一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽的制作方法

本发明涉及一种降血脂寡肽，具体涉及一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽。

背景技术：

血脂是血浆中甘油三酯、胆固醇等中性脂肪和糖脂与类固醇等类脂的总称。高脂血症属体内血脂代谢异常所致，因血脂过高诱发的动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死等心脑血管疾病已严重威胁人类健康。随着现代人们生活水平的不断提高和生活方式的改变，由于不良饮食结构及不健康的生活习惯致使高脂血症患者与日俱增，并且正朝着年轻化的趋势发展。因此，降血脂功效成分筛选和降血脂药物开发的相关研究备受学术界关注。

寡肽（bioactivepeptides）是3至9个氨基酸组合的肽类的总称。人体很多活性物质都是以肽的形式存在的。肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制dna转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应。但现代人面临着环境恶化、工作压力和现代饮食结构的隐患，造成人体生理机能的紊乱，人体自身合成肽的能力大大减弱，必须通过体外合成的活性肽补充原肽物质以养自身

鮸鱼（miichthysmiiuy）分布于北太平洋西部，包括中国的渤海、黄海及东海、朝鲜和日本南部。中国生产鮸鱼，尤以东海的舟山群岛产量最大，是我国经济价值较高的海产经济鱼类之一。鮸鱼肉质鲜美，含有丰富的维生素及钙、磷、铁等微量元素，是传统的滋补食材，具有养血、补肾、润肺健脾和消炎作用。但目前以鮸鱼鱼肉为原料，利用酶解工艺制备降血脂肽未见报道。因此，申请人以鮸鱼鱼肉为原料，利用酶解技术制备一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有降血脂作用的鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其既能下调成脂基因，又能促进脂肪酸β氧化，减少脂质的生成，降脂质水平大于脂质生成能力，具有较好的降脂活性，且安全无毒副作用，可作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。

本发明为解决上述技术问题所采取的方案为：一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，降血脂寡肽为五肽化合物，降血脂寡肽的氨基酸序列为val-ile-ala-pro-trp（viapw），降血脂寡肽的esi-ms测定分子量为584.72da。

作为优选，一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其制备方法具体包括下述步骤：

1）鮸鱼鱼肉预处理：鮸鱼去鱼皮和鱼骨，鱼肉匀浆至糊状后，按料液比1g:4～6ml加入乙酸乙酯溶液，搅拌脱脂20～26h，过滤，干燥，得脱脂鮸鱼鱼肉，该步骤下鱼肉中脂肪脱除率高，不仅可除去非胶原蛋白的杂蛋白，且胶原蛋白的流失量小，对鱼肉中其他成分的性能无影响；

2）鮸鱼鱼肉的酶解：取脱脂鮸鱼鱼肉，按料液比1g:4～7ml加入蒸馏水，调节ph值至6.5～7.5，加入鱼肉重量1.0～1.5%木瓜蛋白酶，于45～55℃酶解3～5h，于90～100℃进行10～15min灭酶；酶液降温至50～60℃时，调节ph值至8.5～10.0，加入鱼肉重量1.0～2.0%碱性蛋白酶，反应3～5h，于90～100℃进行10～15min灭酶，冷却至常温，在11000～15000rmp下离心17～24min，收集上清液，即鮸鱼鱼肉酶解液，经过两次加酶酶解，鱼肉中蛋白质的转化率高，活性多肽的提取彻底，且操作条件控制合理，所得的活性多肽的品质高；

3）鮸鱼鱼肉降血脂寡肽的制备：将鮸鱼鱼肉酶解液经截留分子量为1kda、3kda和10kda的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于1kda组分，得到超滤酶解液。将超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍体积d101大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（rp-hplc）纯化，得到鮸鱼鱼肉降血脂寡肽，该步骤纯化效果好，所得的降血脂寡肽具有较好的降酯活性，且安全无毒副作用，可作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。

作为优选，步骤1中的鮸鱼为miichthysmiiuy。

作为优选，步骤3的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和rp-hplc纯化的具体过程为：

离子交换树脂层析操作为：将步骤3中的多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45~50mg/ml的溶液，加入到deae-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1mol/l的nacl溶液洗脱，收集0.1mol/l的nacl洗脱组分，即为离子交换层析酶解物，该方法分离净化效果好，操作简单，条件控制的自由度高，同样适用于工业化生产；

