一种碱性纤维素酶及其制备方法和应用与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种碱性纤维素酶及其制备和应用。

背景技术：

纤维素是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合物，绝大多数由绿色植物通过光合作用合成。微生物对纤维素的降解、转化是自然界中碳素转化的主要环节。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的多组分酶的总称。目前，纤维素酶产品广泛应用于纺织、饲料、酿造、制药、造纸等行业，尤其是在纺织行业的应用范围目前正在不断扩大。

纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶。主要的有：康氏木霉、里氏木霉、黑曲霉、斜卧青霉、芽孢杆菌等。丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，而嗜碱细菌产生的纤维素酶在碱性范围起作用。丝状真菌产生的纤维素酶往往酶系齐全，包括β-1,4-外切葡聚糖酶，β-1,4-内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，其作用于织物强度较大，造成失重率较高，织物成品容易损坏。碱性纤维素酶是β-1,4-内切葡聚糖酶，其作用于纤维素的非结晶区，对织物损伤较低。

针对碱性纤维素酶，以往的研究常常是在富含纤维素的土壤腐殖质中寻找具有碱性特性的酶，或是在碱性的盐湖等环境中寻找耐碱性菌株，测试其纤维素降解能力；换言之，以往筛选菌株所选取的环境样品，往往并不同时具备碱性与富含纤维素这两个条件。通过传统筛菌方式获得碱性纤维素酶必须基于在实验室能够成功分离并培养该菌株，而一些不能实验室培养的微生物很有可能存在一些稀有或特殊的碱性纤维素酶。

技术实现要素：

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种碱性纤维素酶基因及其制备和应用，利用宏基因组分子手段从真正的碱性纤维质环境碱性腌竹池中直接分离获取碱性纤维素酶基因，并在工程酵母中进行重组表达得到的一种新的碱性纤维素酶基因。

本发明通过以下技术方案实现：

一种碱性纤维素酶，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

进一步的，所述碱性纤维素酶的核苷酸序列如seqidno：1所示。

进一步的，所述碱性纤维素酶与现有纤维素酶相似性不超过49％。

一种碱性纤维素酶的制备方法，包括：

1)分析选择取样地，采样，通过分子生物学手段获取样品的宏基因组；

2)对1)中宏基因组进行高通量测序获得碱性纤维素酶的基因序列；

3)将2)所得的碱性纤维素酶基因扩增并整合至表达载体中，并用该载体转化宿主细胞；

4)培养3)中已转化的细胞得到含有重组碱性纤维素酶的发酵液；

5)从4)中发酵液中制得碱性纤维素酶。

进一步的，所述方法还包括步骤6)：测试分析碱性纤维素酶的酶学性质。

进一步的，所述步骤1)中，样品来源于碱性腌竹池。

进一步的，所述步骤3)中，宿主细胞包括酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、汉逊氏酵母、克鲁维酵母等。优选毕赤酵母。

进一步的，上述碱性纤维素酶在纺织布抛光领域的应用。

本发明有益效果：

本发明取样的碱性腌竹池位于广东省四会市邓村历史悠久，当地族谱和县志记载，古时中原人迁徙至该地区，带来了古法造竹纸的技术，利用当地丰富的竹资源和水资源，开始设立作坊造纸。该类腌竹池是专用于石灰水浸泡竹子，池中供微生物利用的碳源只有竹纤维，且检测得到改类碱性腌竹池的ph值为10，可认为该腌竹池同时具备碱性与富含纤维素这两个条件，是真正的碱性纤维质环境。池中的微生物历经近千年，产生了微生物(尤其是碱性纤维素酶)的进化。该古法造竹纸的技术已得到很好的保护和传承，该种碱性腌竹池目前也仍存续使用且使用状态稳定，而在同一采样点，并用同样的方法是可以重复获得表达本发明的碱性纤维素酶的基因的，且在该腌竹池使用状态稳定的情况下，一定时期内其中的微生物基因突变概率很小很小，甚至不突变。此处的“一定时期”可以百年计。

本发明以上述碱性、并且富含纤维素的碱性腌竹池的样品为研究对象，生长于该类腌竹池中的细菌长期以纤维素作为优势碳源，进化出了较强的、适于碱性ph的纤维素降解能力。利用分子生物学手段从真正的碱性纤维质环境中分离纤维素酶基因，序列分析显示其与已经报道的纤维素酶同源性低于50％。进一步将分离的基因在微生物中进行重组表达。对重组表达的纤维素酶进行酶学性质分析，其在中碱性ph条件下具有较高酶活，应用于纺织抛光亦有很好效果。

