本发明涉及正丁基-β-d-葡萄糖苷的合成方法，具体是一种酶法制备正丁基-β-d-葡萄糖苷的方法。
背景技术：
表面活性剂是一类在加入少量时就能使溶液体系界面状态发生明显变化的具有“亲水/亲油”双亲结构的有机化合物。在溶液中，表面活性剂可以产生乳化、分散、增溶、洗涤、润湿、发泡、消泡、保湿、润滑、杀菌、柔软、抗静电、防腐蚀等一系列作用(或反作用)，从而满足各种实际应用的要求。
表面活性剂的种类多、用途广。目前，表面活性剂的品种已达数千种，而且新型的表面活性剂还在不断地产生。随着人们的生活质量不断提高，对生态环境的要求也不断提高，“绿色化学”受到人们的普遍重视，这势必趋使表面活性剂的研究和生产朝着无毒、无公害、高效、全天然的绿色化学方向发展。表现为：产品的绿色化；反应过程绿色化；原料绿色化。作为以绿色天然材料为主要合成原料的烷基糖苷系列完全符合上述表面活性剂绿色化学的发展趋势，是一种性能优良的绿色表面活性剂。
烷基糖苷(alkylpolyglycoside，简称apg)是20世纪80年代初发展起来的一类新型的绿色非离子表面活性剂。烷基糖苷合成技术划分为两大类：化学工艺法和酶催化法。化学法中的二步转苷法是用酸性催化剂催化短碳链醇，如正丁醇，与葡萄糖反应生成短碳链烷基糖苷，如正丁基糖苷，再与长碳链脂肪醇发生缩醛交换反应，生成长碳链烷基糖苷。因此，正丁基葡萄糖苷是两步化学法合成长碳链烷基糖苷的中间产物，是二步法合成的关键所在。此外，正丁基糖苷具有优良的润湿、渗透能力，具有一定的去污能力，耐酸、耐碱，对电解质不敏感，和皮肤的相容性佳。
酶催化法合成烷基糖苷的反应特点是选择性高、产品纯、得率高、制备条件温和，适合工业规模生产。葡萄糖苷酶(β-glucosidase，ec3.2.1.21)，即β-d-葡萄糖苷水解酶，是一类催化β-d-葡萄糖苷键水解生成葡萄糖和相应配基的水解酶。研究表明，β-d-葡萄糖苷水解酶可用来催化合成烷基糖苷。如,panintrarux等人用β-d-葡萄糖苷水解酶催化c6-c12醇的糖苷化；andersson等人用杏仁β-葡萄糖苷酶催化对硝基苯基葡萄糖苷的转糖苷反应合成了己基糖苷。然而，由于葡萄糖在醇中溶解度差，而水的存在会促进水解副反应，因此β-d-葡萄糖苷水解酶催化合成糖苷得率小于60％。在β-葡萄糖苷酶合成糖苷的反应底物中常添加叔丁醇、1,4-二氧六环、乙腈等有机溶剂来促进底物的相互溶解和维持酶的基本活性。但是，β-葡萄糖苷酶在有机溶剂中易发生失活，从而影响其催化效率。因此，选择合适的反应介质解决上述问题，是实现酶催化合成正丁基-β-d-葡萄糖苷的关键。
本文发明了一种在离子液体中进行β-葡萄糖苷酶催化合成正丁基-β-d-葡萄糖苷的方法，使得正丁基-β-d-葡萄糖苷(以葡萄糖计)产率达到90～95％。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有正丁基-β-d-葡萄糖的合成技术中存在的问题，提供一种操作简单、得率高的酶法制备正丁基-β-d-葡萄糖的方法。解决本发明的技术问题所采用的方案如下步骤：1.β-葡萄糖苷酶催化剂的制备；2.底物溶液制备；3.酶催化合成正丁基-β-d-葡萄糖苷；4.产物分离。
所述的方案，步骤1中，β-葡萄糖苷酶催化剂采用如下方法制备：将β-葡萄糖苷酶用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置成蛋白质质量百分比为5～20％的缓冲溶液。在缓冲溶液中加入质量百分比浓度为0.5～2.5％的丁二酰氯后振荡反应0.5～2小时，缓冲溶液中蛋白质与丁二酰氯的质量比为1:0.5～3。反应结束后将反应液在3000～5000rpm离心5～10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为β-葡萄糖苷酶催化剂。
所述的方案，步骤1中，β-葡萄糖苷酶为杏仁β-葡萄糖苷酶、农杆菌(agrobacterium)β-葡萄糖苷酶、白腐真菌(phanerochaetechrysosporium)β-葡萄糖苷酶、海栖热袍菌(thermotogamaritima)β-葡萄糖苷酶中的任一种。
所述的方案，步骤1中，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的浓度为0.1～0.2m，ph值为5.5～8.0。
所述的方案，步骤2中，底物溶液的制备采用如下方法：将β-d-葡萄糖和正丁醇按摩尔比1:1～3均匀混合，加入1-烷基-3-甲基咪唑(cnmim+，n＝2-10)的bf4-、br-、i-盐的离子液体，在80～100℃加热搅拌至形成透明液体，离子液体中β-d-葡萄糖的质量百分比为10～30％。
所述的方案，步骤2中，1-烷基-3-甲基咪唑(cnmim+，n＝2-10)的bf4-、br-、i-盐的离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑、1-戊基-3-甲基咪唑、1-己基-3-甲基咪唑、1-庚基-3-甲基咪唑、1-辛基-3-甲基咪唑、1-壬基-3-甲基咪唑、1-癸基-3-甲基咪唑中任一种与bf4-、br-、i-中任一种组成的离子液体。
所述的方案，步骤3中，在2ml底物溶液中加入5u-10u的β-葡萄糖苷酶催化剂和去离子水，使去离子水的体积比为0.2～0.5％，在50～60℃下反应5～9小时，收集反应液。
所述的方案，步骤4中，将步骤3中获得的反应液用3倍体积的乙醚、叔丁醇、乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,用无水mgso4干燥后,在0.01mpa下减压蒸馏得到产品。产品经c18柱高效液相法检测，正丁基-β-d-葡萄糖得率(以葡萄糖计)达到90～95％。
