siRNA-FAM136A及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及在人肺癌细胞中沉默高表达fam136a基因蛋白的sirna-fam136a及其构建方法和应用。

背景技术：

云南宣威肺癌全球高发，研究发现宣威籍人群脱离生活煤烟(二叠纪烟煤)污染后，发病率仍居高不下，提示其极高的肺癌发病率可能与某些内在致病基因相关并发挥更重要的作用。令人遗憾的是：由于地缘、经济等因素导致其发病机理长期未获得突破性进展。因此，深入开展针对性的基因筛查研究有望为该地区肺癌防治提供新的干预策略。

最新研究表明，序列相似家族成员136a(familywithsequencesimilarity136，membera，fam136a)在生物进化中高度保守，分子量15.6kda，细胞亚定位于线粒体，可能与肿瘤发生密切相关。目前为止，尚无一种在肺癌组织中特异性高表达的基因，因此探寻新的肺癌组织相对特异高表达的基因，从分子、细胞、动物、临床组织四个方面阐明其在肺癌的发生、发展变化中的复杂分子调控作用机理及其有关信号转导过程与机制，不仅有重要的分子/细胞生物学意义，而且对肺癌的早期基因诊断及精准治疗，均具有重大临床应用价值和社会效应，有望取得新的突破。

因此，研究和开发在肺癌中高表达的基因和/或蛋白具有重大理论和现实意义。本领域迫切需要研究新的肺癌组织高表达基因和/或蛋白，目前尚无fam136a在恶性肿瘤尤其是在肺癌中的研究报道。

技术实现要素：

本发明涉及构建在人肺癌细胞中沉默高表达fam136a蛋白的sirna-fam136a，其特征在于：包含特异性靶向序列1“gaaggaggctctcttatca”和序列2“ggtgcaccatgcattgcaa”，此sirna-fam136a可以特异性沉默肺腺癌细胞a549中fam136a的蛋白表达。

同时，本发明还涉及sirna-fam136a的构建方法及其应用，其包括如下步骤：

一、构建在人肺癌细胞中沉默高表达的fam136a蛋白的sirna-fam136a：(1)利用ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人fam136a基因的编码(cds)区序列(4部分)

78..164:atggctgagctgcagcagctccgggtgcaggaggcggtggagtccatggtgaagagtctggaaagagagaacatccggaagatgcag

1109..1249:ccagggtctcatgttccggtgcagcgccagctgttgtgaggacagccaggcctccatgaagcaggtgcaccagtgcatcgagcgctgccatgtgcctctggctcaagcccaggctttggtcaccagtgagctggagaagttccag

1115..1249:ccagggtctcatgttccggtgcagcgccagctgttgtgaggacagccaggcctccatgaagcaggtgcaccagtgcatcgagcgctgccatgtgcctctggctcaagcccaggctttggtcaccagtgagctggagaagttccag

4612..4800:gaccgcctggcccggtgcaccatgcattgcaacgacaaagccaaagattcaatagatgctgggagtaaggagcttcaggtgaagcagcagctggacagttgtgtgaccaagtgtgtggatgaccacatgcacctcatcccaactatgaccaagaagatgaaggaggctctcttatcaattggaaaataa

(2)合成rna的dna模板序列

上链5‘taatacgactcacatag3’，为t7启动子，

正义链下链1：3‘attatgctgagtgatatcgaaggaggctctcttatca5’编码fam136a正义链4625-4643序列，

反义链下链1：3‘attatgctgagtgatatccttcctccgagagaatagt5’

正义链下链2：3‘attatgctgagtgatatcggtgcaccatgcattgcaa5’编码fam136a正义链4770-4788序列，

反义链下链2：3‘attatgctgagtgatatcccacgtggtacgtaacgtt5’

(3)模板链退火

取上链模板与等量下链模板1、2、3、4分别混合，95℃水浴5min，自然冷却至室温退火。(模板链浓度20μmol/l，退火后双链dna为10μmol/l)

(4)sirna-fam136a合成

sirna合成体系

混匀后离心200rpm，1min，置入37℃温箱孵育过夜。

(5)rna分离、纯化

将上述rna反应液加入dnasei2u，混匀后37℃孵育40min，

(6)向上述液体加入等体积酚：氯仿，混匀，

(7)4℃、18000rpm离心20min，分离有机/水相，

(8)将水相移入一新eppendorf管，加入1/10体积3.0mol/l乙酸钠，混匀，

(9)加入2备体积预冷乙醇，混匀，冰浴2h，

(10)4℃、18000rpm离心50min，

(11)去除上清液，加入1/2体积70％乙醇，4℃、18000rpm离心20min，去上清，室温干燥，

(12)向上述沉淀加入50μldepc处理水，即为含rna溶液。

二、通过westernblotting方法检测所构建sirna-fam136a的蛋白沉默效果。

(1).a549细胞转染：

1.第一天，取生理状态良好的a549细胞2.5×10⁵细胞接种在6孔板上，2ml含10％fbsdmem/f12细胞培养基培养。

2.第二天细胞汇合达到30-50％，进行转染；

3.在250μl的无血清opti-mem，培养基加入10pmolsirna，柔和混匀；室温静置5min。

4.用250μl无血清的opti-mem稀释5μllipofectamine^tm2000，轻轻混匀，室温放置5分钟；

5.将稀释好的sirna和lipofectamine^tm2000transfectionreagents试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成sirna/lipofectamine^tm2000transfectionreagents复合物。

