一种泛生菌酰胺酶突变体、基因、工程菌及其应用的制作方法

文档序号：14241485阅读：216来源：国知局

(一)技术领域

本发明涉及一种2-氯烟酸的制备方法，特别涉及一种泛生菌酰胺酶突变体、编码基因，及其在水解2-氯烟酰胺制备农药、医药中间体2-氯烟酸中的应用。

(二)

背景技术：

2-氯烟酸(2-chloronicotinicacid，简称2-ca)，又称2-氯-3-吡啶甲酸，属于烟酸的2位氯代化合物。2-氯烟酸是一种重要的精细化工中间体，广泛应用于农药和医药工业。在农药领域，2-氯烟酸可用于合成杀菌剂、杀虫剂和除草剂等，如烟嘧磺隆、吡氟草胺等(农药,2003,42,5-8；农药,2013,565-567)；在医药领域，可用于合成多种抗生素、心血管疾病治疗药物等，如抗艾滋病药物奈韦拉平，抗抑郁药物米氮平，非甾体消炎镇痛药尼氟灭酸、普拉洛芬以及烟甲灭酸等(化学与生物工程,2008,25,5-8；药学研究,2009,28,485-487；us5,569,760；精细化工中间体,2009,39,37-39)。2016年国内2-氯烟酸的需求量达3350吨(合成化学,2016,620-623)，市场需求巨大，应用前景广阔。

目前，2-氯烟酸的工业生产主要采用化学法，可分为两大方法(合成化学,2011,19,285-286)：一是基于已有的吡啶环母体(cn101817781；cn104513198；cn103848783)，直接进行氯化或引入相应官能团；二是利用适当的活性直链化合物，通过接枝和闭环反应合成(cn102993092；cn103193705；cn104592104)。然而，以上两种化学法均存在工艺步骤冗长，条件苛刻，收率低，副产物多，环境负担重等问题。近年来，生物催化因其环境友好、选择性高、能耗低、催化剂可降解等优点，已迅速发展成为大宗及精细化学品制造的重要方法。因此，开发能够高效制备2-氯烟酸的生物催化剂具有重要意义。

目前，有关生物法制备2-氯烟酸的研究较少，主要是利用酰胺酶水解2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸(cn101857889；newbiotechnol.,2011,28,610-615；catal.commun.,2013,38,6-9；proteinexpres.purif.,2016,126,16-25；enzymemicrob.technol.,2016,86,93-102)。酰胺酶(amidase，ec3.5.1.x)是一类能够催化酰胺键断裂生成相应羧酸的水解酶，底物谱广，能高效催化各种脂肪族、芳香族以及杂环族酰胺水解。酰胺酶因其具有良好的化学和立体选择性，在医药、农药中间体制备方面中极具潜力，日益受到工业界重视。然而，已有的研究报道表明，酰胺酶水解2-氯烟酰胺的催化效率普遍较低。因此，提高酰胺酶催化2-氯烟酰胺的水解效率，以实现工业应用十分必要。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的是通过蛋白质定点饱和突变技术对泛生菌来源的酰胺酶(pa-ami)进行改造，提供一种突变体蛋白，提高其对2-氯烟酰胺的水解活力，从而有利于该酰胺酶在2-氯烟酸合成中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明通过对来源于pantoeasp.(genbankno.wp008109374)的泛生菌酰胺酶基因进行克隆表达，利用全质粒pcr技术对包含泛生菌酰胺酶基因的表达载体进行定点饱和突变，构建突变文库。利用基于真实底物的96孔板高通量筛选模型进行筛选，获得一系列对2-氯烟酰胺活力明显提升的酰胺酶突变体，高效合成2-氯烟酸。最终本发明提供一种来源于泛生菌酰胺酶突变体，酰胺酶突变体是将seqidno.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第105位、175位、301位、305位或309位进行单突变或多突变获得的。

