一种提高酿酒酵母合成芳樟醇能力的方法与流程

本发明涉及一种提高酿酒酵母合成芳樟醇能力的方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术：

芳樟醇(linalool)属于萜烯醇类化合物，化学学名为3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇，已广泛用于日用香料、医药等领域。芳樟醇在全球年需求量达5万吨，90％以上源于化学合成，化学合成带来环境污染日趋严重。因此，采用绿色无污染的生物合成方法制备芳樟醇成为重要研究方向。

酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)作为公认的安全模式微生物，其基因表达调控机理相对清楚，操作简单，被用于生物合成研究或生产。浙江大学于洪巍课题组成功对酿酒酵母甲羟戊酸(mva)途径中7个关键酶基因进行过表达，实现萜类合成重要前体物--二甲基丙烯基二磷酸(dmapp)表达量显著提高。由于酿酒酵母本身不产生芳樟醇，因此，将植物芳樟醇基因转入酿酒酵母，使其具有合成芳樟醇的能力。目前，国内外学者利用酿酒酵母发酵制备芳樟醇的研究比较深入，但仍存在微生物表达不稳定和芳樟醇产率较低等问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提高酿酒酵母合成芳樟醇的能力，提供一种用于生物合成芳樟醇的共表达基因载体构建、表达及重组菌株发酵的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案：

一种提高酿酒酵母合成芳樟醇能力的方法，通过酶切连接，把共表达基因即来自土肉桂的colis基因序列seqidno:1和来自酿酒酵母的erg20基因序列seqidno:2，先后分别克隆到pesc-ura质粒上，得到共表达载体，然后将共表达载体再构建到酿酒酵母上，得到重组菌，该共表达载体强化了重组菌合成香叶基焦磷酸(gpp)的能力，从而提高了芳樟醇合成所需底物的浓度，使合成芳樟醇的酶促反应速率能显著提高，通过发酵，提高了酿酒酵母合成芳樟醇的能力。

所述的colis基因序列为seqidno:1中的基因编码，erg20基因序列为seqidno:2中的基因编码。

所述质粒为pesc-ura，在酿酒酵母中以游离型高拷贝质粒存在，筛选标记为ura3(供试的酿酒酵母为尿嘧啶(ura)缺陷型，即当培养基中无ura时，则该酿酒酵母菌株不能存活生长，若能在不含ura的培养基生长的酿酒酵母菌株，即被认为是含有重组质粒的酿酒酵母)。

酿酒酵母选用酿酒酵母by4742-c-04(matαhis3δ1leu2δ0lys2δ0ura3δ0，来自于浙江大学于洪巍教授，该菌株已在细胞质中强化整条mva途径的单倍体菌株，或见文献lvx,wangf,zhoup,yel,xiew,xuh,yuh.(2016)dualregulationofcytoplasmicandmitochondrialacetyl-coautilizationforimprovedisopreneproductioninsaccharomycescerevisiae.natcommun7:12851，等)。

前述共表达基因的表达载体构建和表达方法，具体为：首先，根据ncbi公布的土肉桂的colis基因和酿酒酵母erg20基因，经密码子优化，然后合成所需基因；将合成的colis基因和erg20基因克隆到质粒pesc-ura，构建共表达载体，将构建好的质粒转化到酿酒酵母by4742-c-04；阳性菌株鉴定采用pcr方法(lis-f:5’atccttgtaatccatcgatactagtatgttgtcctctgctgcaag3’,lis-r:5’taagaatttttgaaaattcgaattcttatatttctttgtcgggaatagactc3’)，lis基因含有1.7kbp；pcr(erg20-f:5’acgcgtcgacatggcttcagagaaggagat3’,erg20-r:5’cccaagcttttatttacttctcttgtata3’)，erg20基因含有1.1kbp。

本发明的有益效果：

本发明利用pesc-ura质粒，成功构建colis基因和erg20基因的共表达载体(pesc-ura-colis/erg20)，并转入酿酒酵母，该重组菌株能发酵产生芳樟醇，芳樟醇的产量较高，比转化单基因pesc-ura-colis和融合基因pesc-ura-colis::erg20的芳樟醇发酵产量均有显著提高，因此，共表达载体有效增加了合成芳樟醇的底物供应，实现了酿酒酵母合成芳樟醇能力的提高。