本发明所获得的碱性纤维素酶基因是通过宏基因组技术从真正的碱性高纤维环境中筛选得到的，避免传统的筛菌及克隆过程，应用效果明显，可用于纺织、洗涤、造纸等行业。

附图说明

图1样本宏基因组dna电泳图。

图2碱性纤维素酶基因cel6561扩增电泳图。

图3表达载体ppic9k-cel6561。

图4转化子降解羧甲基纤维素能力筛选。

图5碱性纤维素酶cel6561的ph特性。

图6碱性纤维素酶cel6561的温度特性。

图7碱性纤维素酶cel6561处理织物抛光实验。

具体实施方式

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

实施例1

获取样本的宏基因组及测序

首先将50ml样本置于50ml离心管中，剧烈震荡，100g低速离心10min，去掉底部竹纤维，上清转移至新离心管4600g离心30min，取沉淀并用磷酸钾缓冲液重新两遍，离心收集菌体作为宏基因组提取的样本。

使用快速土壤dna分离试剂盒(生工生物)提取宏基因组dna，电泳检测提取的宏基因组dna(图1)，泳道1和2有明显dna条带，宏基因组dna提取成功。提取的dna样品送往北京贝瑞和康生物技术有限公司做宏基因组测序。测序数据显示，cel6561序列包含糖基水解家族9的保守结构域，判定其具有纤维水解能力，将其核苷酸序列列为纤维素酶基因序列。cel6561的核酸序列全长1602bp(见seqidno.1)，氨基酸(见seqidno.2)533个。将氨基酸序列上传至ncbi数据库比对显示，序列cel6561与现有数据库中的蛋白(ncbi登录号wp_073281770)同源性最高只有49％。

综上所述，可以确定cel6561是不同于现有碱性纤维素酶的新的碱性纤维素酶。

实施例2纤维素酶cel6561序列的重组表达

根据cel6561核酸序列，设计引物：

6561-f：ccggaattcagtacgataaacaagaagattagagg，

6561-r:ataagaatgcggccgcttaaatgagcacagacaacaaat

在序列两端引入合适的酶切位点ecori和noti。扩增体系是：引物6561-f(10mm)1ul、引物6561-r(10mm)1ul、模版1ul(10ng/ul)、primestarmix25ul、补ddh2o至50ul；扩增程序如下：98℃，10s；63℃，5s；72℃，10s；循环数30次。扩增产物电泳检测如图2，1600bp处有明显条带。对获得的基因片段采用ecori和noti酶切，然后引入ppic9k质粒(购于neb公司)中，得到的重组质粒命名为ppic9k-cel6561(图3)，经酶切及测序检测(英潍捷基生物公司)，序列正确，见seqidno.3。

酶切体系(50μl)：限制性内切酶共2μl，酶切缓冲液5μl，质粒＜1μg，剩余体积用水补齐。

连接体系(15μl)：连接酶反应液10μl，ecori-ppic9k-noti长片段5μl，ecori-cel6561-noti短片段2.5μl，补ddh20至20μl。

将质粒ppic9k-cel6561用sacii线性化后，电转gs115毕赤酵母，在md板上筛选转化子，在添加g418的ypd板上筛选拷贝数较高的转化子，在ypc(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1％羧甲基纤维素)板上筛选降解纤维能力较高的转化子(图4)。1号转化子(命名为gs115-cel1)具有最大的水解圈，具有最高的纤维素降解活力。

实施例3重组纤维素酶的发酵及酶学性质分析

将转化子gs115-cel1单菌落挑于含50mlbmgy培养基的250ml的三角瓶中，30℃，250rpm过夜培养；室温3000g离心5min收集菌体，用10mlbmmy培养基重悬细胞于50ml离心管中继续培养；每隔24h添加终浓度为0.5％的甲醇继续诱导纤维素酶表达；每隔24h取样测纤维素酶酶活，第五天酶活最高，达56u/ml,用第五天的酶样做酶学性质分析，最佳ph为6-6.5,在ph7至ph8也保留了60％以上的酶活(图5)；最佳温度40-60℃(图6)，超过70℃酶活损失较严重。

