高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗Lj‑RGD3蛋白的制备方法与流程

本发明涉及一种蛋白制备方法，尤其是一种操作简单、纯化率高的高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗lj-rgd3蛋白的制备方法。

背景技术：

lj-rgd3为来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物的rgd毒素蛋白，由117个氨基酸残基组成，lj-rgd3的一级结构除具有三个rgd模体和一对半胱氨酸这一典型的rgd毒素蛋白特征外，还含有17个组氨酸，17个精氨酸，是一类hrg的碱性蛋白，已公开于专利号为200510083437.7、名称为“具抗肿瘤作用的日本七鳃鳗口腔腺rgd模体蛋白的基因克隆与表达”的中国发明专利文献中，即命名为lampetrin3的蛋白，具有抗血管新生、抗肿瘤增殖、抗血栓等功效。

中国专利号为zl201310600092.2的发明专利公开了一种“去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗lj-rgd3蛋白的制备方法”，具体步骤如下：在lj-rgd3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以ndei和hindiii酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定；对阳性重组子进行iptg诱导表达；对表达的重组蛋白进行提取；对提取的蛋白依次按如下步骤进行纯化：通过金属螯合离子亲和层析柱hitrapimachp进行蛋白纯化、对所收集的蛋白采用sp柱进行阳离子交换层析、透析及冷冻干燥。但是，却存在着如下问题：

1.未涉及大规模发酵，所得产品产率低，只适合于实验室小规模mg级蛋白生产；

2.对菌体破碎液进行澄清时，需要依靠离心机去除细胞碎片。多台高速连续流离心机将导致极高的设备投资和转子日常维护成本，单元操作繁琐，劳动强度大，参数易受人为因素干扰而不可控，不适用于大规模生产；

3.纯化过程并不能有效去除宿主dna及热源物质，所获蛋白浓度过低；

4.冻干得到的rlj-rgd3蛋白稳定性较差。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、纯化率高的高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗lj-rgd3蛋白的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗lj-rgd3蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a.在lj-rgd3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以ndei和hindiii酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定，得到阳性重组子；

b.对阳性重组子扩大培养并进行iptg诱导表达：

b.1取单克隆，接种到lb培养基中，30℃培养16~18小时，至od600达到2~3；

b.2按体积比1:10二级接种于高浓度培养基中，30℃培养2~3小时，至od600达到1~2；

b.3接种到中间转接发酵罐30℃继续培养，待发酵液od600达到2~3左右时，向培养基中加入发酵体积1/20的微量元素、发酵体积2/5的葡萄糖、发酵体积1/100的mg2so4·2h2o、发酵体积0.2/100的cacl2·2h2o及终浓度为1mm的iptg，30℃培养至od至少为5；

所述lb培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl5g/l；

所述高浓度培养基的组分如下：胰蛋白胨12g/l,酵母粉24g/l，100%甘油4ml/l，柠檬酸7.5g/l，nacl0.5g/l，kh2po42.31g/l，k2hpo4·3h2o12.5g/l，（nh4）2so47g/l，h3po41.5ml/l，消泡剂0.6ml/l；

c.收集菌体，经均质机破碎、中空纤维滤膜过滤得上清液；

d.所得上清液经镍离子亲和层析、阴离子交换层析及分子筛层析获得rlj-rgd3原液。

所述c步骤如下：

c.1收集菌体，经均质机破碎得菌体破碎液，将菌体破碎液稀释2倍，采用1μm滤芯进行过滤；

c.2采用500~750k中空纤维滤膜进一步超滤，获得澄清滤液；

c.3采用3k中空纤维滤膜浓缩澄清滤液。

所述d步骤镍离子亲和层析的bindingbuffer成分为20mmtris、0.8mnacl及5mmph7.9的咪唑，elutionbuffer成分为20mmtris、0.8mnacl、1mph7.9的咪唑；所述阴离子交换层析的填料为qff，缓冲液为buffera：20mmpbs，ph7.4；bufferb：100mmpbs，1mnacl，ph7.4；所述分子筛层析填料为superdex75，缓冲液为10~30mmpbs，ph7.4。

所述d步骤后向250μgrlj-rgd3原液内加入质量百分比为1%~5%的甘露醇或50~250mm的gly、终浓度为50~250mm的arg和10~30mmph7.4的pbsbuffer，经冷冻干燥而成。