附图说明

图1为本发明一种pesc-ura-colis/erg20质粒图谱；

图2为pesc-ura-colis质粒图谱；

图3为pesc-ura-colis::erg20质粒图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下

实施例。

实施例1

本发明所用的培养基包括如下：

(1)ypd培养基：酵母提取物1g，蛋白胨2g，葡萄糖2g，100ml去离子水，混匀后在灭菌锅中115℃灭菌。

(2)发酵培养基中所用氨基酸溶液：称量以下各种氨基酸，混合，溶于灭菌水中，使其终浓度为：l-腺嘌呤半硫酸盐(l-adeninehemisulfatesalt)200mg/l，l-精氨酸盐酸盐(l-argininehcl)200mg/l，l-组氨酸盐酸盐一水物(l-histidinehcimonohydrate)200mg/l，l-异亮氨酸(l-isoleucine)300mg/l，l-亮氨酸(l-leucine)1000mg/l，l-赖氨酸盐酸盐(l-lysinehci)300mg/l，l-蛋氨酸(l-methionine)200mg/l，l-苯丙氨酸(l-phenylalanine)500mg/l，l-苏氨酸(l-threonine)2000mg/l，l-色氨酸(l-tryptophan)200mg/l，l-酪氨酸(l-tyrosine)300mg/l，l-缬氨酸(l-valine)1500mg/l。氨基酸母液利用0.22μm的针式过滤器过滤除菌，于4℃冰箱存放。

(3)把sd-ura培养基作为酿酒酵母种子培养基，sd-ura的配方(g/l)如下：葡萄糖20g，无氨基酵母氮源(ynb)1.7g，无水硫酸铵5g，第(2)步骤中所配氨基酸溶液100ml，琼脂20g，以去离子水定容1l，混均后115℃灭菌。

(4)把ss-ura和sg-ura分别作为酿酒酵母的发酵培养基，其中ss-ura配方(g/l)：蔗糖20g，无氨基酵母氮源(ynb)1.7g，无水硫酸铵5g，第(2)步骤中所配氨基酸溶液100ml，琼脂20g，以去离子水定容1l，混均后115℃灭菌。sg-ura配方(g/l)：半乳糖20g，无氨基酵母氮源(ynb)1.7g，无水硫酸铵5g，第(2)步骤中所配氨基酸溶液100ml，琼脂20g，以去离子水定容1l，混均后115℃灭菌。

其中sg-ura效果比较好。

实施例1

(一)芳樟醇合成途径在酿酒酵母中的构建

用密码子优化软件将来源于土肉桂的芳樟醇合成酶基因和源于酿酒酵母的erg20基因密码子进行优化，人工合成优化后的核苷酸序列seqidno:1和seqidno:2，用bamhi/sai1双酶切制备线性载体，用gibson无缝克隆试剂盒把colis基因序列seqidno:1克隆到pesc-ura质粒上，然后再用bamhi/sai1双酶切制备线性载体，将seqidno:2克隆到携带seqidno:1的pesc-ura质粒上，得到共表达载体；再转入by4742-c-04中，以实现芳樟醇的合成：

(1)取5μl携带土肉桂的colis基因和酿酒酵母erg20基因的共表达载体，加入到预冷的1.5ml离心管中；

(2)于离心管中加40μl感受态细胞即酿酒酵母by4742-c-04，感受态细胞与共表达载体在离心管中用移液器进行吹打混匀，然后转移至2ml电转杯，然后冰上预冷5min；

(3)擦干步骤(2)电转杯外围，于750v/mm电击强度下电击；

(4)在步骤(3)电转杯中加入1ml的ypd培养基，进行悬浮细胞，转移到1.5ml离心管中，于30℃培养箱静置复苏2h；

(5)将步骤(4)复苏后的细胞用灭菌水清洗2遍，加350μl灭菌水，将细胞悬浮，并涂布到尿嘧啶缺陷型半乳糖琼脂平板，于30℃培养箱培养2-3天，至单菌落出现(供试的酿酒酵母为尿嘧啶(ura)缺陷型，即当培养基中无ura时，则该酿酒酵母菌株不能存活生长，若能在不含ura的培养基生长的酿酒酵母菌株，即被认为是含有重组质粒的酿酒酵母)