进一步，优选所述泛生菌酰胺酶突变体是将seqidno.2所示氨基酸序列进行以下的点突变：(1)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸；(2)第301位的苏氨酸突变为亮氨酸；(3)第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(4)第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(5)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸的同时将第301位的苏氨酸突变为亮氨酸；(6)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸的同时将第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(7)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(8)第301位的苏氨酸突变为亮氨酸的同时将第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(9)第301位的苏氨酸突变为亮氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(10)第305位的丙氨酸突变为苏氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(11)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸并且第301位的苏氨酸突变为亮氨酸的同时将第305位的丙氨酸突变为苏氨酸；(12)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸并且第301位的苏氨酸突变为亮氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(13)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸并且第305位的丙氨酸突变为苏氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(14)第301位的苏氨酸突变为亮氨酸并且第305位的丙氨酸突变为苏氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸；(15)第175位的甘氨酸突变成丙氨酸并且第301位的苏氨酸突变为亮氨酸并且第305位的丙氨酸突变为苏氨酸的同时将第309位的丝氨酸突变为酪氨酸。

进一步，优选所述酰胺酶突变体是seqidno.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第175位甘氨酸突变为丙氨酸，氨基酸序列为seqidno.4，核苷酸序列为seqidno.3。

更进一步，优选所述酰胺酶突变体是seqidno.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第175位甘氨酸突变为丙氨酸，同时将305位丙氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为seqidno.6，核苷酸序列为seqidno.5。

本发明还提供一种所述泛生菌酰胺酶突变体编码基因及编码基因构建的重组基因工程菌。

本发明还涉及一种所述泛生菌酰胺酶突变体在催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸中的应用，具体所述的应用以含泛生菌酰胺酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2-氯烟酰胺为底物，以ph为7.5～8.5(优选ph值为8.0)的缓冲液(优选tris-hcl缓冲液)为反应介质构成反应体系，在30～60℃、150～500r/min条件下(优选40℃、200r/min)进行转化反应，反应结束后取反应液分离纯化，获得2-氯烟酸。所述反应体系中，底物初始浓度为50～300mm(优选200mm)，所述催化剂的用量以湿菌体重量计，终浓度为1～10g/l反应体系(优选10g/l)。

进一步，所述底物以补料形式加入，当反应体系中底物残留浓度低于上一次(即补料前的总加入量)加入量20％时(即每隔10～60min(优选15min))，补加终浓度50～200mm的底物(优选100mm)。

本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含泛生菌酰胺酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、150r/min培养12h，随后以体积浓度1％接种量转接到新鲜的含终浓度50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、150r/min培养至菌体浓度od600为0.4～0.8，再向培养基中加入终浓度为0.1～1mm的iptg(优选0.1mm)，28℃、150r/min诱导培养12h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。lb液体培养基组成为(g/l)：蛋白胨10，酵母提取物5，nacl10，溶剂为去离子水，ph值为7.0；lb平板培养基组成为(g/l)：蛋白胨10，酵母提取物5，nacl10，琼脂15，溶剂为去离子水，ph值为7.0。

本发明所述的泛生菌酰胺酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以未经纯化的粗酶形式使用，还可以是经部分纯化或完全纯化的酶蛋白形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的酰胺酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式进行使用。

本发明的酰胺酶突变体较亲本活力大幅提高，在使用该酶的粗提取物或工程菌全细胞进行催化时，反应速率仍然保持较高状态。此外，本发明的酰胺酶突变体能够适应30～55℃的催化温度。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的泛生菌酰胺酶突变体较亲本活力提高2～3倍，对底物2-氯烟酰胺的耐受能力超过200mm，通过补料甚至超过1m，并且转化率仍能够保持在95％以上。利用本发明中所述的补料方法能够有效减轻2-氯烟酸对酰胺酶或菌体的产物抑制效应，在保证较高催化效率的同时使得产物2-氯烟酸尽可能地析出，方便产物的提取纯化。因此，本发明的酰胺酶突变体可用于酶法工业化生产2-氯烟酸。