凝胶柱层析操作为：将离子交换树脂层析所得的离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为15~20mg/ml的溶液，经过葡聚糖凝胶sephadexg-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度制作凝胶层析色谱图，收集峰2，即为凝胶层析酶解物，该方法根据在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便、不影响目标组分化学性质；

rp-hplc纯化操作为：将凝胶柱层析所得的凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100μg/ml的溶液，利用rp-hplc进行纯化，根据制备多肽的降血脂活性得1个高降血脂活性多肽val-ile-ala-pro-trp（viapw），该方法灵敏度高、分离效果好，能快速分离纯化目标产物。

再优选，rp-hplc纯化条件为：进样量为10~15μl；色谱柱为kromasilc18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为40%乙腈；洗脱速度为0.8~1.0ml/min；紫外检测波长280nm。

上述技术方案制备所得的鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽val-ile-ala-pro-trp（viapw）能减少oa（油酸）诱导的hepg2细胞内脂质堆积；在1-10μm浓度下对总胆固醇（tc）、甘油三酯（tg）呈剂量依赖性分解作用；能降低成脂因子ppapα、srebp-1c、srebp-2和fas的表达水平，增强acox-1的表达水平；westernblot试验显示viapw能抑制成脂重要因子srebp-1c的蛋白表达水平，但不能抑制脂质合成相关基因acc的表达；荧光素酶试验证明viapw既能激活lxrα的表达又能激活lxrβ的表达。因此，viapw既能下调成脂基因，又能促进脂肪酸β氧化，减少脂质的生成，激活lxrα和lxrβ，降脂质水平大于脂质生成能力，具有较好的降脂活性。viapw具有安全无毒副作用、降脂活性强等优点，可用于药品、保健食品和食品的用途，作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1）本发明的降血脂寡肽能减少oa（油酸）诱导的hepg2细胞内脂质堆积；

2）本发明的降血脂寡肽既能下调成脂基因，又能促进脂肪酸β氧化，减少脂质的生成，激活lxrα和lxrβ，降脂质水平大于脂质生成能力，具有较好的降脂活性；

3）本发明以鮸鱼鱼肉为原料，利用酶解技术制备一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，制备过程易控制，且降血脂寡肽的得率高，纯化后所得的降血脂寡肽纯度高、活性强；

4）本发明的降血脂寡肽具有安全无毒副作用、降脂活性强等优点，可作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。

附图说明

图1为本发明deae-52阴离子交换树脂层析图；

图2为本发明葡聚糖凝胶sephadexg-15层析图；

图3为本发明葡聚糖凝胶sephadexg-15制备酶解物的rp-hplc分析；

图4为本发明val-ile-ala-pro-trp（viapw）的质谱图；

图5为本发明val-ile-ala-pro-trp（viapw）对hepg2细胞内脂质堆积的影响；

图6为本发明val-ile-ala-pro-trp（viapw）对hepg2细胞内脂质堆积的镜下观察结果；

图7为本发明val-ile-ala-pro-trp（viapw）对hepg2细胞内甘油三酯（tg）含量的影响；

图8为本发明val-ile-ala-pro-trp（viapw）对hepg2细胞内总胆固醇（tc）含量的影响；

图9为本发明val-ile-ala-pro-trp（viapw）对hepg2细胞内脂质合成相关基因表达的影响；

图10为本发明val-ile-ala-pro-trp（viapw）对hepg2细胞内脂质氧化相关基因表达的影响；

图11为本发明val-ile-ala-pro-trp（viapw）对hepg2细胞内srebp-1c和acc基因在蛋白水平的表达影响；

图12为本发明val-ile-ala-pro-trp（viapw）对hepg2细胞内肝受体诱导表达的影响。

具体实施方式

以下结合附图和实施例作进一步详细描述：

实施例1：

一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其制备工艺流程如下：鮸鱼鱼肉"脱脂"酶解"酶解物"超滤"大孔树脂纯化"离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"降血脂寡肽"功能评价。

一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其制备方法的具体步骤为：

1）鮸鱼鱼肉预处理：鮸鱼去鱼皮和鱼骨，鱼肉匀浆至糊状后，按料液比1g:5ml加入乙酸乙酯溶液，搅拌脱脂24h，过滤，干燥，得脱脂鮸鱼鱼肉。

2）鮸鱼鱼肉的酶解：取脱脂鮸鱼鱼肉，按料液比1g:5ml加入蒸馏水，调节ph值至7.0，加入鱼肉重量1.0%木瓜蛋白酶，50℃酶解4h，于95℃进行10min灭酶；酶液降温至50℃时，调节ph值至8.5，加入碱性蛋白酶2.0%，反应5h，于95℃进行10min灭酶，冷却至常温，12000rmp离心20min，收集上清液，即鮸鱼鱼肉酶解液。

