一种用于测定α‑羟基丁酸脱氢酶的稳定试剂的制作方法

本申请涉及生物化学和临床检验领域。更具体而言，本申请涉及一种用于测定α-羟基丁酸脱氢酶的试剂。

背景技术：

α-羟基丁酸脱氢酶(α-hydoxybutyratedehydrogenase，α-hbdh)是心肌酶谱中的一种酶，主要分布于心肌、红细胞、白细胞及肾脏等。血清中α羟基丁酸脱氢酶的测定，用于帮助诊断肝病或心脏病。血清中α羟基丁酸脱氢酶的升高常见于急性心肌梗塞、骨骼肌损伤、急性肝炎、白血病及恶性肿瘤等(enzymaticassessmentofmyocardialdamage.geriatrics.1967，22(10):184-200；哺乳动物α-羟基丁酸脱氢酶的测定及临床意义.内江师范学院学报，journalofneijiangteacherscollege，2005)。

目前，体外测定α-hbdh的方法主要采用dgkc方法(有时也作速率法)。该方法的具体检测原理是：α-羟丁酸脱氢酶催化α-酮丁酸还原成α-羟丁酸，同时使nadh氧化成nad+(国产α-羟丁酸脱氢酶试剂的评价，中国医学检验杂志,2006(2):122-123)。

目前市售产品也多采用这种测定法，例如：保定长城临床试剂有限公司生产的α-羟基丁酸脱氢酶测定试剂盒(速率法)，试剂盒由r1、r2试剂组成；r1包含磷酸盐缓冲液50mmol/l(ph7.5±0.1)、α-酮丁酸3.3mmol/l；r2包含tris缓冲液100mmol/l(ph9.0±0.1)、nadh0.3mmol/l。

对于诊断试剂的稳定性研究，本领域常采用加速稳定性实验来预测产品的失效期(用于评价货架稳定性，有时也被称作长期稳定性或者有效期)。这样的方法优点在于研究周期短(通常数周即可)，不用真正地将试剂存放1年、2年、甚至更长的时间。但是，加速稳定性的理论基础是阿伦尼乌斯公式(arrheniusequation)。为了确保预测的准确性，要想适用该公式，则对试剂有着较多的要求。这是一种理想状态下的预测。然而，生化试剂的成分复杂、种类繁多，并不是任何试剂都能完美地适用加速稳定性实验来预测其真正效期。

除此外，试剂的稳定性不应当狭义地理解为货架稳定性(长期稳定性)。这是因为，试剂在实际操作使用中，并不是单纯地静置在环境条件恒定的库房当中(恒定的温湿度、避免光照直射、无震动)，而是可能暴露在变化的环境中。例如，在运输过程中(搬运、颠簸)，会接触到机械力的作用，也会遇到温度上的变化(尽管可以采用冷链运输，也无法避免温湿度时刻恒定)。再比如，在临床机构中，样本的检测都是在大型设备(生化分析仪)上进行。这种操作方式允许多个样本(从数十个至上百个样本)依次或同时检测。那么，试剂将会被从其稳定的储存环境中脱离出来，并且打开包装上机待用。这个过程同样无法避免温湿度的变化，并且样本开盖后接触空气，面临着氧化的因素。因此，这种情况下，加速稳定性实验无法评价其它方面的稳定性(iso标准23640-2011，invitrodiagnosticmedicaldevices-evaluationofstabilityofinvitrodiagnosticreagents)。

现在市面上多采用双试剂的酶偶联的连续检测方法检测血清α-hbdh，由于试剂中酶和nadh的存在，使得试剂在运输过程中、以及在打开瓶盖上机操作时不稳定，这为检测α-hbdh带来困难。

鉴于上述需求，本领域仍然需要一种稳定性强的双试剂血液α-羟基丁酸脱氢酶检测试剂。

技术实现要素：

根据本申请的一些实施方式，提供了一种用于测定样本中α-羟基丁酸脱氢酶的试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂。

