防治灰霉病生防菌间型假丝酵母C410及其悬浮剂和应用的制作方法

本发明涉及生物农药技术领域，具体地指一株防治灰霉病生防菌间型假丝酵母c410及其悬浮剂和应用。

背景技术：

由灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)引起的果蔬灰霉病是世界性分布的重要病害。这种病菌对一些重要的蔬菜和水果如番茄、黄瓜、葡萄、草莓等果蔬的产量和品质构成了极大威胁，一般可使果蔬减产20％以上，严重时甚至绝产。近年来，随着果蔬设施栽培面积迅速扩大，而大棚内小气候环境十分有利于灰霉病的发生发展，导致茄果类、瓜类、葱韭类、浆果类果蔬的减产，造成很大的经济损失。灰霉病已成为限制果蔬产量和品质的重要因素。由于灰葡萄孢菌是一个死体营养型病原菌，寄主范围广，生产上又缺乏抗病品种，目前防治灰霉病的主要手段是喷施化学农药。但是化学农药的长期使用导致灰霉病产生抗药性，以及农药在果蔬和环境中的残留也造成了果蔬和环境的农药污染。

近年来，生物防治已成为灰霉病的一种重要防治措施，因为其对灰霉病防效显著且对环境安全，同时不会诱导病菌产生抗性，对人畜无毒，应用前景广泛，是近年来研究的重点。利用酵母菌来防治果蔬病害越来越受人们的重视，这是因为酵母菌与其它生防微生物相比，具有很多优点：

第一、酵母菌适应力强定殖快，对环境的要求不高，具有较强的抗逆能力；

第二、酵母菌一般不产生抗菌素，可以避免病原菌对抗菌素产生抗性，也可以避免抗菌素可能对人体产生潜在的不利影响；

第三、酵母菌容易被大众接受，已在食品和酿造工业中有广泛的应用，是人类直接食用最多的一类微生物。

但是，目前没有生物防治灰霉病的报道，

技术实现要素：

本发明针对灰霉病生防菌间型假丝酵母制剂的空白，提供了一株防治灰霉病生防菌间型假丝酵母c410及其悬浮剂和应用。

为实现上述目的，本发明保护的一株间型假丝酵母c410菌株，该菌株命名为间型假丝酵母c410candidaintermediac410，其保藏编号为cctccno：m2017036。

该菌株分离自湖北武汉地区健康草莓叶片。c410菌株通过形态学观察和分子生物学鉴定，将该菌株鉴定为间型假丝酵母(candidaintermedia)。因此将菌株c410定名为间型假丝酵母(candidaintermedia)c410。

该菌种已于2017年1月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)；保藏登记号为cctccm2017036；保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。

进一步地，所述间型假丝酵母c410菌株形成的菌落呈卵圆形，乳白色，表面有磨砂状粗糙感，质地粘稠，具有芳香味，直径0.2～0.5cm，前期菌落边缘较整齐，后期菌落边缘形成发散性树枝状分枝的丝状边缘。所述间型假丝酵母c410菌株在显微镜下，菌株以出芽生殖方式形成假菌丝；单细胞为卵圆形或椭圆形，其长×宽为3～5μm×2～4μm，细胞为多边芽殖，未见有子囊孢子和掷孢子产生。半厌氧条件下，该酵母c410菌株能够发酵d-葡萄糖、麦芽糖、d-半乳糖、果糖和蔗糖，但不能发酵乳糖和淀粉。有氧环境下，该酵母菌c410可以同化d-葡萄糖、麦芽糖、d-半乳糖、乳糖、d-木糖、柠檬酸、蔗糖、果糖、海藻糖、l-阿拉伯糖、甘油、甘露醇、山梨醇和乙醇，不能同化d-阿拉伯糖、淀粉、乳酸、甲醇和肌醇。在氮源同化测定试验中，该酵母c410菌株能够同化l-赖氨酸和硫酸铵，但不能同化硝酸盐、亚硝酸盐及肌酸。该酵母c410菌株能产生芳香的酯类物质，可以耐较高渗透压，代谢不产生酸和淀粉，无法水解尿素，不能在42℃生长。

本发明还保护了一种间型假丝酵母c410菌株防治灰霉病中的应用，所述间型假丝酵母c410菌株抑制灰葡萄孢菌分生孢子萌发和菌丝生长，减轻番茄叶片和果实感染灰霉病。

本发明还保护了一种间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液，所述c410菌株细胞悬浮液为含有间型假丝酵母c410细胞的磷酸缓冲液，其中，所述磷酸缓冲液中间型假丝酵母c410细胞数目为2～3×10⁹个/ml。

