沙门氏菌共培养

向5mllb液体培养基中分别加入50μl戊糖乳杆菌at6、鼠李糖乳杆菌lgg的培养物上清或对照组mrs培养基，后分别加入50μl2.0×10⁹cfu/ml的沙门氏菌进行共培养。37℃静置培养24h，在不同时间测共培养物的od600。

结果如图1所示：培养4h时，添加at6培养物上清、lgg培养物上清、mrs培养基、用hcl调节ph为3.81的mrs、用dl-乳酸调ph至3.81的mrs组的od600分别为0.026、0.037、0.574、0.278、0.042；12h时at6、lgg、mrs、hcl-3.81、la-3.81组od600分别为0.038、0.178、0.705、0.525、0.233；培养24h时at6、lgg、mrs、hcl-3.81、la-3.81组od600分别为0.133、0.315、0.781、0.603、0.246，说明戊糖乳杆菌at6能够显著抑制沙门氏菌的生长，其抑制效果甚至优于有机酸的效果。

实施例2：戊糖乳杆菌at6对沙门氏菌黏附ht-29细胞的抑制作用

(1)将戊糖乳杆菌at6和鼠李糖乳杆菌lgg传代之后，在mrs培养基中于37℃培养18h后离心，用pbs洗三遍，并用1640培养基(购买自gibco)将菌体重悬至1.0×10⁸cfu/ml。

(2)沙门氏菌在lb培养基中进行活化培养后，静置培养12h，用pbs洗三遍，并用1640培养基将菌体重悬至1.0×10⁸cfu/ml。

(3)ht-29细胞的制备：ht-29生长所需的培养基为1640培养基，加5％(v/v)胎牛血清(fbs)，无需添加青霉素/链霉素。ht-29细胞活化之后，在6孔板中长至单层，待用。

(4)抑制黏附测定：将ht-29细胞用pbs洗三遍，每孔加1ml戊糖乳杆菌at6、1ml鼠李糖乳杆菌lgg或1640培养基(对照组)，二氧化碳培养箱中培养1h；再向每孔中加入1ml步骤2培养的沙门氏菌悬液，二氧化碳培养箱中培养1h；pbs洗三遍，每孔中加0.5％tritonx-100，20min后用移液器吹打混匀；梯度稀释，用加50mg/l链霉素的lb固体培养基倾注、待长出菌落后计数。

con组为对照组，加沙门氏菌前，6孔板中每孔加1ml1640培养基；lgg组为在加沙门氏菌前向6孔板中每孔加1ml1.0×10⁸cfu/ml的鼠李糖乳杆菌lgg菌悬液；at6组为在加沙门氏菌前向6孔板中每孔加1ml1.0×10⁸cfu/ml的戊糖乳杆菌at6菌悬液。

结果如图2所示，con、lgg、at6组每孔细胞黏附沙门氏菌数量的log值分别为6.20、5.98、5.81。

实施例3：戊糖乳杆菌at6对沙门氏菌侵袭ht-29细胞的抑制作用

(1)将戊糖乳杆菌at6和鼠李糖乳杆菌lgg传代之后，在mrs培养基中于37℃培养18h后离心，用pbs洗三遍，并用1640培养基(购买自gibco)将菌体重悬至1.0×10⁸cfu/ml。

(2)沙门氏菌在lb培养基中进行活化培养后，静置培养12h，用pbs洗三遍，并用1640培养基将菌体重悬至1.0×10⁸cfu/ml。

(3)ht-29细胞的制备：ht-29生长所需的培养基为1640培养基，加5％(v/v)胎牛血清(fbs)，无需添加青霉素/链霉素。ht-29细胞活化之后，在6孔板中长至单层，待用。

(4)抑制侵袭实验：将ht-29细胞用pbs洗三遍，每孔加1ml戊糖乳杆菌at6、1ml鼠李糖乳杆菌lgg或1640培养基(对照组)，二氧化碳培养箱中培养1h；再向每孔中加入1ml步骤2培养的沙门氏菌悬液，二氧化碳培养箱中培养1h；pbs洗三遍，每孔中加1ml庆大霉素，37℃处理45min；pbs洗三遍；每孔中加0.5％tritonx-100，20min后用移液器吹打混匀；梯度稀释，用加50mg/l链霉素的lb固体培养基倾注、待长出菌落后计数。

con组为对照组，加沙门氏菌前，6孔板中每孔加1ml1640培养基；lgg组为在加沙门氏菌前向6孔板中每孔加1ml1.0×10⁸cfu/ml的鼠李糖乳杆菌lgg菌悬液；at6组为在加沙门氏菌前向6孔板中每孔加1ml1.0×10⁸cfu/ml的戊糖乳杆菌at6菌悬液。

