一种基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法及系统与流程

本发明属于土壤微生物学技术领域，尤其涉及一种基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法及系统。

背景技术：

根际(rhizosphere)被定义为紧密围绕着有生命力根系的生物活性区域，其中包含大量微生物，例如细菌、放线菌和真菌等，也包括一些藻类和病毒等，范围一般为距离根表面1cm以内。不同植物甚至同一植物的不同生育期，其根系分泌物会对根际微生物的生长发育产生影响；而根际微生物又参与土壤有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化和循环等多种生理生化过程，尤其是其中的固氮菌群，通过生物固氮作用在常温下把氮气转化为能被植物利用于合成各种氨基酸的氨。土壤根际微生物群落不仅受到植物根系影响，也受土壤类型、农业耕作管理、季节变化、重金属污染、杀虫剂处理等影响，同时也受到检测技术的影响。因此，准确的获得根际土土样，进而准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，是判断和评价不同基因型植物对土壤微环境影响的重要基础，也是评估转基因作物释放对土壤微生态风险的重要基础。

传统的用于分析微生物的分离培养法主要有平板培养法和显微镜观察等方法，但存在很多弊端，即上述方法无法分析土壤中大量的且不可培养的微生物。biolog微平板分析法适用于检测可培养的且生长速度较快的微生物及其代谢多样性，但是实验结果并不能完全代表原位条件下微生物代谢多样性的结果，样品的处理方法、培养条件以及biolog微平板的类型等都会对结果造成一定程度的误差。醌指纹法的优点是简单快速，因此也被广泛地应用于微生物细胞结构多样性的分析中，但是醌指纹法不能具体反映到哪个属、种的多样性变化等。磷脂脂肪酸(plfa)分析法是基于plfa是活体细胞膜的一个重要组成部分，含量大约占细胞干重的5％；用plfa的变化来反映土壤生态系统中微生物的种类组成和数量变化，该方法不需要进行微生物培养，可直接鉴定微生物群落多样性变化，但该方法与plfa是否完全提取以及操作过程中plfa是否稳定有着很大的关系。

而运用pcr技术扩增细菌基因组中的16srdna或是真菌基因组中的18srdna、its区域可以对微生物进行分类鉴定，该技术已经普遍应用到探讨微生物的多样性、鉴定微生物的种类以及系统发育关系等领域。基于pcr的分析方法大致分为三阶段：第一，样品的核酸提取和纯化；第二，目的基因的pcr扩增；第三，扩增片段的变性处理与分析检测，包括聚丙烯酰胺变性梯度凝胶电泳(dgge)、单链构象多态性(sscp)、末端限制性片段长度多态性分析(t-rflp)、核糖体基因间隔区分析(risa)和自动核糖体间隔区基因分析(arisa)，或者第三，扩增片段的测序与分析，例如16srdna高通量测序技术等。其中，实时荧光定量pcr具有很多优点，如高精度、高灵敏度、高特异性、具有实时性等，但同时也存在一些不足之处，例如成本比较高，操作时还要考虑同源和异源dna背景、寡核苷酸杂交特异性、荧光染料或特异性探针的浓度以及pcr产物的大小等因素，这些因素都会引起结果的偏差。dgge是一种利用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳的方法将具有相同长度但不同序列组成的核酸片段分离开的技术，虽然已经普遍应用到土壤微生物群落多样性分析的分析领域中，但是该技术也存在一些不足之处，例如可重复性差，耗时耗力，而且只能检测土壤中巨量复杂微生物中的很小一部分等。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有技术检测通量低、规模小、对不可培养微生物的覆盖度低；不能准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，同时传统的利用抖落法获得的土壤根际土实际上包含了大量的非根际土，导致后续鉴定检测结果不准确。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法及系统。本发明是基于涡旋震荡分离根际土，进而基于16srdna深度测序检测不同玉米根际土壤原核微生物的方法，为转基因耐盐碱玉米及其受体品种对根际土壤原核微生物群落影响的准确评估提供了一种新方法。

本发明是这样实现的，一种基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法，所述基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法包括：

利用涡旋震荡准确分离玉米根际土，提取dna；

用双标签融合引物对做pcr扩增转基因耐盐碱玉米种植区土壤样品中提取的微生物宏基因组dna中的16srdnav4区，构建文库；

对合格文库进行深度测序，得到纯净reads；

拼接成tag，土壤样品产出至少5.0万条有效tag用于聚类成可操作分类单元otu。

进一步，所述引物对，其中一含p5illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物515f，515f的核苷酸序列是seqidno.1；

另一引物含p7illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物806r，806r的核苷酸序列是seqidno.2。

进一步，对合格的文库用illuminahiseqpe250进行深度测序，并对读取序列reads，剔除含有primer/adaptor的reads；剔除含有过多non-atcg碱基n的reads；剔除测序质量较低的碱基数占的比例过高的reads，获得纯净的成对reads。

进一步，把纯净的成对reads拼接成tag，然后聚类成可操作分类学单元otu后，再做物种组成、结构、多样性及相对丰度差异的显著性分析。根据得到的群落丰度数据，进行稀有频率数据的多重假设检验和假发现率(fdr)分析进行差异的显著性分析。

进一步，做物种组成、结构、多样性及相对丰度差异的显著性分析后，还进行：确定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，利用方差分析比较不同玉米取样时期之间的异同。

进一步，用双标签融合引物对做pcr扩增转基因耐盐碱玉米种植区土壤样品中提取的微生物宏基因组dna中，宏基因组dna用powersoildnaisolationkit提取，其中，土壤样品的均质化在涡旋混合器上以转速3000rpm运转15分钟。