进一步地，所述c410菌株细胞悬浮液中还含有海藻糖和抗坏血酸vc，其中，c410菌株细胞悬浮液中海藻糖和抗坏血酸vc含量分别为3～5％和0～0.02％。

本发明提供了一种间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：

1)将间型假丝酵母c410菌株的菌液划线接种在ypda培养基上培养，得到间型假丝酵母c410菌落；

2)将步骤1)得到的间型假丝酵母c410菌落挑取再接种到ypd液体培养基上培养，得到c410种子发酵液，待用；

3)将步骤2)得到的c410种子发酵液滴加至ypda平板上，用涂布器涂匀吹干后培养；

4)向步骤3)中ypda培养皿上加入无菌水，刮洗菌落表面的酵母细胞，得到酵母细胞液，离心浓缩，弃上清，并将酵母细胞重新悬浮于磷酸缓冲液ppb中清洗，然后再次离心浓缩，弃上清，并将酵母细胞重悬浮于磷酸缓冲液中，再加入海藻糖和抗坏血酸vc，即得到间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液。

作为优选方案，所述间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液中间型假丝酵母c410细胞数目为2～3×10⁹个/ml；c410菌株细胞悬浮液中海藻糖和抗坏血酸vc含量分别为3～5％和0～0.02％。

作为优选方案，所述步骤1)中，培养条件为在温度为20～22℃，黑暗条件下培养72～75h；所述步骤2)中，培养条件为在温度为20～22℃，150～180r/min的条件下振荡、黑暗培养72～75h；

所述步骤3)中，培养条件为在温度为20～22℃，黑暗条件下培养72～75h；

所述步骤4)中，两次离心浓缩的条件均为在温度为4℃，

8000～9000r/min的条件下离心10～12min。

其中，ypda培养基的配方：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，琼脂20g,补充蒸馏水至1000ml；

ypd培养基的配方：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，补充蒸馏水至1000ml；

ypda培养基和ypd培养基均需121℃灭菌20min后使用。

ppb磷酸缓冲液的配方：1mk2hpo427.8ml,1mkh2po472.2ml，混合均匀后稀释至50mm。

本发明还保护了上述间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液在抑制灰葡萄孢分生孢子萌发中的应用。

本发明还保护了上述间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液在防治番茄灰霉病的药剂中应用。其通过对番茄叶片灰霉病和番茄果实灰霉病进行抑制，从而起到防治的作用。

本发明的有益效果在于：

1)本发明的间型假丝酵母c410菌株的细胞悬浮液对大棚番茄灰霉病的抑制作用。

2)本发明的间型假丝酵母c410菌株的细胞悬浮液在ypda平板、番茄叶片和番茄果实上对灰霉病菌菌丝生长、分生孢子萌发和对番茄叶片和果实侵染的抑制作用。

附图说明

图1为间型假丝酵母c410菌株的菌落形态(pda，20℃,3d)；

图中，a：菌落形态；b：菌落边缘形态；c：假菌丝；d：菌细胞形态及其芽殖；

图2为间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液对灰葡萄孢分生孢子萌发的抑制图；

图中，图2a为不同浓度间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液处理后灰葡萄孢分生孢子萌发后第3天形成的菌落直径；

图2b为不同浓度间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液处理后灰葡萄孢分生孢子萌发后第5天的菌落直径；

图2c为不同浓度间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液处理后灰葡萄孢分生孢子萌发后第3天和第5天的菌落形态图；

图3为间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液对番茄叶片灰霉病的抑制图；

图4为间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液对番茄果实灰霉病的抑制图；

图中，图4a为不同浓度间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液处理后第7天番茄果实灰霉病的发病严重度；

图4b为不同浓度间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液处理后第14天番茄果实灰霉病的发病严重度。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1：间型假丝酵母c410菌株的分离及鉴定

一、菌株的分离

微生物是在湖北武汉地区健康草莓叶片上分离的一株间型假丝酵母菌株。其分离方法为：取10g健康草莓叶片样品，剪碎后放入已灭菌的研钵中，加入10ml含0.2％吐温-20的无菌水，反复研磨至糊状后，用无菌水分别稀释10倍，100倍，1000倍。将稀释液用两层灭菌的纱布过滤，取滤液涂在含有0.01％链霉素的pda平板，100μl/皿，每个浓度5个皿，每个样品处理共15个皿，20℃条件下培养2～3d，挑取单菌落至新鲜的含有0.01％链霉素的pda平板上划线纯化，再挑取单菌落。将所分离的酵母菌株在于pda平板(φ＝9cm)一侧(接种线距离培养皿边缘约1cm)划线接种，在平板另一侧接种灰霉病菌菌丝块(φ＝6mm)，在20℃下培养，观察灰霉病菌菌落边缘是否形成抑菌带，记录抑菌带宽度。挑取有拮抗作用菌株供进一步筛选用。经过反复筛选最终获得一株对灰霉病菌具有较强抑制作用的酵母菌株c410。酵母菌株c410的细胞悬浮液在离体和活体草莓叶片和果实上对草莓灰霉病都具有显著的防治效果。