实施例4纤维素酶纺织布抛光应用实验

称取100g烘干的棉布加入ph6.0的8公斤水中，将水与布一起倒入洗衣机中，添加本发明申请发酵的纤维素酶液100g，机器温度控制在55℃，转速180rpm，运行时间1h；对照组用清水替代酶液，其他条件不变。抛光完成后，将布匹完全烘干，称重，计算失重率。并查看抛光效果(布匹表面微小绒毛有无减少)。结果如图7显示，实验组明显具备较好的抛光效果，对照组表面仍然具有大量的微小纤毛。实验组失重率为2.1％，对照组失重率仅为0.12％，可见纤维素酶cel6561具备较好的抛光潜力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广州中国科学院先进技术研究所

<120>一种碱性纤维素酶及其制备和应用

<130>cnp201710367

<141>2017-11-06

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1602

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgagtacgataaacaagaagattagaggaaatcaagtagggtatgatccagaatttgag60

aagatattgattataaaagatccaacttctctaagatatcaattaaaaaaagatgaacaa120

ctcatagaacagggaatattaagtaaagctactactcacccatatacacgtgaggaggat180

tatttttgtgacctcagtcatgtgaaagtagaaggtgtttatcaattaatgatagaagat240

atggcgggatactttccttttgtagttaagaaaaactgctacgaagatttattattaaat300

accctgcgctttttttatcttcagagatgcggagaaaaccttccagaagaatttgctaat360

gagtttcagcatagaagttgtcacgatcagcatgctcgtatttatggaacaaatcaaagg420

atttctgtaaacggtggttggcatgatgctggtgattatggtcgttatatcgttgccgca480

gcggtgacagttgctgatttattgttagcatttgaagaaacgcacaaaatttcaactctg540

aatttaagaatacctgaaagcaaattacagattccagatttgttgagtgagattcgctat600

gaattggaatggatgctttccatgcaaaatcagaataacggacaagtttatcataaagta660

acctgtgccagtttttgtgggtttattatgccggaagaagagcaggaagaattagttgtt720

acggagccttcgattacagcaaccgcaacctttgcagctacgactgctatggcagttgca780

ttttatgaatcttttgacaaagatttttcggaacgtttaaaacaagcttcgaaagcggct840

tatgatgcattgaaggacatgcatatgccagaagggtttaaaaatccagatggagttgta900

acaggagagtatggtgatggaaaggatattgacgaaagatactgggctgcagcggcatta960

tataaggcttttggagaatcaaagtatcgagaagactttgaaacattggccaaaaaagaa1020

gttcttcatggctatggatgggaggaagttggaagttttgggaatcaggcttatctcaca1080

acagaaaatttcccgatagatgaaaatttacgggaagaaattcaaaaacaaatgatcaaa1140

aaagcagatgaacttgaggaaaaaatagcgatagaaccttatggagtttcgttttctgaa1200

agcgattatatttggggcagtaatatgtatgcggcagaaaatggcaatcatttatttgat1260

gcttatagaatcacaaagaatgtcgcatatttaaatcatgcaagaagccagctacattat1320

ttgctagggaaaaatccatgcggatattgttatgtaactggatttggttttttatcacca1380

aagtacccacatcacagaccgtcttcggccgtagggaaaccaatggaaggtatgttggtt1440

ggtggaccggatcgtggtctgaatgatcccgcagcggtagaatttcttaaggatcagtca1500

gccccatgttgctatgtagatgatgagggaagttattctacaaatgaagttaccatttac1560

tggaactctgcactggtgtatttgttgtctgtgctcatttaa1602

<210>2

<211>533

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metserthrileasnlyslysileargglyasnglnvalglytyrasp