3）鮸鱼鱼肉降血脂寡肽的制备：将鮸鱼鱼肉酶解液经截留分子量为1kda、3kda和10kda的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于1kda组分，得到超滤酶解液。将超滤酶解液按照体积比加入到装有8倍d101大孔树脂的层析柱中，用4倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用6倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（rp-hplc）纯化，得到鮸鱼鱼肉降血脂寡肽，利用氨基酸序列分析仪和质谱测定其结构，具体过程为：

①离子交换树脂层析：采用阴离子交换层析，将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45mg/ml的溶液，加入到deae-52阴离子交换树脂层析柱分离，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1mol/l的nacl溶液洗脱，收集0.1mol/l的nacl洗脱组分，即为离子交换层析酶解物（dmm-ⅱ），deae-52阴离子交换树脂层析图如图1所示；

②凝胶色谱层析：将上述离子交换层析酶解物（dmm-ⅱ）用双蒸水配成浓度为20mg/ml的溶液，经过葡聚糖凝胶sephadexg-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，峰2为凝胶层析酶解物（gm-ⅱ），葡聚糖凝胶sephadexg-15层析图如图2所示；

③高效液相色谱精制：将上述凝胶层析酶解物（gm-ⅱ）用双蒸水配成浓度为80μg/ml的溶液，用rp-hplc进行纯化，纯化条件为：进样量10μl；色谱柱kromasilc18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相40%乙腈；洗脱速度为1.0ml/min；紫外检测波长280nm。根据280nm下的吸光度曲线和降血脂活性得1个高活性降血脂寡肽，葡聚糖凝胶sephadexg-15制备酶解物的rp-hplc分析如图3所示；

④结构检测：收集降血脂活性最高的1个色谱峰，经rp-hplc检测达到测序要求，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为val-ile-ala-pro-trp（viapw），esi-ms测定分子量为584.72da，viapw的质谱图如图4所示。

将制得的鮸鱼鱼肉降血脂寡肽val-ile-ala-pro-trp（viapw）进行降血脂活性评价，结果如图5-12所示，结果表明：鮸鱼鱼肉降血脂寡肽viapw能减少oa（油酸）诱导的hepg2细胞内脂质堆积；在1-10μm浓度下对总胆固醇（tc）、甘油三酯（tg）呈剂量依赖性分解作用；能降低成脂因子ppapα、srebp-1c、srebp-2和fas的表达水平，增强acox-1的表达水平；westernblot试验显示viapw能抑制成脂重要因子srebp-1c的蛋白表达水平，但不能抑制脂质合成相关基因acc的表达；荧光素酶试验证明viapw既能激活lxrα的表达又能激活lxrβ的表达。因此，viapw既能下调成脂基因，又能促进脂肪酸β氧化，减少脂质的生成，激活lxrα和lxrβ，降脂质水平大于脂质生成能力，具有较好的降脂活性。

本实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。

实施例2：

一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其制备方法具体包括下述步骤：

1）鮸鱼鱼肉预处理：鮸鱼去鱼皮和鱼骨，鱼肉匀浆至糊状后，按料液比1g:4ml加入乙酸乙酯溶液，搅拌脱脂22h，过滤，干燥，得脱脂鮸鱼鱼肉；

2）鮸鱼鱼肉的酶解：取脱脂鮸鱼鱼肉，按料液比1g:6ml加入蒸馏水，调节ph值至7.2，加入鱼肉重量1.3%木瓜蛋白酶，于48℃酶解4h，于92℃进行12min灭酶；酶液降温至55℃时，调节ph值至9.0，加入鱼肉重量1.6%碱性蛋白酶，反应3.7h，于93℃进行11min灭酶，冷却至常温，在12000rmp下离心19min，收集上清液，即鮸鱼鱼肉酶解液；

3）鮸鱼鱼肉降血脂寡肽的制备：将鮸鱼鱼肉酶解液经截留分子量为1kda、3kda和10kda的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于1kda组分，得到超滤酶解液。将超滤酶解液按照体积比加入到装有9倍d101大孔树脂的层析柱中，用4倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用6倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于45℃低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（rp-hplc）纯化，得到鮸鱼鱼肉降血脂寡肽。

步骤1中的鮸鱼为miichthysmiiuy。

步骤3的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和rp-hplc纯化的具体过程为：

离子交换树脂层析操作为：将步骤3中的多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为42mg/ml的溶液，加入到deae-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1mol/l的nacl溶液洗脱，收集0.1mol/l的nacl洗脱组分，即为离子交换层析酶解物；

