一种用于黄连分子鉴定的标准基因数据库及分子鉴定方法与流程

文档序号：13978297阅读：396来源：国知局

本发明涉及中药材分子鉴定技术，具体涉及利用自主设计的特异引物扩增叶绿体基因ycf1片段快速鉴定药典所规定的中药黄连药材的方法及其应用。

背景技术：

中药黄连是我国知名度极高的大宗常用中药之一,最早在《神农本草经》中便有记载,被列为上品。《中华人民共和国药典》(2010年,一部)中将毛茛科(ranunculaceae)黄连属(coptissalisb.)的三角叶黄连(c.deltoideac.y.cheng&p.k.hsiao)、云南黄连(c.teetawallich)和黄连(c.chinensisfranch.)收载为中药黄连的原植物。众所周知,中药材的准确鉴定是研究中药材质量、确保安全用药及临床疗效的前提和保障。但是,药材市场上中药黄连的来源极其复杂,如产自重庆的峨眉黄连[c.omeiensis(chen)c.y.cheng],安徽、湖南、江西等地的短萼黄连(c.chinensisvar.brevisepalaw.t.wangetp.k.hsiao),云南金平县的五裂黄连(c.quinquesectaw.t.wang),甚至四川雅安地区从日本引进的日本黄连[c.japonica(thunb.)makino]等植物也被当做中药黄连来种植销售。因此,急需开发有效的中药黄连鉴定方法。然而,传统的鉴定方法均存在不同程度的局限,如性状鉴定主要依据叶片的形状、小叶的疏密程度及花萼的长度进行物种的区分，药材鉴定依据根切片的形状、须根的多少及“横桥”的有无等，不同物种间特征性状交叉重叠,种间界限模糊不清,分类鉴定异常困难,而显微鉴定和理化鉴定等方法,由于受鉴定人员经验、药粉直径大小和药材生长、采摘环境的影响,其鉴定结果常常缺乏准确性和可重复性。因此,针对中药黄连来源复杂,传统鉴定方法存在局限的现状,开发一种更简便、快捷、准确、高效的中药黄连鉴别方法迫在眉睫。

dna条形码(dnabarcoding)概念由加拿大分类学家paulhebert于2003年首次提出，其原理是直接利用基因组中一段公认的、标准的、相对较短的dna片段来对物种进行准确鉴定。该技术具有高通量、可重复性、可靠性高等特点，能够实现快速、准确和自动化的物种鉴定，因此为药用植物鉴定带来了新的机遇。目前，我国已有大量的学者相继对190余科700余属5800余种药用植物进行了dna条形码序列筛选及鉴定研究，在建立快速有效的药用植物dna条形码鉴定技术体系方面取得了令人鼓舞的结果。目前，国际生命条形码联盟植物工作组建议将rbcl和matk基因片段作为植物的核心条形码，叶绿体psba-trnh片段和核基因its片段为补充条形码。2012年，刘晓光首次将上述标准条形码片段应用到中药黄连的分子鉴定研究中，但是发现这些dna片段在黄连属植物中变异有限，鉴别能力仅为20％-40％，无法准确鉴定中药黄连，这表明国际生命条形码联盟植物工作组推荐的植物标准dna条形码rbcl,matk,psba-trnh及its在中药黄连的分子鉴定中无法有效利用，因此，建立更全面、更实用的中药黄连dna条形码鉴定体系仍是亟需解决的课题。通过文献检索研究，发现周世良等2015年报道的叶绿体基因ycf1具有高变异、易扩增的优点，是一种极具潜力的候选dna条形码片段。因此，本研究在全球范围广泛取样的基础上，对ycf1片段在黄连属植物中的鉴定效率进行了综合评价，自主设计了适用于黄连属植物的特异性扩增引物，构建了全球黄连属植物的ycf1基因数据库，确定了中药黄连分子鉴定的可靠序列及方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题，在于提供一种ycf1序列鉴定效率在95％以上，极大地提高了中药黄连分子鉴定的成功率的用于黄连分子鉴定的标准基因数据库及分子鉴定方法。