二、菌株的鉴定

参照传统的酵母菌分类鉴定方法对酵母菌c410的形态学和生理生化特性进行了鉴定。酵母菌c410在马铃薯葡萄糖琼脂(pda)、酵母膏胨葡萄糖琼脂(ypd)、豆芽汁葡萄糖琼脂和牛肉膏蛋白胨琼脂(na)等培养基上的培养形态类似，如在pda培养基上形成的菌落呈卵圆形，乳白色，表面有磨砂状粗糙感，质地粘稠，具有芳香味，直径0.2cm～0.5cm，前期菌落边缘较整齐，后期菌落边缘形成发散性树枝状分枝的丝状边缘。载玻片上划线培养1周，显微镜下观测假菌丝的形成。发现其是以出芽生殖方式形成假菌丝。单细胞为卵圆形或椭圆形，3μm～5μm×2μm～4μm(长×宽)，细胞为多边芽殖。未见有子囊孢子和掷孢子产生。半厌氧条件下，该酵母菌c410能够发酵d-葡萄糖、麦芽糖、d-半乳糖、果糖和蔗糖，但不能发酵乳糖和淀粉。有氧环境下，该酵母菌c410可以同化d-葡萄糖、麦芽糖、d-半乳糖、乳糖、d-木糖、柠檬酸、蔗糖、果糖、海藻糖、l-阿拉伯糖、甘油、甘露醇、山梨醇和乙醇，不能同化d-阿拉伯糖、淀粉、乳酸、甲醇和肌醇。在氮源同化测定试验中，该酵母菌c410能够同化l-赖氨酸和硫酸铵，但不能同化硝酸盐、亚硝酸盐及肌酸。该酵母菌c410能产生芳香的酯类物质，可以耐较高渗透压，代谢不产生酸和淀粉，无法水解尿素，不能在42℃生长。综合以上培养特征、培养形态及其生理生化特征，该酵母菌c410与《酵母菌的特征与鉴定手册》中的间型假丝酵母(candidaintermedia)这一种群的相关特征描述相似。在此基础上，进一步将上述酵母菌株进行基于its序列的分子鉴定。通过pcr扩增得到其its序列，将此序列在ncbi上进行blast同源比对和系统进化树分析，鉴定结果为间型假丝酵母(candidaintermedia)，即为间型假丝酵母(candidaintermedia)c410，该菌种已于2017年1月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)；保藏登记号为cctccm2017036；保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。

实施例2：间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液对灰霉分生孢子的抑制作用

在ypda平板中心用5mm直径打孔器移去培养基获得孔洞，用移液器分别将20μl不同浓度(3×10⁸，3×10⁷，3×10⁶，6×10⁵和6×10⁴cfu/ml)的c410细胞悬浮液滴加到每皿的孔洞中，再将20μl灰霉病菌分生孢子液(2×10⁵孢子/ml)注入各皿的孔洞，对照处理为孔洞中加入20μl无菌水和20μl灰霉病菌分生孢子液(2×10⁵孢子/ml)。然后将个培养皿正置于20℃条件下培养，在第3d和第5d分别观察培养皿内灰霉病菌的菌落生长情况，用十字交叉法记录其菌落直径(图2)。

实施例3：间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液对番茄叶片灰霉病的抑制作用

供试番茄材料：合作903(番茄大王)。采集新鲜番茄叶片用蒸馏水漂洗干净，自然风干表面水滴后，置于铺有湿润吸水纸的方盒中，将直径5mm的灭菌滤纸片蘸取不同浓度(3×10⁸，3×10⁷，3×10⁶，6×10⁵和6×10⁴cfu/ml)的c410细胞悬浮液后覆盖在叶片中心，再用移液器分别吸取20μl灰霉病菌分生孢子液(2×10⁶孢子/ml)滴加到各滤纸片上。滤纸片上只滴加20μl灰霉病菌分生孢子液(2×10⁶孢子/ml)的叶片为对照处理。用保鲜膜覆盖盒口，置于20℃条件下培养，在第5d分别观察各叶片灰霉病的发病情况，用十字交叉法记录发病叶片的病斑直径(图3)。