在一些实施方式中，第一试剂包含：

tris，ph6.550mmol/l

α-酮丁酸4.4mmol/l。

在一些实施方式中，第二试剂包含：

在一些实施方式中，本申请的试剂盒用于检测样本中α-羟基丁酸脱氢酶的含量。在一些实施方式中，样本选自以下的任一项：血清、血浆、尿液、全血。

在一些实施方式中，第二试剂包含：

在一些实施方式中，第二试剂包含：

在一些实施方式中，第二试剂包含：

在一些实施方式中，本申请的试剂盒还包含质控品和/或校准品。

在一些具体的实施方式中，质控品可以是自行配制的，也可以是市售产品；例如朗道生化多项质控品。

在一些具体的实施方式中，校准品可以是自行配制的，也可以是市售产品；例如朗道生化多项校准品。

根据本申请的一些实施方式，还提供了一种制备α-羟基丁酸脱氢酶检测试剂盒的方法，包括：

步骤1)提供第一试剂，所述第一试剂包含：

tris，ph6.550mmol/l

α-酮丁酸4.4mmol/l；

步骤2)提供第二试剂，所述第二试剂包含：

步骤3)将所述第一试剂和所述第二试剂组装成试剂盒；

步骤1)和步骤2)顺序可互换。

在一些其它实施方式中，本申请的制备方法还包括并入选自以下任一项的步骤：质控品、校准品、使用说明书、或其组合。

在一些实施方式中，还提供了一种制备α-羟基丁酸脱氢酶检测试剂盒的方法，包括以下步骤：

步骤1)提供第一试剂：

-1l烧杯中加入800ml的水，称取tris、α-酮丁酸放入水中，搅拌溶解，用4mol/l的hcl调节ph值至6.5±0.05，并定容至1l，混匀为第一试剂。

步骤2)提供第二试剂：

-用100ml烧杯称量tritonx-100，加水在电磁炉上加热溶解后，放在室温(18-40摄氏度)下，冷却至室温备用；

-在1l烧杯中加入800ml的水，称取tris、edta放入水中，搅拌溶解，用4mol/l的hcl调节ph值至8.9±0.05，依次量取proclin、bsa溶于以上溶液，搅拌溶解，加入tritonx-100溶液搅拌均匀；

-称量、nadh加入到上述溶液中，缓慢搅拌至溶解，并定容至1l，混匀为第二试剂。

根据本申请的一些实施方式，还提供了一种用于提高α-羟基丁酸脱氢酶检测试剂的稳定性的方法，包括步骤：

步骤1)按照以下成分，制备第二试剂：

tris，ph8.950mmol/l

nadh1.27mmol/l

edta5mmol/l；

步骤2)向步骤1)的所述第二试剂中加入0.1g/l至5g/ltritonx-100、0.5g/l至5g/lbsa以及0.5ml/l至1ml/l的proclin；

任选地，步骤3)按照以下成分，制备第一试剂：

tris，ph6.550mmol/l

α-酮丁酸4.4mmol/l；

所述步骤3)在步骤1)之前或步骤2)之后。

在一些实施方式中，所述的proclin是pc300或pc950。

附图说明

图1：加速稳定性实验中，试剂的空白吸光度。

图2：加速稳定性实验中，高值样本测量结果。

图3：长期稳定性实验，试剂的空白吸光度结果。

图4：机载稳定性实验，试剂的空白吸光度结果。

具体实施方式

实施例1：对比试剂盒的配制

第一试剂r1：

tris，ph6.550mmol/l

α-酮丁酸4.4mmol/l；

第二试剂r2：

tris，ph8.950mmol/l

nadh1.27mmol/l

edta5mmol/l。

实施例2：测试试剂盒的配制

第一试剂r1的配制方法同实施例1；第二试剂r2的配制方法参见表1。

表1.不同测试试剂盒的r2试剂组成

测试例

测试例1.加速稳定性(也作热稳定性)

1.东芝-40全自动生化分析仪设置参数：

2.试剂空白吸光度：参见图1、表2。

3.高值样本：参见图2、表3。

4.结果分析：各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11的试剂效果最好，空白吸光度较对照试剂盒好很多，变化幅度最小，最稳定。线性也是变化最小的，下降在1％范围内。

表2.空白吸光度

表3.线性高值

测试例2.长期稳定性(也作货架稳定性)

1.测试方法：试剂原包装保存于2-8℃条件下。每隔一个月检测一次，共6个月。

2.试剂空白吸光度：参加图3和表4。

3.结果分析：各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11试剂盒的效果最好，变化幅度最小，最稳定。

表4.长期稳定性6个月的检测结果

测试例3.运输稳定性

1.运输稳定性的测试方法：试剂在夏季和冬季分别将试剂盒物流快递至最冷和最热的地区，物流返回后与2-8℃条件下保存的试剂进行对照测定。

2.试剂空白吸光度如表5所示。

表5.运输稳定性

各组试剂空白吸光度差异显著。实例11的效果最好，变化幅度最小，最稳定。

测试例4.机载稳定性

1.测试方法：试剂在全自动生化分析以上检测合格后，机器连续运转，试剂敞口放置在仪器中，前一个月每半个月检测一次，后两个月每个月检测一次，检测至90天。

2.结果见图4和表6。各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11的效果最好，变化幅度最小，最稳定。

表6.机载稳定性