本发明采用不同的培养基对阳性重组子高密度发酵及iptg诱导表达，以中空纤维滤膜过滤破碎菌体，代替现有的高速离心和死端过滤等操作，有效保证放大后工艺的合理性和可操作性，经镍离子亲和层析、阴离子交换层析及分子筛层析，可获得百克级的rlj-rgd3原液，其蛋白纯度≥99%，适用于大规模工业化生产。将rlj-rgd3原液与不同组分配合，通过冷冻干燥制备rlj-rgd3蛋白，稳定性强。

附图说明

图1是本发明实施例rlj-rgd3的300l发酵表达结果的sds-page。

图2是本发明实施例750k中空纤维滤膜透过端目标蛋白的sds-page。

图3是本发明实施例镍离子亲和层析产物结果图。

图4是本发明实施例阴离子交换层析产物结果图。

图5是本发明实施例分子筛层析的精细纯化结果图。

图6是本发明实施例分子筛层析的精细纯化蛋白的hplc检测结果。

具体实施方式

本发明的高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗lj-rgd3蛋白的制备方法，依次按照如下步骤进行：

a.在lj-rgd3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以ndei和hindiii酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定，得到阳性重组子；此步骤按照中国专利号为zl201310600092.2的发明专利公开了一种“去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗lj-rgd3蛋白的制备方法”进行。

b.对阳性重组子扩大培养并进行iptg诱导表达：

b.1取单克隆，接种到50mllb培养基中，30℃培养16~18小时，至od600达到2~3；

b.2按体积比1:10二级接种于1000ml高浓度培养基中，30℃培养2~3小时，至od600达到1~2；

b.3接种到中间转接发酵罐30℃继续培养，每隔1hr取样一次并记录数据，待发酵液od600达到2~3左右时，向100l以上的生产发酵罐高浓度培养基中转种，即向培养基中加入发酵体积1/20的微量元素（配方：feso4.7h2o3.36g/l,mnso4.h2o0.51g/l,znso4.7h2o0.84g/l,namod4.7h2o0.25g/l,cuso4.5h2o0.12g/l,h3bo30.36g/l,h3po448ml/l）、发酵体积2/5的葡萄糖、发酵体积1/100的mg2so4·2h2o、发酵体积2/1000的cacl2·2h2o及终浓度为1mm的iptg，30℃培养至od至少为5；

所述lb培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl5g/l；

所述高浓度培养基的组分如下：胰蛋白胨12g/l,酵母粉24g/l，100%甘油4ml/l，柠檬酸7.5g/l，nacl0.5g/l，kh2po42.31g/l，k2hpo4·3h2o12.5g/l，（nh4）2so47g/l，h3po41.5ml/l，消泡剂0.6ml/l；

不同时间样品进行sds-page检测（并扫描）结果如图1所示。

图1中lane1：摇瓶种子菌体；lane2：小罐种子菌体；lane3：发酵5h取样点的菌体；lane4：发酵9h取样点的菌体；lane5：发酵13h取样点的菌体；lane6：发酵15h取样点的菌体；lane7：发酵17h取样点的菌体；lane8：发酵19h取样点的菌体：lane9：发酵21h取样点的菌体；lane10：发酵23h取样点的菌体；lane11：发酵23h培养液上清；lane12：stdhg；lane13：marker。

测定蛋白含量：最后每升发酵液总蛋白产出率为14g，即50l以上发酵可获总蛋白700g以上。

c.收集菌体，经均质机破碎、中空纤维滤膜过滤得上清液：

c.1收集菌体，经均质机破碎得菌体破碎液，将菌体破碎液稀释2倍，采用1μm滤芯进行过滤；超滤缓冲液：0.5mnacl，5mm咪唑，20mmtris·hcl；超滤设备：10t/h离心泵或相似设备；膜型号：k06-e500-10-n或相似产品；泵速：26-30t/h。

c.2采用500~750k中空纤维滤膜进一步超滤，获得澄清滤液；超滤缓冲液：0.5mnacl，5mm咪唑，20mmtris·hcl；超滤设备：10t/h离心泵或类似设备；膜型号：ufp-3-c-85或相似产品；泵速：28t/h。

c.3采用3k中空纤维滤膜（或相似产品）浓缩澄清滤液，浓缩2倍体积。

750k中空纤维滤膜透过端目标蛋白的sds-page如图2所示。

图2中sdspage（透过端取样，电泳上样20ug）显示通过500k中空纤维系统过滤菌液，透过端目标蛋白的收集情况：lane1:第一次洗滤前透过样品;lane2:超滤前样品;lane3:超滤后透过单点1;lane4:第一次洗滤前透过样品;lane5:marker;lane6:超滤透过单点2;lane7:超滤透过单点3;lane8:超滤透过单点4;lane9:超滤透过单点5;lane10:超滤透过单点5.