结果如图3所示，con、lgg、at6组每孔细胞黏附沙门氏菌数量的log值分别为6.04、5.68、5.49。

实施例4：戊糖乳杆菌at6对沙门氏菌感染后小鼠肠道内容物菌载量和肝脏、脾脏沙门氏菌检出率的影响

小鼠为c57bl/6品系，雌性、6-8w，spf级，10只/组，分为3组。

模型组——pbs灌胃10天，0.1ml/天，第11天灌胃沙门氏菌1.0×10⁶cfu/mouse；

预防组——戊糖乳杆菌at6灌胃10天，0.1ml(5×10⁸cfu)/天，第11天灌胃沙门氏菌1.0×10⁶cfu/mouse；

对照组——鼠李糖乳杆菌lgg灌胃10天，0.1ml(5×10⁸cfu)/天，第11天灌胃沙门氏菌1.0×10⁶cfu/mouse

具体步骤如下：

(1)戊糖乳杆菌at6、鼠李糖乳杆菌lgg活化传代之后，37℃培养18h后离心，用pbs洗三遍，重悬至5×10⁹cfu/ml。

(2)处理小鼠：模型组pbs灌胃，预防组戊糖乳杆菌at6灌胃，对照组鼠李糖乳杆菌lgg灌胃，处理10天。

(3)第11天灌胃沙门氏菌，1.0×10⁶cfu/mouse。

将处理2天后的小鼠处死，测定菌载量。

肝脏和脾脏菌载量结果如图4所示，liver-con、liver-lgg、liver-at6、spleen-con、spleen-lgg、spleen-at6肝脏菌载量分别为7.7cfu、0.7cfu、0cfu、3.9cfu、1.6cfu、0cfu。

回肠、盲肠、结肠内容物菌载量如图5所示，ileum-con、ileum-lgg、ileum-at6、cecum-con、cecum-lgg、cecum-at6、colon-con、colon–lgg、colon-at6菌载量的log值分别为2.58、1.04、0.75、2.85、1.32、0.92、2.37、0.86、0.37。

实施例5：戊糖乳杆菌at6摄入后沙门氏菌感染后小鼠死亡率的变化

小鼠为c57bl/6品系，雌性、6-8w，spf级，10只/组，分为三组。

空白对照组——pbs灌胃10天，0.1ml/天，第11天灌胃pbs；

模型组——pbs灌胃10天，0.1ml/天，第11天灌胃沙门氏菌1.0×10⁶cfu/mouse；

预防组——戊糖乳杆菌at6灌胃10天，0.1ml(5×10⁸cfu)/天，第11天灌胃沙门氏菌1.0×10⁶cfu/mouse；

阳性对照组——鼠李糖乳杆菌lgg灌胃10天，0.1ml(5×10⁸cfu)/天，第11天灌胃沙门氏菌1.0×10⁶cfu/mouse。

具体步骤如下：

(1)戊糖乳杆菌at6、鼠李糖乳杆菌lgg，37℃培养18h后离心，用pbs洗三遍，重悬至5×10⁹cfu/ml。

(2)处理小鼠：对照组和模型组pbs灌胃，预防组戊糖乳杆菌at6灌胃，阳性对照组鼠李糖乳杆菌lgg，共处理10天。

(3)沙门氏菌感染：第11天灌胃沙门氏菌，1.0×10⁶cfu/mouse。

(4)死亡率观察：每天观察各组小鼠死亡情况，并记录。

结果显示：每组20只小鼠，沙门氏菌灌胃后15天，对照组小鼠死亡0只，死亡率为0％；模型组(model)小鼠死亡12只，死亡离60％即存活率40％；处理组(戊糖乳杆菌at6)小鼠死亡7只，死亡率为35％即存活率65％；对照组(鼠李糖乳杆菌lgg)小鼠死亡8只，死亡率40％及存活率60％。戊糖乳杆菌at6处理使沙门氏菌引起的小鼠死亡率在15天时降低了25％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。