(四)附图说明

图1为酰胺酶突变体g175a和酰胺酶突变体g175a/a305t及亲本酰胺酶全细胞催化2-氯烟酰胺(200mm)制备2-氯烟酸的反应进程对比。

图2为酰胺酶突变体g175a全细胞催化2-氯烟酰胺(初始浓度为200mm)制备2-氯烟酸的补料反应进程，箭头处为补料时间点。

图3为酰胺酶突变体g175a/a305t全细胞催化2-氯烟酰胺(初始浓度为200mm)制备2-氯烟酸的补料反应进程，箭头处为补料时间点。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：酰胺酶的定点饱和突变与筛选

定点饱和突变技术参考(appl.microbiol.biotechnol.,2014,98,2473-2483)的描述，阳性突变子的高通量筛选模型参考(cn100370034；appl.microbiol.biotechnol.,2007,74,256-262)的描述。具体过程如下：

对来源于pantoeasp.(genbankno.wp008109374)的泛生菌酰胺酶pa-ami(氨基酸序列为seqidno.2所示，核苷酸序列为seqidno.1所示)氨基酸序列中的第175位点的甘氨酸(gly，g)，第301位的苏氨酸(thr，t)，第305位的丙氨酸(ala，a)以及第309位的丝氨酸(ser，s)分别进行饱和突变，设计各突变引物(见表1)，以克隆有泛生菌酰胺酶pa-ami编码基因的质粒pet28-pa-ami为模板，进行全质粒扩增。pcr体系为：2×phantamaxbuffer25μl，dntpmixture(10mm)0.75μl，突变上游引物(50μm)和下游引物(50μm)各1μl，质粒pet28-pa-ami0.5μl，phantamaxdna聚合酶0.5μl，ddh2o补至50μl。pcr条件为95℃预变性2min；95℃变性15s，55-65℃退火15s，72℃延伸6.5min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。经0.9％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物为阳性后，取pcr产物20μl，加入1μldpnⅰ，37℃酶切2-3h去除模板质粒dna，于65℃下灭活10min，转化感受态细胞e.colibl21(de3)，涂布含卡那霉素(50mg/l)的lb平板，37℃培养过夜，获得超过300个克隆的突变体库。挑取单菌落分别接种到96孔培养板(装有1ml含50mg/l卡那霉素的lb培养基)中，37℃、150rpm培养至od600约0.5左右，然后加入终浓度为0.1mm的iptg，28℃下诱导12h。取新的96孔培养板，分别逐孔对应加入100μl培养的菌液，以2-氯烟酰胺(50mm)和盐酸羟胺(100mm)为底物，于50℃下反应30min。反应结束后，取100μl反应液加入到200μl显色液(355mmfecl3溶于0.65mhcl)中，以突变前的工程菌细胞为参照，根据显色体系颜色变化(黄绿色→深红色)的速度来进行判定，筛选出变色速度快于对照组的菌株作为初筛阳性菌。筛选获得的阳性克隆经活力测定验证后，从其中抽提质粒，经dna测序确定各阳性克隆子引入的点突变分别为第175位的甘氨酸突变为丙氨酸(g175a)，第301位的苏氨酸突变为亮氨酸(t301l)，第305位的丙氨酸突变为苏氨酸(a305t)以及第309位的丝氨酸突变为酪氨酸(s309y)，具体如表2所示。其中，g175a的活力最高，由此获得酰胺酶突变体工程菌e.colibl21(de3)/pet28-g175a。