(6)挑取单菌落于5ml的sd-ura培养基作为种子培养基，在28℃，200rpm条件下培养24h，得到重组菌。

发酵培养：取0.5-5ml上述重组菌的菌液(种子液)，于50mlsg-ura培养基(作为发酵培养基)中，在28℃，200rpm，摇床培养3天。

产物顶空吸附：取分别取培养液5ml于顶空瓶中，加入2gnacl，用瓶盖密封，将老化后的萃取头(吸附涂层为85μmpolyacrylate)刺入顶空瓶中，萃取头暴露在培养液上方，在恒温50℃水浴条件下，萃取30min，利用gc-ms进行分析，解析时间至少5min。

(二)产物检测与验证

顶空吸附的产物经gc-ms检测，产物峰与芳樟醇标样的保留时间(rt)和质谱数据进行比较，在rt＝11.3min有明显的色谱峰与芳樟醇标样的rt和质谱图一致，经nist谱库检索，证实为芳樟醇。定量分析方法：是以不同浓度的芳樟醇标准溶液于顶空瓶中用spme方法萃取，与发酵产物相同的条件下检测，并构建标准曲线，计算出发酵产物浓度。

其中，gc-ms检测方法包括，程序升温程序：初始温度50℃，保持1min，以5℃/min升温至115℃保持1min；进样口温度240℃。colis基因(seqidno:1)：atgttgtcctctgctgcaagtagttctttggctccattgaactctgaccctttcattccaaagaagaaccataatcatgagactccaaacgctccatttgatccatcaaatgatcagaaccatgaaactcctaattctctgtttaacccaatacctcaactggctaccgatcactttcaatccatcacacaccaccaattctgtacttcttctactttgtccctggacggtttatcaatcaagcaaagagctaaggtcaaccaggtcagagagatcgtgcagaacttgaaagaccctgctgaacagatggttatgattgacaacttgcaaagattgggaaccgattaccacttccaggaagaaatagaatcaattctgtgttctttatccgagaacgatgatgccatttcttcaattcatgatgtcgccttgcgtttcagattacttagggaacacggttactacgcttcaccagacgtctttaactctttcaaggataaagagggtaggtttaagttacagttaactaccgatatgaagggactgatgagtttgtacgaatcctctaagttgtctaccgaaggtgaagatattcttgatgaggtaaacgactttgcatctaagaaccttatagcaagtatggagttcatagagccagatttggagagagaagttagacacgttctggagcacccatttcacatgagtttaccaagattcaacattaagaaacacttaaaggacttacaaggaaaggacgttaaggctgatgctttgatacaggagttggccatcttggatttcaacattcttcaatccatgcaccagtccgaattgaaggaagttaccaaatggtggcgtgacctgggtctgagtcaggaattgagatttgctagggaccaacccttaaagtggtatgtttggcctttggctgtattacctaacccaaagttctccagatacagaatcgagttgactaagcctatagcattggtctacatcattgatgacatctatgacttctacggtactttggatgaattagtcgtattcactgaagctgttaacaggtgggacccaagtgacattaaccaacttcctcgtaacatgaaattgtgcttcatggctcttcacaacattactaatgaaattgcctatatggtcttgaaagagcatggttggaacccaatcaattccttgaagaagacctggaccgatctgtgtaatgcattcttggtagaggccaagtggtttgccgaaggtgatagtcccaaggccgacgaatatctgagaaacggtgttacttcatccggtgttgctacagtattggtccatctgttcttccttgtgggtaatggtatcactagggaatctgttgatctggttgattcaatccctaagttgatctcatgtccagctatgatcttgcgtttatgggatgacctgggttctgctaaggatgagaaccagaaaggttatgatggttcctacgttgaatgttacttgaaggagaacgctacatcctccttggaatcagctcgtaggcatgttcgtcacatgatttccaacgcctggaaggagttgaataaggagtgtctgtcaccatgtccattctcacctaccttcattgaagctagtttgaacactactagaatggtgcaagttatgtactcatacgataatgatcaaaggctgccagcattagagcagcacatcgcttccttattcaaggagtctattcccgacaaagaaata