6.将500μlsirna/lipofectamine^tm2000transfectionreagents复合物加到6孔细胞中，来回轻柔摇晃细胞培养板。

7.细胞在co2培养箱中37℃温育48h后，进行转染后的其它检测步骤。

(2).电泳

1、收集转染后的细胞，并提取蛋白。

2、固定凝胶板，配制浓度为12％的分离胶。

3、将分离胶填充玻璃夹层(高约5cm)后，用异丙醇封顶，静置约40min。

4、待分离胶凝固后，弃去封顶的异丙醇，小心用吸水纸吸干。

5、配制5％压缩胶，填充剩余玻璃夹层。

6、将梳子插入压缩胶内，静置约40min。

7、用冰盒取蛋白，加入loadingbuffer，煮沸3min(loadingbuffer：蛋白＝1：4)。

8、取出梳子，将凝胶板固定在电泳槽上，加入缓冲液(1～2块加至2，3～4块加至4)。

9、将蛋白加入样品孔，接上电源(先80v，后120v)，至溴酚蓝跑至底部即可。100min

(3)转膜

1.取8张滤纸和1张膜，将膜浸入甲醇后再浸入半干转膜缓冲液中，滤纸直接浸入转膜缓冲液中。

2.取出凝胶，在转膜槽内按从下到上滤纸——膜——凝胶——滤纸的顺序排列，(注意赶出气泡，放置时，每上层都应小于每下层)。

3.接通电源转膜45min(电压10v～15v)。

(4)封闭

1.配制封闭液即8％脱脂奶粉50ml。

2.将膜放入封闭液中，室温摇床孵育3h。

(5)抗体反应

3.加入一抗fam136a液，4℃摇床孵育过夜(一抗液＝fam136a一抗+叠5％脱脂奶粉，1:500)。

4.用tbst液摇床清洗15min×3，后奶粉清洗15min×1.。

5.加入二抗液，室温摇床孵育1h(二抗液＝二抗+脱脂奶粉)。

6.用tbst液摇床清洗15min×3

(6)胶片曝光

7.取保鲜膜待用，用于放置pvdf膜。

8.配染色发光剂(a液：b液＝1：1各约150ul)。

9.将发光剂均匀涂于膜正面，用保鲜膜包好，赶出气泡。

10.暗室拍片曝光。

三、通过mts法检测sirna-fam136a抑制a549细胞增殖能力的影响。

1.转染(方法同(1))后48h接种细胞：用含10％fbs的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1500个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul。

2.呈色：每孔加mts溶液20ul.继续孵育2h，

3.比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

本发明的实验结果显示：

1、通过转染sirna-fam136a可抑制a549细胞中fam136a基因的蛋白表达。

2、通过转染sirna-fam136a后可以抑制肺腺癌a549细胞的增殖能力。

由此可见，fam136a基因在控制人肺癌细胞方面有较好的应用。

附图说明

图1：转染sirna-fam136a后a549细胞内fam136a蛋白的表达。

图2：转染sirna-fam136a后a549细胞增殖曲线。

具体实施方式

具体实施方式1：sirna-fam136a抑制a549细胞中fam136a基因的蛋白表达。

在本实施例中，以肺腺癌a549细胞作为研究对象，转染sirna-fam136a1、sirna-fam136a2，48h后收集细胞，提取总蛋白，进行蛋白电泳、转膜、封闭、孵育一抗、二抗，洗膜、曝光、拍照。第一条带为转染阴性对照序列sirna，第2、第3条带分别为转染序列sirna-fam136a1、序列sirna-fam136a2，α-tubulin为内参照。从图1可以看出，转染序列sirna-fam136a1或者转染序列sirna-fam136a2后，转染后a549细胞的fam136a蛋白表达显著被下调。

具体实施方式2：sirna-fam136a对肺癌细胞增殖的影响

在本实施例中，以a549肺腺癌细胞作为研究对象，转染sirna-fam136a1、sirna-fam136a2，连续培养3天细胞，最后通过mts方法检测敲减fam136a后a549细胞的增殖情况。从图2可以看出，fam136a基因可以促进肺腺癌细胞a549的增殖，而通过转染序列sirna-fam136a1或者转染序列sirna-fam136a2后肺腺癌细胞a549的增殖能力受到抑制。

由此可见，sirna-fam136a在制备肺癌的药物方面有着应用的前景。