表1：引物

注：n＝a/g/c/t，k＝g/t，m＝a/c，b＝g/c/t，h＝a/c/t，y＝c/t，r＝a/g，d＝a/g/t，v＝a/g/c，w＝a/t，s＝g/c。

实施例2：酰胺酶突变体g175a的多位点叠加饱和突变

饱和突变技术与阳性突变子的高通量筛选方法同实施例1。具体过程如下：

在酰胺酶突变体g175a的基础上对包括第301位苏氨酸突(thr，t)，第305位丙氨酸(ala，a)以及第309位丝氨酸(ser，s)等位点进行定点饱和突变，以酰胺酶突变体g175a的质粒pet28-g175a为模板，进行全质粒扩增。pcr体系为：2×phantamaxbuffer25μl，dntpmixture(10mm)0.75μl，突变上游引物(50μm)和下游引物(50μm)(引物序列见表1)各1μl，质粒pet28-g175a0.5μl，phantamaxdna聚合酶0.5μl，ddh2o补至50μl。pcr条件为95℃预变性2min；95℃变性15s，55-65℃退火15s，72℃延伸6.5min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。经0.9％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物为阳性后，取pcr产物20μl，加入1μldpnⅰ，37℃酶切2-3h去除模板质粒dna，于65℃下灭活10min，转化感受态细胞e.colibl21(de3)，涂布含卡那霉素(50mg/l)的lb平板，37℃培养过夜，获得超过300个克隆的突变体库。各饱和突变库的筛选同实施例1，不同的是所用对照增加一组实施例1所获得的g175a突变体细胞。筛选获得的阳性克隆经活力测定验证(表2)后抽提质粒，经dna测序确定引入的点突变，其中活力最高的阳性克隆dna测序显示为第305位的ala突变为thr(a305t)，由此获得酰胺酶突变体工程菌e.colibl21(de3)/pet28-g175a/a305t。

实施例3：亲本酰胺酶和酰胺酶突变体工程菌诱导表达及纯化

(1)诱导表达

将包括出发菌株e.colibl21(de3)/pet28-pa-ami和突变菌株e.colibl21(de3)/pet28-g175a(实施例1)，e.colibl21(de3)/pet28-g175a/a305t(实施例2)在内的各阳性突变体菌株分别接种到含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、150r/min下培养12h，随后以1％(v/v)接种量转接到新鲜的含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、150r/min培养至菌体浓度od600为0.4～0.8，再向培养基中加入终浓度为0.1mm的iptg，28℃、150r/min诱导培养12h，取培养物4℃、8000rpm离心15min，收集湿菌体，可用于酶活测定和生物催化制备2-氯烟酸。

(2)蛋白纯化及浓度测定

各取5g湿菌体悬浮于50mltris-hcl缓冲液(20mm，ph8.0)中，振荡摇匀后利用超声波细胞破碎仪破碎细胞20min。将菌体破碎液于4℃下，12,000rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清液(粗酶液)用于后续的分离纯化。采用biologiclp低压层析系统，通过ni-nta柱进行纯化，当出现吸收峰(aufs值大于0.1)后开始收集目的蛋白，直至出峰结束。随后将洗脱的酶液装入透析袋(截留分子量为14kd)置于20mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)中透析脱盐24h。以牛血清蛋白(bsa)为标准蛋白，利用考马斯亮蓝染色法测定透析后酶液的蛋白含量(anal.biochem.,1976,25,248-256.)。

实施例4：亲本酰胺酶和酰胺酶突变体的活性测定

分别测定实施例3中获得的纯化的亲本酰胺酶和酰胺酶突变体对2-氯烟酰胺的活力。根据实施例3中测得的酶蛋白浓度，用20mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)将对应的酶蛋白稀释至0.5mg/ml。反应体系组成(1ml)为：20mmtris-hcl(ph8.0)，50mm2-氯烟酰胺和10μl、0.5mg/ml酶蛋白稀释液，50℃下反应10min，随后取样100μl，加入20μl浓度为1m的hcl溶液终止反应，并补加超纯水至1ml，经孔径0.22μm微孔滤膜过滤后，进行液相色谱分析。所用液相色谱仪为日立primaide；色谱柱类型：c18柱，5μm×250mm×4.6mm；流动相：乙腈：水：磷酸＝250：750：1(v/v/v)；色谱条件：柱温40℃，检测波长270nm，流速1ml/min。酶活单位(u)定义：在50℃、ph8.0条件下，每分钟催化2-氯烟酰胺生成1微摩尔2-氯烟酸所需的酶量作为一个活力单位(u)。亲本酰胺酶pa-ami及部分突变体活力见表2，突变体活力较亲本明显提高，其中双突变体g175a/a305t的活力为亲本的3.7倍。

表2：酰胺酶突变体与亲本酰胺酶的活力比较

实施例5：酰胺酶突变体全细胞催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸(一)