151015

proglupheglulysileleuileilelysaspprothrserleuarg

202530

tyrglnleulyslysaspgluglnleuilegluglnglyileleuser

354045

lysalathrthrhisprotyrthrargglugluasptyrphecysasp

505560

leuserhisvallysvalgluglyvaltyrglnleumetilegluasp

65707580

metalaglytyrpheprophevalvallyslysasncystyrgluasp

859095

leuleuleuasnthrleuargphephetyrleuglnargcysglyglu

100105110

asnleuproglugluphealaasnglupheglnhisargsercyshis

115120125

aspglnhisalaargiletyrglythrasnglnargileservalasn

130135140

glyglytrphisaspalaglyasptyrglyargtyrilevalalaala

145150155160

alavalthrvalalaaspleuleuleualapheglugluthrhislys

165170175

ileserthrleuasnleuargileprogluserlysleuglnilepro

180185190

aspleuleusergluileargtyrgluleuglutrpmetleusermet

195200205

glnasnglnasnasnglyglnvaltyrhislysvalthrcysalaser

210215220

phecysglypheilemetprogluglugluglnglugluleuvalval

225230235240

thrgluproserilethralathralathrphealaalathrthrala

245250255

metalavalalaphetyrgluserpheasplysaspphesergluarg

260265270

leulysglnalaserlysalaalatyraspalaleulysaspmethis

275280285

metprogluglyphelysasnproaspglyvalvalthrglyglutyr

290295300

glyaspglylysaspileaspgluargtyrtrpalaalaalaalaleu

305310315320

tyrlysalapheglygluserlystyrarggluaspphegluthrleu

325330335

alalyslysgluvalleuhisglytyrglytrpglugluvalglyser

340345350

pheglyasnglnalatyrleuthrthrgluasnpheproileaspglu

355360365

asnleuargglugluileglnlysglnmetilelyslysalaaspglu

370375380

leugluglulysilealailegluprotyrglyvalserpheserglu

385390395400

serasptyriletrpglyserasnmettyralaalagluasnglyasn

405410415

hisleupheaspalatyrargilethrlysasnvalalatyrleuasn

420425430

hisalaargserglnleuhistyrleuleuglylysasnprocysgly

435440445

tyrcystyrvalthrglypheglypheleuserprolystyrprohis

450455460

hisargproserseralavalglylysprometgluglymetleuval

465470475480

glyglyproaspargglyleuasnaspproalaalavalglupheleu

485490495

lysaspglnseralaprocyscystyrvalaspaspgluglysertyr

500505510

serthrasngluvalthriletyrtrpasnseralaleuvaltyrleu

515520525

leuservalleuile

530

<210>3

<211>10866

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggccgcgaattaattcgccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacga60

gaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagaga120

tgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttg180

tcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaat240

atcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttccca300

ctcctcttcagagtacagaagattaagtgagaagttcgtttgtgcaagcttatcgataag360

ctttaatgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaa420

tctaacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggc480

ttggttatgccggtactgccgggcctcttgcgggatatcgtccattccgacagcatcgcc540

agtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcgcacccgtt600

ctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttgga660

gccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatctatcgaatctaa720

atgtaagttaaaatctctaaataattaaataagtcccagtttctccatacgaaccttaac780

agcattgcggtgagcatctagaccttcaacagcagccagatccatcactgcttggccaat840

atgtttcagtccctcaggagttacgtcttgtgaagtgatgaacttctggaaggttgcagt900

gttaactccgctgtattgacgggcatatccgtacgttggcaaagtgtggttggtaccgga960

ggagtaatctccacaactctctggagagtaggcaccaacaaacacagatccagcgtgttg1020

tacttgatcaacataagaagaagcattctcgatttgcaggatcaagtgttcaggagcgta1080

ctgattggacatttccaaagcctgctcgtaggttgcaaccgatagggttgtagagtgtgc1140

aatacacttgcgtacaatttcaacccttggcaactgcacagcttggttgtgaacagcatc1200

ttcaattctggcaagctccttgtctgtcatatcgacagccaacagaatcacctgggaatc1260

aataccatgttcagcttgagcagaaggtctgaggcaacgaaatctggatcagcgtattta1320

tcagcaataactagaacttcagaaggcccagcaggcatgtcaatactacacagggctgat1380

gtgtcattttgaaccatcatcttggcagcagtaacgaactggtttcctggaccaaatatt1440

ttgtcacacttaggaacagtttctgttccgtaagccatagcagctactgcctgggcgcct1500

cctgctagcacgatacacttagcaccaaccttgtgggcaacgtagatgacttctggggta1560

agggtaccatccttcttaggtggagatgcaaaaacaatttctttgcaaccagcaactttg1620

gcaggaacacccagcatcagggaagtggaaggcagaattgcggttccaccaggaatatag1680

aggccaactttctcaataggtcttgcaaaacgagagcagactacaccagggcaagtctca1740

acttgcaacgtctccgttagttgagcttcatggaatttcctgacgttatctatagagaga1800

tcaatggctctcttaacgttatctggcaattgcataagttcctctgggaaaggagcttct1860

aacacaggtgtcttcaaagcgactccatcaaacttggcagttagttctaaaagggctttg1920

tcaccattttgacgaacattgtcgacaattggtttgactaattccataatctgttccgtt1980

ttctggataggacgacgaagggcatcttcaatttcttgtgaggaggccttagaaacgtca2040

attttgcacaattcaatacgaccttcagaagggacttctttaggtttggattcttcttta2100

ggttgttccttggtgtatcctggcttggcatctcctttccttctagtgacctttagggac2160

ttcatatccaggtttctctccacctcgtccaacgtcacaccgtacttggcacatctaact2220

aatgcaaaataaaataagtcagcacattcccaggctatatcttccttggatttagcttct2280

gcaagttcatcagcttcctccctaattttagcgttcaaacaaaacttcgtcgtcaaataa2340

ccgtttggtataagaaccttctggagcattgctcttacgatcccacaaggtgcttccatg2400

gctctaagaccctttgattggccaaaacaggaagtgcgttccaagtgacagaaaccaaca2460

cctgtttgttcaaccacaaatttcaagcagtctccatcacaatccaattcgatacccagc2520

aacttttgagttcgtccagatgtagcacctttataccacaaaccgtgacgacgagattgg2580

tagactccagtttgtgtccttatagcctccggaatagactttttggacgagtacaccagg2640

cccaacgagtaattagaagagtcagccaccaaagtagtgaatagaccatcggggcggtca2700

gtagtcaaagacgccaacaaaatttcactgacagggaactttttgacatcttcagaaagt2760

tcgtattcagtagtcaattgccgagcatcaataatggggattataccagaagcaacagtg2820

gaagtcacatctaccaactttgcggtctcagaaaaagcataaacagttctactaccgcca2880

ttagtgaaacttttcaaatcgcccagtggagaagaaaaaggcacagcgatactagcatta2940

gcgggcaaggatgcaactttatcaaccagggtcctatagataaccctagcgcctgggatc3000

atcctttggacaactctttctgccaaatctaggtccaaaatcacttcattgataccatta3060

ttgtacaacttgagcaagttgtcgatcagctcctcaaattggtcctctgtaacggatgac3120

tcaacttgcacattaacttgaagctcagtcgattgagtgaacttgatcaggttgtgcagc3180

tggtcagcagcatagggaaacacggcttttcctaccaaactcaaggaattatcaaactct3240

gcaacacttgcgtatgcaggtagcaagggaaatgtcatacttgaagtcggacagtgagtg3300

tagtcttgagaaattctgaagccgtatttttattatcagtgagtcagtcatcaggagatc3360

ctctacgccggacgcatcgtggccgacctgcagggggggggggggcgctgaggtctgcct3420

cgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaa3480

gtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaac3540

ttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaac3600

tcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctct3660

gccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaa3720

actgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgta3780

atgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctg3840

cgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggt3900

tatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttat3960

gcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcg4020

catcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgc4080

tgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcg4140

catcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcc4200

cggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatgg4260

tcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcat4320

tggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccataca4380

atcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatata4440

aatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatat4500

ggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatg4560

atatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtggctttccc4620

ccccccccctgcaggtcggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcg4680

ccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcg4740

gcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatg4800

caccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaa4860

tgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagtatctatgattggaagtatgggaatggtga4920