本发明通过下述方案实现：一种用于黄连分子鉴定的标准基因数据库，核苷酸序列为序列表中的序列，包括黄连属植物的ycf1序列矩阵，该矩阵包含全球已知的19种黄连属植物。

一种黄连的分子鉴定方法，其包括以下步骤，

步骤一：样品总dna提取；

步骤二：pcr扩增ycf1基因片段；

步骤三：对ycf1序列测序结果进行拼接，获得ycf1基因片段；

步骤四：构建样品的ycf1序列nj树；

步骤五：根据nj树判断。

一种黄连的分子鉴定方法，其包括以下步骤，

步骤一：dna提取：剪取干燥的样品100mg，然后磨成粉末，提取总dna，对所获得的植物基因组总dna进行检测，检测其dna浓度以及是否降解；

步骤二：pcr扩增及测序：pcr扩增后，检测扩增产物的浓度，浓度合格后进行双向测序；

步骤三：序列校正与比对：将dna测序返回的序列峰图文件进行校正、比对，比对完成后删除两端不可信区域，将获得的序列填加到黄连属植物ycf1基因标准数据库中，进行比对，比对完成后保存序列矩阵，获得ycf1基因片段；

步骤四：构建nj树：将比对拼接完成的序列，基于k-2p模型，构建邻接树，并通过1000次自展检验确定每一分支的支持率；

步骤五：鉴定判断：如果待测样品ycf1序列与药典规定的3种中药黄连药材之一的黄连、三角叶黄连或云南黄连的序列聚类在一起，则说明该样品为中药黄连，否则排除该样品用作中药黄连。

一种黄连的分子鉴定方法，其包括以下步骤，

步骤一：dna提取：剪取干燥的样品100mg，然后用震荡磨样机磨成粉末，用改良ctab法提取总dna，对于dna得率、纯度低的样品一起采用dneasyplantminikit试剂盒提取总dna，所获得的植物基因组总dna均用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测其dna浓度以及是否降解；

步骤二：pcr扩增及测序：pcr扩增后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的浓度，浓度合格进行双向测序；

步骤三：序列校正与比对：将dna测序返回的序列峰图文件导入sequencher4.1.4软件中进行正反向序列自动拼接、编号、人工校正，完成后输出为文本格式导入bioedit软件中进行同片段个体间比对，根据序列峰图对比对结果进行进一步确认确保所有序列差异均为真实变异，比对完成后删除两端不可信区域，将获得的序列填加到黄连属植物ycf1基因标准数据库中，在bioedit软件中进行插入、缺失及变异位点的比对，比对完成后保存序列矩阵，获得ycf1基因片段；

步骤四：构建nj树：将比对拼接完成的序列文件输入mega7软件中，基于k-2p模型，构建邻接树，并通过1000次自展检验确定每一分支的支持率；

所述步骤二中pcr特异扩增引物对为：

正向ycf1-f：5＇-tctcgaaaatcagattgttgt-3＇

反向ycf1-r：5＇-atgtcaaagtgatggaaaa-3＇。

所述步骤二中pcr反应体系为：dna模板2μl，10×dreamtaqgreenbuffer5μl，dntpmix5μl，dmso(二亚甲基亚砜)2μl，bsa(牛血清蛋白)0.5μl，正向引物2μl，反向引物2μl，dreamtaqdnaploymrerase1.5μl，双蒸水加注至50μl。

所述步骤二中pcr扩增程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃扩增1分钟，共30个循环，最终72℃终扩增10分钟。

所述ycf1序列校正比对后的总长度为823bp。

鉴定的黄连为黄连属野生植物或栽培植物的干燥或新鲜的根、茎，叶、花、果实、种子。

本发明的有益效果为：

1、本发明设计了适用于黄连属植物的ycf1序列扩增的特异性引物对，可以高效获取目标序列；

2、本发明提供了目前全球已知的19种黄连属植物的ycf1标准序列矩阵，无论伪品黄连来自于国内还是国外，都能准确鉴定；

3、传统dna条形码片段rbcl,matk,psba-trnh及its在黄连属中的鉴定效率仅为20％-40％，而本发明开发的ycf1序列鉴定效率在95％以上，极大地提高了中药黄连分子鉴定的成功率。