erg20基因(seqidno:2)：atggcttcagagaaggagatccgtagagaacgtttcttgaacgtctttccaaagttggttgaagagttgaacgcctcattgttagcttacggtatgcccaaggaagcatgtgactggtatgcccattcattgaattacaacactccaggtggtaagctgaacagaggactgagtgttgttgatacttacgccatcttgtccaacaagactgtggaacaattgggtcaagaggaatatgagaaagtggccatattgggttggtgcatagagttgttgcaagcctacttcttagtggcagatgacatgatggataagagtatcaccagaagaggtcaaccatgctggtataaggttcccgaggttggtgaaatcgcaatcaacgatgctttcatgcttgaagctgctatctacaaattgttgaagtcacatttcagaaatgagaagtactacatcgacattactgaattgtttcatgaggttactttccaaacagaattgggacagctgatggatttgattacagcaccagaggataaggtagacttatccaagttctctctgaagaaacactcctttatcgttactttcaagactgcctattacagtttctaccttcctgtagcattggctatgtacgtagccggtataactgacgagaaggacttgaaacaagccagagatgtcttgattcctcttggtgagtacttccagattcaagatgattacttagattgcttcggtacaccagagcaaataggaaagatcggaactgacatccaagacaataagtgctcttgggtgattaacaaggctttagaattagcatccgcagaacaaagaaagacccttgatgagaattacggtaagaaggactcagttgcagaggcaaagtgtaagaagatattcaatgacttgaagattgagcagttataccatgagtacgaggaaagtatcgctaaagatttgaaggccaagatttctcaagtggacgaatctcgtggattcaaagctgacgtacttactgcattcttgaacaaggtatacaagagaagtaaataa

实施例2三种表达载体的构建并比较效果

为提高芳樟醇发酵产量，筛选比较了三种不同表达载体(1)pesc-ura-colis(芳樟醇基因)；(2)pesc-ura-colis::erg20(融合基因)；(3)pesc-ura-colis/erg20(共表达基因)。

1.制备线性载体

●表达载体pesc-ura质粒用spei/ecori双酶切制备线性载体，线性化载体大小为6.5kb左右，切胶回收。

●表达载体pesc-ura-lis质粒使用bamhi/sai1双酶切制备线性载体，线性化载体大小为8.2kb左右，切胶回收。

2.目的片段扩增以及载体构建

●pesc-ura-lis载体构建：引物lis-f/lis-r扩增lis片段，片段长度1755bp，用gibson无缝克隆试剂盒连接构建，目的片段lis、pesc-ura线性载体片段与gibson酶混匀(按照gibson无缝克隆试剂盒说明书操作)，于50℃反应15分钟。

●pesc-ura-lis::erg20载体构建：引物lis-erg20-f/lis-erg20-r扩增lis::erg20片段，片段长度2926bp，用gibson无缝克隆试剂盒连接构建,目的片段lis::erg20、pesc-ura线性载体片段与gibson酶混匀(按照gibson无缝克隆试剂盒说明书操作)，于50℃反应15分钟。

●pesc-ura-lis/erg20载体构建：引物erg20-f/erg20-r扩增erg20片段，片段长度1059bp，用gibson无缝克隆试剂盒连接构建，目的片段erg20、pesc-ura-lis线性载体片段与gibson酶混匀(按照gibson无缝克隆试剂盒说明书操作)于50℃反应15分钟。

3.实验设计引物如下：

lis::erg20融合基因扩增引物：

lis::erg20-fatccttgtaatccatcgatactagtatgttgtcctctgctgcaag

lis::erg20-rtaagaatttttgaaaattcgaattcttatttacttctcttgtataccttgttcaag

lis基因扩增引物：

lis-fatccttgtaatccatcgatactagtatgttgtcctctgctgcaag

lis-rtaagaatttttgaaaattcgaattcttatatttctttgtcgggaatagactc

erg20基因扩增引物：

saii+erg20-f:acgcgtcgacatggcttcagagaaggagat

hindiii+erg20-r:cccaagcttttatttacttctcttgtata

(1)pesc-ura-colis(芳樟醇基因)和(2)pesc-ura-colis::erg20(融合基因)的效果远不如本发明的(3)pesc-ura-colis/erg20(共表达基因)的效果好。