tacccgcattcttcagtgtcttgaggtctcctatcagattatgcccaactaaagcaaccg4980

gaggaggagatttcatggtaaatttctctgacttttggtcatcagtagactcgaactgtg5040

agactatctcggttatgacagcagaaatgtccttcttggagacagtaaatgaagtcccac5100

caataaagaaatccttgttatcaggaacaaacttcttgtttcgaactttttcggtgcctt5160

gaactataaaatgtagagtggatatgtcgggtaggaatggagcgggcaaatgcttacctt5220

ctggaccttcaagaggtatgtagggtttgtagatactgatgccaacttcagtgacaacgt5280

tgctatttcgttcaaaccattccgaatccagagaaatcaaagttgtttgtctactattga5340

tccaagccagtgcggtcttgaaactgacaatagtgtgctcgtgttttgaggtcatctttg5400

tatgaataaatctagtctttgatctaaataatcttgacgagccaaggcgataaataccca5460

aatctaaaactcttttaaaacgttaaaaggacaagtatgtctgcctgtattaaaccccaa5520

atcagctcgtagtctgatcctcatcaacttgaggggcactatcttgttttagagaaattt5580

gcggagatgcgatatcgagaaaaaggtacgctgattttaaacgtgaaatttatctcaaga5640

tctctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccgga5700

gacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtc5760

agcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagt5820

gtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcgg5880

tgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcc5940

tcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactca6000

aaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagca6060

aaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccatagg6120

ctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccg6180

acaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt6240

ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctt6300

tctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggc6360

tgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtctt6420

gagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggatt6480

agcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggc6540

tacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaa6600

agagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtt6660

tgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttct6720

acggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatta6780

tcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaa6840

agtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatc6900

tcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataact6960

acgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgc7020

tcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagt7080

ggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagta7140

agtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtg7200

tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagtt7260

acatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtc7320

agaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctctt7380

actgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattc7440

tgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataatacc7500

gcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaa7560

ctctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaac7620

tgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaa7680

aatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctt7740

tttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaa7800

tgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacct7860

gacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgagg7920

ccctttcgtcttcaagaattaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctgactc7980

atgttggtattgtgaaatagacgcagatcgggaacactgaaaaataacagttattattcg8040

agatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacag8100

gtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgt8160

tgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaacc8220

agcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctacta8280

acaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgttta8340

tttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctg8400

agtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgct8460

gtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcg8520

ttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcgccataccgtttgt8580

cttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtct8640

ctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgct8700

ttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatact8760

gctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaat8820

atataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagctt8880

actttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacga8940

caacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaaggatccaaacgatgagatttcct9000

tcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacact9060

acaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagattta9120

gaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattg9180

tttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctcgagaaaag9240

agaggctgaagcttacgtagaattcagtacgataaacaagaagattagaggaaatcaagt9300

agggtatgatccagaatttgagaagatattgattataaaagatccaacttctctaagata9360

tcaattaaaaaaagatgaacaactcatagaacagggaatattaagtaaagctactactca9420

cccatatacacgtgaggaggattatttttgtgacctcagtcatgtgaaagtagaaggtgt9480

ttatcaattaatgatagaagatatggcgggatactttccttttgtagttaagaaaaactg9540

ctacgaagatttattattaaataccctgcgctttttttatcttcagagatgcggagaaaa9600

ccttccagaagaatttgctaatgagtttcagcatagaagttgtcacgatcagcatgctcg9660

tatttatggaacaaatcaaaggatttctgtaaacggtggttggcatgatgctggtgatta9720

tggtcgttatatcgttgccgcagcggtgacagttgctgatttattgttagcatttgaaga9780

aacgcacaaaatttcaactctgaatttaagaatacctgaaagcaaattacagattccaga9840

tttgttgagtgagattcgctatgaattggaatggatgctttccatgcaaaatcagaataa9900

cggacaagtttatcataaagtaacctgtgccagtttttgtgggtttattatgccggaaga9960

agagcaggaagaattagttgttacggagccttcgattacagcaaccgcaacctttgcagc10020

tacgactgctatggcagttgcattttatgaatcttttgacaaagatttttcggaacgttt10080

aaaacaagcttcgaaagcggcttatgatgcattgaaggacatgcatatgccagaagggtt10140

taaaaatccagatggagttgtaacaggagagtatggtgatggaaaggatattgacgaaag10200

atactgggctgcagcggcattatataaggcttttggagaatcaaagtatcgagaagactt10260

tgaaacattggccaaaaaagaagttcttcatggctatggatgggaggaagttggaagttt10320

tgggaatcaggcttatctcacaacagaaaatttcccgatagatgaaaatttacgggaaga10380

aattcaaaaacaaatgatcaaaaaagcagatgaacttgaggaaaaaatagcgatagaacc10440

ttatggagtttcgttttctgaaagcgattatatttggggcagtaatatgtatgcggcaga10500

aaatggcaatcatttatttgatgcttatagaatcacaaagaatgtcgcatatttaaatca10560

tgcaagaagccagctacattatttgctagggaaaaatccatgcggatattgttatgtaac10620

tggatttggttttttatcaccaaagtacccacatcacagaccgtcttcggccgtagggaa10680

accaatggaaggtatgttggttggtggaccggatcgtggtctgaatgatcccgcagcggt10740

agaatttcttaaggatcagtcagccccatgttgctatgtagatgatgagggaagttattc10800

tacaaatgaagttaccatttactggaactctgcactggtgtatttgttgtctgtgctcat10860

ttaagc10866