d.所得上清液经镍离子亲和层析、阴离子交换层析及分子筛层析获得rlj-rgd3原液：

本发明采用捕获力强效的ni6ff树脂进行rlj-rgd3的第一步纯化：

取上一步澄清液体平衡5cv，平衡和上样，wash基线平，梯度洗脱1.5cv，洗脱线性。纯化设备：aktaprocess或同类型纯化设备；树脂型号：ni6ff；柱子型号：型号高于或等于bpg200/500的柱子或类似产品，柱体积7l以上。bindingbuffer成分为20mmtris、0.8mnacl及5mmph7.9的咪唑，elutionbuffer成分为20mmtris、0.8mnacl、1mph7.9的咪唑；根据检测到的峰值，收集洗脱各阶段的样品。

镍离子亲和层析结果如图3所示。

图3.镍离子亲和层析蛋白的sds-page，lane1：marker；lane2：峰尖样品；lane3：1b1样品；lane4：1b2样品；lane5：1b2样品；lane6：1b2样品。

本步骤一次性纯化可捕获粗提蛋白200g以上由此可见，ni6ff树脂对rlj-rgd3的捕获能力较强。

将上一步离子亲和层析所得样品上样，纯化设备：aktaprocess或同类型纯化设备；树脂型号：阴离子交换树脂qff；柱子型号：型号高于或等于bpg300/500的柱子或类似产品，柱体积30l以上。buffera-20mmpbs，ph7.4；bufferb：100mmpbs，1mnacl，ph7.4。平衡10cv，平衡及上样，梯度洗脱。根据检测到的峰值，收集洗脱各阶段的样品，每批次可获纯化蛋白150g以上。可有效去除蛋白原液中的宿主dna及热源物质。

阴离子交换层析产物结果如图4所示。

图4.q阴离子交换层析蛋白纯化样品的sds-page。lane1：marker；lane2：q2样品20μg；lane3：q2样品10μg；lane4：q1样品；lane5：q前样品。

将上一步q阴离子交换样品用于分子筛层析。纯化设备：aktaprocess或同类型纯化设备；树脂型号：阴离子交换树脂qff。柱子型号：型号高于或等于bpg300/950的柱子或类似产品，柱体积50l以上。填料：superdex分子筛填料或类似产品；buffer：20mmpbs（10~30mmpbs均可），ph7.4；流速为8.5ml/min以上。根据检测到的峰值，收集洗脱各阶段的样品。每批次可获纯化样品100g以上，可有效去除样品中的多聚体并可对蛋白溶液的缓冲体系置换到制剂配方的pbs缓冲液中20mmpbs，蛋白原液纯度可达99%以上。

分子筛层析结果如图5所示：

图5.分子筛层析蛋白15%胶浓度非还原sds-page，示峰1各收集管样品。

将分子筛层析精细纯化蛋白经hplc检测，hplc操作条件如下：所用层析柱tskgelg2000-3000swxl层析色谱柱；流动相由3.2mm磷酸氢二钠，1.5mm磷酸二氢钾，400mmnacl,ph7.3组成。检测波长214nm。

结果如图6所示：结果表明所得蛋白纯度达到99.94%以上（横坐标minutes,纵坐标au）。

为了提高rlj-rgd3的稳定性，取250μg本发明实施例所得rlj-rgd3原液，向其内加入终浓度质量百分比为1%~5%的甘露醇或50~250mm的gly、终浓度为50~250mm的arg和10~30mmph7.4的pbsbuffer，经冷冻干燥而成。

结果表明本发明实施例的甘露醇等保护剂可同时起到蛋白保护、冻干赋形及调节渗透压功能，有效提高了rlj-rgd3的稳定性。