凝胶柱层析操作为：将离子交换树脂层析所得的离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为18mg/ml的溶液，经过葡聚糖凝胶sephadexg-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度制作凝胶层析色谱图，收集峰2，即为凝胶层析酶解物；

rp-hplc纯化操作为：将凝胶柱层析所得的凝胶层析酶解物用双蒸水配成88μg/ml的溶液，利用rp-hplc进行纯化，根据制备多肽的降血脂活性得1个高降血脂活性多肽val-ile-ala-pro-trp（viapw）。

rp-hplc纯化条件为：进样量为11μl；色谱柱为kromasilc18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为40%乙腈；洗脱速度为0.85ml/min；紫外检测波长280nm。

本实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。

实施例3：

一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其制备方法具体包括下述步骤：

1）鮸鱼鱼肉预处理：鮸鱼去鱼皮和鱼骨，鱼肉匀浆至糊状后，按料液比1g:5.5ml加入乙酸乙酯溶液，再加入鱼肉重量0.003%的十二烷基硫酸钠，搅拌脱脂25h，过滤，干燥，得脱脂鮸鱼鱼肉，该步骤下鱼肉中脂肪脱除率高，不仅可除去非胶原蛋白的杂蛋白，且胶原蛋白的流失量小，对鱼肉中其他成分的性能无影响，加入的十二烷基硫酸钠与乙酸乙酯具有协同作用，可增加脂肪在乙酸乙酯中的溶解度，提高脱脂效率，且可降低对胶原蛋白的性能影响，提高非胶原蛋白的杂蛋白的去除率，提高所制备的抗氧化肽的纯度和活性；

2）鮸鱼鱼肉的酶解：取脱脂鮸鱼鱼肉，按料液比1g:6.5ml加入蒸馏水，调节ph值至7.2，加入鱼肉重量1.4%木瓜蛋白酶，于53℃酶解3.7h，于95℃进行13min灭酶；酶液降温至56℃时，调节ph值至9.3，加入鱼肉重量1.8%碱性蛋白酶，反应4.6h，于93℃进行14min灭酶，冷却至常温，在14000rmp下离心20min，收集上清液，即鮸鱼鱼肉酶解液，经过两次加酶酶解，鱼肉中蛋白质的转化率高，活性多肽的提取彻底，且操作条件控制合理，所得的活性多肽的品质高；

3）鮸鱼鱼肉降血脂寡肽的制备：将鮸鱼鱼肉酶解液经截留分子量为1kda、3kda和10kda的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于1kda组分，得到超滤酶解液。将超滤酶解液按照体积比加入到装有8倍d101大孔树脂的层析柱中，用3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（rp-hplc）纯化，得到鮸鱼鱼肉降血脂寡肽，该步骤纯化效果好，所得的降血脂寡肽具有较好的降酯活性，且安全无毒副作用，可作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。

步骤3的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和rp-hplc纯化的具体过程为：

离子交换树脂层析操作为：将步骤3中的多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为49mg/ml的溶液，加入到deae-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1mol/l的nacl溶液洗脱，收集0.1mol/l的nacl洗脱组分，即为离子交换层析酶解物，该方法分离净化效果好，操作简单，条件控制的自由度高，同样适用于工业化生产；

凝胶柱层析操作为：将离子交换树脂层析所得的离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为15mg/ml的溶液，经过葡聚糖凝胶sephadexg-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度制作凝胶层析色谱图，收集峰2，即为凝胶层析酶解物，该方法根据在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便、不影响目标组分化学性质；

rp-hplc纯化操作为：将凝胶柱层析所得的凝胶层析酶解物用双蒸水配成90μg/ml的溶液，利用rp-hplc进行纯化，根据制备多肽的降血脂活性得1个高降血脂活性多肽val-ile-ala-pro-trp（viapw），该方法灵敏度高、分离效果好，能快速分离纯化目标产物。

本发明的降血脂寡肽能减少oa（油酸）诱导的hepg2细胞内脂质堆积；本发明的降血脂寡肽既能下调成脂基因，又能促进脂肪酸β氧化，减少脂质的生成，激活lxrα和lxrβ，降脂质水平大于脂质生成能力，具有较好的降脂活性；本发明以鮸鱼鱼肉为原料，利用酶解技术制备一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，制备过程易控制，且降血脂寡肽的得率高，纯化后所得的降血脂寡肽纯度高、活性强；本发明的降血脂寡肽具有安全无毒副作用、降脂活性强等优点，可作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。

本实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的或者超越所附权利要求书所定义的范围。

序列表

<110>浙江海洋大学

<120>一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5

<212>prt

<213>鮸鱼(miichthysmiiuy)

<400>1

valilealaprotrp

15