以实施例3中获得的酰胺酶突变体e.colibl21(de3)/pet28-g175a湿菌体细胞为催化剂，以2-氯烟酰胺为底物制备2-氯烟酸。10ml反应体系为：200mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)，200mm2-氯烟酰胺，10g/l湿菌体，于40℃、200r/min下反应。反应期间取样(100μl)，利用液相色谱检测跟踪反应进程(见图1)，液相色谱检测条件同实施例4。由图1可知，终浓度为10g/l的酰胺酶突变体g175a湿菌体能够快速催化200mm2-氯烟酰胺水解，仅需20min左右转化率就超过98％。

实施例6：酰胺酶突变体全细胞催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸(二)

以实施例3中获得的酰胺酶双突变体菌株e.colibl21(de3)/pet28-g175a/a305t湿菌体细胞为催化剂，以2-氯烟酰胺为底物制备2-氯烟酸，同样条件下的出发菌株e.colibl21(de3)/pet28-pa-ami和酰胺酶突变体菌株e.colibl21(de3)/pet28-g175a作为对照。反应条件同实施例5，检测条件同实施例4。由图1可知，亲本酰胺酶pa-ami催化效率较低，在反应达到120min时转化率仍未超过98％，而在相同底物浓度下，双突变体g175a/a305t仅需催化15min，转化率就达到98.6％。此外，双突变体g175a/a305t对2-氯烟酰胺的水解能力也优于单突变体g175a。

实施例7：酰胺酶突变体全细胞催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸(三)

以实施例3中获得的酰胺酶出发菌株e.colibl21(de3)/pet28-pa-ami(对照组)和突变体e.colibl21(de3)/pet28-g175a湿菌体细胞为催化剂，以2-氯烟酰胺为底物制备2-氯烟酸。10ml反应体系为：200mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)，初始浓度为200mm的2-氯烟酰胺，10g/l湿菌体，于40℃、200r/min下进行反应。当底物残留浓度低于上一次加入量20％时，补加终浓度100mm的2-氯烟酰胺。最终，对照组补料了2次，体系中2-氯烟酰胺的最终累计总量为400mm；而突变体g175a总共进行9次补料，体系中2-氯烟酰胺的最终累计总量为1100mm。反应期间取样(100μl)，利用液相色谱检测跟踪反应进程(见图2)，液相色谱检测条件同实施例4。由图2可知，突变体g175a催化2-氯烟酸的最终累积产量高达1055mm，总转化率达到95.9％；而对照组中，pa-ami催化2-氯烟酸的最终累积产量仅370mm，总体转化率为94.2％。

实施例8：酰胺酶突变体全细胞催化2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸(四)

以实施例3中获得的酰胺酶双突变体菌株e.colibl21(de3)/pet28-g175a/a305t湿菌体细胞为催化剂，以2-氯烟酰胺为底物制备2-氯烟酸。10ml反应体系为：200mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)，初始浓度为200mm的2-氯烟酰胺，10g/l湿菌体，于40℃、200r/min下进行反应。当底物残留浓度低于上一次加入量20％时，补加终浓度100mm的2-氯烟酰胺，总共进行11次补料，体系中2-氯烟酰胺的最终累计总量为1300mm。反应期间取样(100μl)进行液相色谱检测反应进程(见图3)，液相色谱检测条件同实施例4。由图3可知，2-氯烟酸的最终累积产量高达1250mm，总转化率达到96.1％。

本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内作各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>一种泛生菌酰胺酶突变体、基因、工程菌及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1416

<212>dna

<213>泛菌属(pantoeasp.)

<400>1

atgaataacctgcattacaaatctctgctggaaatcggtcgcctgatccaatctggtgaa60

atctcctctgttgaagtgacgcaaaccctgctgacgcgtattgataccctggatcgcgac120

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<211>471

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<213>泛菌属(pantoeasp.)

<400>2

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151015

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<210>3

<211>1416

<212>dna

<213>泛菌属(pantoeasp.)

<400>3