实施例4：间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液对番茄果实灰霉病的抑制作用

供试番茄材料：合作903(番茄大王)。用无菌水冲洗新鲜的番茄果实，用75％酒精浸泡30s后再用无菌水漂洗3次，然后置于吸水纸上自然晾干。用无菌小刀在番茄果实表明中心处划出2×2×2mm(长×宽×深)的伤口，将直径5mm的灭菌滤纸片蘸取不同浓度(3×10⁸，3×10⁷，3×10⁶，6×10⁵和6×10⁴cfu/ml)的c410细胞悬浮液后覆盖在伤口上，再用移液器分别吸取20μl不同浓度(2×10⁶，2×10⁵，2×10⁴孢子/ml)的灰霉病菌分生孢子液滴加到个滤纸片上，滤纸片上只加有20μl不同浓度(2×10⁶，2×10⁵，2×10⁴孢子/ml)的灰霉病菌分生孢子液为对照处理。将各处理番茄果实放入铺有湿润吸水纸的塑料方盒中，用保鲜膜覆盖盒口，置于20℃条件下培养，在第7d和第14d分别观察各处理番茄果实灰霉病的发病情况(图4)。

将番茄果实灰霉病的发病严重程度分为0～8级：

0级：果实完全不发病；

1级：灰霉病发病面积≤番茄果实面积的1/8；

2级：番茄果实面积的1/8<灰霉病发病面积≤番茄果实面积的1/4；

3级：番茄果实面积的1/4<灰霉病发病面积≤番茄果实面积的3/8；

4级：番茄果实面积的3/8<灰霉病发病面积≤番茄果实面积的1/2；

5级：番茄果实面积的1/2<灰霉病发病面积≤番茄果实面积的5/8；

6级：番茄果实面积的5/8<灰霉病发病面积≤番茄果实面积的3/4；

7级：番茄果实面积的3/4<灰霉病发病面积≤番茄果实面积的7/8；

8级：番茄果实面积的7/8<灰霉病发病面积≤整个番茄果实发病。

实施例5：间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液防治番茄灰霉病的田间大棚试验

2013年春季的田间大棚小区试验安排在湖北省武穴市武穴街道吴谷英村进行，供试番茄品种为红宝石2号。该试验区为番茄大棚种植老区，灰霉病历年都有发生。该试验用番茄长势均匀一致。试验设三个处理：

(1)间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液(2×10⁹cfu/ml)，用量为30ml/亩；

(2)多菌灵50％可湿性粉剂，用量为30g/亩；

(3)对照为喷清水。每个处理设4个小区，各小区按随机区组排列，每小区种植140株番茄，小区面积为30m²。用背负式手动喷雾器于3月11日、3月18日和3月25日分三次将各处理制剂或对照的清水均匀喷于番茄植株各部位。在番茄盛花期和盛果期对各试验处理小区番茄逐株进行调查，统计各处理番茄植株的灰霉发病率及叶片、茎秆、花瓣、果实各部位的灰霉发病情况(表1)。

2014年春季的田间大棚大区试验安排在湖北省麻城市岐亭镇，供试番茄品种为gbs-坚强。该试验区为番茄大棚种植老区，灰霉病历年都有发生。该试验用番茄长势均匀一致。大区试验设三个处理：

(1)间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液(2×10⁹cfu/ml)，用量为30ml/亩；

(2)啶菌恶唑25％乳油剂，用量为100ml/亩；

(3)对照为喷清水。将一个温室大棚内的的番茄植株统一作为一个处理，每个大棚面积1亩，用电动喷雾器于3月18日、4月3日和4月14日分三次将各处理制剂或对照的清水均匀喷于番茄植株各部位。在番茄盛花期和盛果期对各试验处理大棚番茄随机选取25株作为一个取样点逐株进行调查，每个大棚选取10个取样点进行调查统计，统计各处理番茄植株的灰霉发病率及叶片、茎秆、花瓣、果实各部位的灰霉发病率(表2)。

表1.间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮剂对番茄灰霉病的防治效果(武穴)

表2.间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮剂对番茄灰霉病的防治效果(麻城)

由表1和表2可知，间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液处理的番茄植株发病率都比清水对照的低，间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液对番茄灰霉病的防治效果与商品杀菌剂(多菌灵50％可湿性粉剂和啶菌恶唑25％乳油剂)相当，或略低于商品杀菌剂。田间实验结果表明间型假丝酵母c410菌株细胞悬浮液对番茄灰霉病具有较好的防治作用，具有良好的生防价值，可以对其进行进一步地开发与应用。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。