实施例3芳樟醇的检测

将重组菌株培养在液体培养基半乳糖培养基(sg-ura)的摇瓶中(取0.5上述重组菌的菌液(种子液)，于50mlsg-ura培养基)，培养3天。采用顶空进样法，用gc-ms检测芳樟醇的产量。柱温箱程序升温模式：初始温度50℃，保持1min，以5℃/min升温至115℃保持1min；进样口温度240℃；质谱条件：电子轰击(ei)离子源；电子能量70ev；传输线温度280℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃。结果表明，以基因共表达方式构建的载体(pesc-ura-lis/erg20)，转化酿酒酵母后，相对于出发菌株(产量0.01mg/l)能显著提高菌株合成芳樟醇的能力，使菌液中芳樟醇的含量达到3.5mg/l。

序列表

<110>国际竹藤中心

<120>一种提高酿酒酵母合成芳樟醇能力的方法

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<213>“人工序列”

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<223>来源于土肉桂的芳樟醇合成酶基因密码子进行优化，然后人工合成

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atgttgtcctctgctgcaagtagttctttggctccattgaactctgaccctttcattccaaagaagaaccataatcatgagactccaaacgctccatttgatccatcaaatgatcagaaccatgaaactcctaattctctgtttaacccaatacctcaactggctaccgatcactttcaatccatcacacaccaccaattctgtacttcttctactttgtccctggacggtttatcaatcaagcaaagagctaaggtcaaccaggtcagagagatcgtgcagaacttgaaagaccctgctgaacagatggttatgattgacaacttgcaaagattgggaaccgattaccacttccaggaagaaatagaatcaattctgtgttctttatccgagaacgatgatgccatttcttcaattcatgatgtcgccttgcgtttcagattacttagggaacacggttactacgcttcaccagacgtctttaactctttcaaggataaagagggtaggtttaagttacagttaactaccgatatgaagggactgatgagtttgtacgaatcctctaagttgtctaccgaaggtgaagatattcttgatgaggtaaacgactttgcatctaagaaccttatagcaagtatggagttcatagagccagatttggagagagaagttagacacgttctggagcacccatttcacatgagtttaccaagattcaacattaagaaacacttaaaggacttacaaggaaaggacgttaaggctgatgctttgatacaggagttggccatcttggatttcaacattcttcaatccatgcaccagtccgaattgaaggaagttaccaaatggtggcgtgacctgggtctgagtcaggaattgagatttgctagggaccaacccttaaagtggtatgtttggcctttggctgtattacctaacccaaagttctccagatacagaatcgagttgactaagcctatagcattggtctacatcattgatgacatctatgacttctacggtactttggatgaattagtcgtattcactgaagctgttaacaggtgggacccaagtgacattaaccaacttcctcgtaacatgaaattgtgcttcatggctcttcacaacattactaatgaaattgcctatatggtcttgaaagagcatggttggaacccaatcaattccttgaagaagacctggaccgatctgtgtaatgcattcttggtagaggccaagtggtttgccgaaggtgatagtcccaaggccgacgaatatctgagaaacggtgttacttcatccggtgttgctacagtattggtccatctgttcttccttgtgggtaatggtatcactagggaatctgttgatctggttgattcaatccctaagttgatctcatgtccagctatgatcttgcgtttatgggatgacctgggttctgctaaggatgagaaccagaaaggttatgatggttcctacgttgaatgttacttgaaggagaacgctacatcctccttggaatcagctcgtaggcatgttcgtcacatgatttccaacgcctggaaggagttgaataaggagtgtctgtcaccatgtccattctcacctaccttcattgaagctagtttgaacactactagaatggtgcaagttatgtactcatacgataatgatcaaaggctgccagcattagagcagcacatcgcttccttattcaaggagtctattcccgacaaagaaata

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<223>源于酿酒酵母的erg20基因密码子进行优化，然后人工合成

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<120>一种提高酿酒酵母合成芳樟醇能力的方法

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<213>人工序列()

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<223>来源于土肉桂的芳樟醇合成酶基因密码子进行优化，然后人工合成

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<223>源于酿酒酵母的erg20基因密码子进行优化，然后人工合成

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