附图说明

图1-7为bioedit软件中展示的19种黄连属(coptis)植物ycf1序列矩阵效果图。

图8为实施例1中通过ycf1基因构建的中药黄连及混伪品的nj树。

具体实施方式

下面结合图1-8对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限所述内容。

为了清楚，不描述实际实施例的全部特征，在下列描述中，不详细描述公知的功能和结构，因为它们会使本发明由于不必要的细节而混乱，应当认为在任何实际实施例的开发中，必须做出大量实施细节以实现开发者的特定目标，例如按照有关系统或有关商业的限制，由一个实施例改变为另一个实施例，另外，应当认为这种开发工作可能是复杂和耗费时间的，但是对于本领域技术人员来说仅仅是常规工作。

实施例1：江西、安徽及四川中药材市场上10份中药黄连的分子鉴定

实验材料

本案例所涉及实验材料为申请人2014-2016年间赴江西、安徽及四川出差期间，于当地中药材市场随机购买的10份所谓的“中药黄连”，具体信息见表1。

表110份“中药黄连”的样品信息

实验仪器

台式高速离心机，pcr仪，电泳仪，紫外光凝胶成像系统，紫外分光光度计，-20℃低温冰箱，震荡磨样机，恒温水浴锅，移液器。

实验步骤

步骤一：dna提取

剪取干燥的样品100mg，尽可能剪成碎片或碎块，用震荡磨样机磨成粉末，用改良ctab法提取总dna。所获得的植物基因组总dna用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，发现编号为cjx-01及cah-03的样品无明显dna条带，改用dneasyplantminikit试剂盒(qiagen，american)提取总dna。

步骤二：pcr扩增及测序

pcr正向引物ycf1-f：5＇-tctcgaaaatcagattgttgt-3＇，反向引物ycf1-r：5＇-atgtcaaagtgatggaaaa-3＇，由生工生物工程(上海)有限公司合成；pcr反应体系为：dna模板2μl，10×dreamtaqgreenbuffer5μl，dntpmix5μl，dmso(二亚甲基亚砜)2μl，bsa(牛血清蛋白)0.5μl，正向引物2μl，反向引物2μl，dreamtaqdnaploymrerase1.5μl，双蒸水加注至50μl；pcr扩增程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃扩增1分钟，共30个循环，最终72℃终扩增10分钟；扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，浓度合格的送生工生物公司(sangonbiotech，china)进行双向测序。

步骤三：序列校正与比对

将dna测序返回的序列峰图文件导入sequencher4.1.4软件中进行正反向序列自动拼接、编号、人工校正，完成后输出为文本格式导入bioedit软件中进行同片段个体间比对，根据序列峰图对比对结果进行进一步确认确保所有序列差异均为真实变异，比对完成后删除两端不可信区域。将获得的序列填加到黄连属植物ycf1基因标准数据库中，在bioedit软件中进行插入、缺失及变异位点的比对，比对完成后保存序列矩阵。

步骤四：构建nj树

将比对拼接完成的序列文件输入mega7软件中，基于k-2p模型，构建邻接树(neighbor-joiningtree，nj树)，并通过1000次自展检验(bootstrap)确定每一分支的支持率。

步骤五：鉴定结果判断

通过将10份“中药黄连”样品的ycf1序列填加到黄连属ycf1基因标准数据库中联合构建的nj树，结果清晰表明其中7份样品可以确定为中药黄连，其中csc02、csc04是三角叶黄连，cah01、cah02、cjx03是黄连，cjx01、cjx02是云南黄连，这三种黄连均为《中华人民共和国药典》(2010年,一部)中收录指定的中药黄连的来源药材，而同时检测出另外3份“中药黄连”实际上是混伪品，其中csc01是峨眉黄连，cah03是短萼黄连，而csc03是我国不产的日本黄连，为近年来四川等地药农从日本引进充当中药黄连来栽培销售的，通过本发明均可顺利鉴定出来。

尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>江西农业大学

<120>一种用于黄连分子鉴定的标准基因数据库及分子鉴定方法

<141>2017-11-27

<160>19

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>775

<212>dna

<213>coptisaspleniifolia

<400>1

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<213>黄连(coptisaspleniifolia)

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