本发明与现有技术相比，主要具有以下优点：正丁基-β-d-葡萄糖苷的酶催化合成在1-烷基-3-甲基咪唑(cnmim+，n＝2-10)阳离子的bf4-、br-、i-盐的离子液体中用进行，反应只需微量水参与，得率达到90～95％。过程操作简单、条件温和。
具体实施方式：
实施实例1
1.β-葡萄糖苷酶催化剂的制备
将杏仁β-葡萄糖苷酶(北京宝希迪科技有限公司生产)用0.1m、ph5.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)配置成蛋白质质量百分比为5％的酶缓冲溶液。在酶缓冲溶液中加入质量百分比浓度为0.5％的丁二酰氯(上海紫一试剂厂生产)后振荡反应0.5小时，缓冲液中蛋白质与丁二酰氯的质量比为1:0.5。反应结束后，将反应液在3000rpm离心5分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为β-葡萄糖苷酶催化剂。
2.底物溶液制备
将β-d-葡萄糖(石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司生产)和正丁醇(淄博海正化工股份有限公司生产)按摩尔比1:1均匀混合，加入1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(c4mimbf4)(江西金凯化工有限公司生产)，在80℃下加热搅拌至形成均一透明液体，离子液体中β-d-葡萄糖的质量百分比为10％。
3.酶催化合成正丁基-β-d-葡萄糖苷
在2ml底物溶液中加入5u的β-葡萄糖苷酶催化剂和去离子水，去离子水的体积比为0.2％，在50℃下反应5小时，收集反应液。
4.产物分离
将步骤3中获得的反应液用3倍体积的乙醚(莱阳经济技术开发区精细化工厂生产)萃取3次,合并萃取液,用无水mgso4(连云港丰泰生物科技有限公司生产)干燥后,在0.01mpa下减压蒸馏得到产品。产品经c18柱高效液相法检测，丁基-β-d-葡萄糖得率(以葡萄糖计)达到90％。
实施实例2
1.β-葡萄糖苷酶催化剂的制备
将农杆菌(agrobacterium)β-葡萄糖苷酶(美国megazyme公司生产)用0.15m、ph6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)配置成蛋白质质量百分比为10％的酶溶液。在酶溶液中加入质量百分比浓度为1.5％的丁二酰氯(上海紫一试剂厂生产)后振荡反应1小时，缓冲溶液中蛋白质与丁二酰氯的质量比为1:2。反应结束后将反应液在4000rpm离心7分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为β-葡萄糖苷酶催化剂。
2.底物溶液制备
将β-d-葡萄糖(石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司生产)和正丁醇(淄博海正化工股份有限公司生产)按摩尔比1:2均匀混合，加入1-癸基-3-甲基咪唑溴盐(c10mimbr)(兰州中科凯特工贸有限公司生产)，在100℃加热搅拌至形成明液体。离子液体中β-d-葡萄糖的质量百分比为20％。
3.酶催化合成正丁基-β-d-葡萄糖苷
在2ml底物溶液中加入8uβ-葡萄糖苷酶催化剂和去离子水，去离子水的体积比为0.3％，在60℃下反应7小时，收集反应液。
4.产物分离
将步骤3中获得的反应液用3倍体积的叔丁醇(淄博金林化工有限公司生产)萃取3次,合并萃取液,用无水mgso4(连云港丰泰生物科技有限公司生产)干燥后,在0.01mpa下减压蒸馏得到产品。产品经c18柱高效液相法检测，丁基-β-d-葡萄糖得率(以葡萄糖计)达到92％。
实施实例3
1.β-葡萄糖苷酶催化剂的制备
将白腐真菌(phanerochaetechrysosporium)β-葡萄糖苷酶(美国megazyme公司生产)用0.2m、ph7.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)配置成蛋白质质量百分比为20％的酶溶液。在缓冲溶液中加入质量百分比浓度为2.5％的丁二酰氯(上海紫一试剂厂生产)后振荡反应2小时，缓冲溶液中蛋白质与丁二酰氯的质量比为1:3。反应结束后将反应液在5000rpm离心10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为β-葡萄糖苷酶催化剂。
2.底物溶液制备
将β-d-葡萄糖(石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司生产)和正丁醇(淄博海正化工股份有限公司生产)按摩尔比1:3均匀混合，加入1-丁基-3-甲基咪唑碘盐(c4mimi)(兰州中科凯特工贸有限公司生产)，在90℃下加热搅拌至形成透明液体，离子液体中β-d-葡萄糖的质量百分比为30％。
3.酶催化合成正丁基-β-d-葡萄糖苷
在2ml底物溶液中加入10uβ-葡萄糖苷酶催化剂和去离子水，去离子水的体积比为0.5％，在55℃下反应9小时，收集反应液。
4.产物分离
将步骤3中获得的反应液用3倍体积的乙酸乙酯(江苏索普有限公司生产)萃取3次,合并萃取液,用无水mgso4(连云港丰泰生物科技有限公司生产)干燥后,在0.01mpa下减压蒸馏得到产品。产品经c18柱高效液相法检测，丁基-β-d-葡萄糖得率(以葡萄糖计)达到95％。