进一步，所述的深度测序在illuminamiseq平台上，以pe250模式做16srdna的v4高变区片段高通量测序。

进一步，用双标签融合引物对做pcr扩增转基因耐盐碱玉米种植区土壤样品中提取的微生物宏基因组dna中的16srdnav4区，之前需进行：

将转基因耐盐碱玉米种植于大田试验地三个或三个以上小区，每个小区面积不小于20m²，每个小区有至少3个取样点，每个取样点取至少3棵转基因耐盐碱玉米植株；

先除去地面杂草和枯枝落叶，铲除大田土壤表面1cm-2cm的表土，然后将苗期、拔节期、抽丝散粉期、成熟期的玉米植株连根从土中取出，用抖落法去除根系抖落土，将细根放入装有25mlpbs液的50ml离心管中，利用涡旋震荡将根际土从根上分离，混合均匀，并于-80℃保存。

本发明的另一目的在于提供一种基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的系统。

本发明的优点及积极效果为：

本发明提供的根际土获取方式，能极大的提高根际土获取准确性，利用漩涡震荡能完全将根际土从根上分离下来(图2)；

本发明提供的大田种植方式下的玉米根际土壤中，每种土壤样品至少3个生物学重复；每种根际土壤样品至少3个生物学重复。所述的高质量宏基因组dna用powersoildnaisolationkit提取，其中，土壤样品的均质化在涡旋混合器上以最大转速3000rpm运转15分钟完成。深度测序是在illuminamiseq平台上，以pe250模式做16srdna的v4v5高变区片段高通量测序，每个系统土壤样品dna至少产出5.0万条有效tag以用于聚类成otu。

本发明的有益效果是：16srdna深度测序方法具有很多优点：首先是大规模、高通量，可以检测到土壤中的绝大部分不可培养的原核微生物种类，其次相比于宏基组高通量测序方法，费用较低(300～500元/样品dna)，因而可以更加全面(不同作物品种植前、苗期、花期、成熟期等多个时期；同一时期各品种多点样品)、直接、原位地分析不同作物对于土壤原核微生物群落组成、结构和遗传多样性的影响。准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，是判断和评价不同基因型植物对土壤微环境影响的重要基础，也是评估转基因作物释放对土壤微生态风险的重要基础，本发明提供的一种基于16srdnav4v5区深度测序基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法，为准确分离土壤根际土、

转基因耐盐碱玉米及其受体品种对根际土壤原核微生物群落影响的准确评估提供了一种新方法。该方法检测全面，操作简便，成本低,结果可靠。

本发明受国家转基因重大专项课题“转基因玉米小麦大豆环境安全评价技术(2016zx08011003)”支持。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的转基因玉根际土壤(so)高质量微生物宏基因组dna的检测结果。

图3是本发明实施例提供的转基因玉根际土壤中原核微生物的主成分分析(pca)结果。

图4是本发明实施例提供的转基因玉根际土壤中原核微生物基于beta多样性weighted-unifrac的主关联分析(pcoa)结果。

图5是本发明实施例提供的转基因玉根际土壤中超过99％的主要细菌类别，在门(phyla)分类水平上相对丰度的差异分析。其中*,p<0.05；**,p<0.01。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术检测通量低、规模小、对不可培养微生物的覆盖度低；不能准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异。

16srdna高通量测序技术，也称为16srdna深度测序技术，其原理是因为16srdna是原核微生物分类学分析中最常用的“分子钟”，其序列包含9个高可变区(hypervariableregion)和8个保守区(constantregion)，可变区序列因原核微生物物种不同而异，且变异程度与原核微生物的系统进化密切相关即提取样品中微生物的总dna，然后用16srrna基因(即16srdna)的通用引物进行pcr扩增，获得绝大部分微生物16srdna高可变区的扩增产物，构建扩增产物的文库，进行大规模、高通量测序，然后比较分析测序数据，对土壤微生物群落的多样性进行分析。

下面结合具体实施例对本发明作详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法，包括：

s101：大田试验地设计，转基因耐盐碱玉米种植于三个或三个以上小区，每个小区面积不小于20m²，每个小区有5个取样点，每个取样点取3棵植株。

s102：先除去地面杂草和枯枝落叶，铲除大田土壤表面1-2cm的表土，然后将苗期、拔节期、抽丝散粉期、成熟期的玉米植株连根从土中取出，用抖落法去除根系抖落土，将细根放入装有25mlpbs液的50ml离心管中，利用涡旋震荡将根际土从根上分离，混合均匀，并于-80℃保存。

s103：从上述各土壤样品中，采用mobio公司powersoil@dnaisolationkit提取高质量微生物宏基因组dna。

s104：用双标签融合引物对，其一含p5illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物515f，515f的核苷酸序列是5‘-gtgccagcmgccgcggtaa-3’，另一引物含p7illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物806r，806r的核苷酸序列是5‘-ggactachvgggtwtctaat-3’，做pcr扩增所述宏基因组dna中16srdna的v5区片段以构建文库。

s105：对合格的文库用illuminahiseqpe250进行深度测序，并对读取序列reads进行质量控制。

s106：把纯净的成对reads拼接成tag，然后聚类成“可操作分类学单元”，英语缩写为otu，再做物种组成、结构、多样性及相对丰度差异的显著性分析。

s107：确测定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，比较不同玉米取样时期之间的异同。

所述的系统对照为大田种植方式下的玉米根际土壤，每种土壤样品至少3个生物学重复；每种根际土壤样品至少3个生物学重复。

所述的高质量宏基因组dna用powersoildnaisolationkit提取，其中，土壤样品的均质化在涡旋混合器上以最大转速3000rpm运转15分钟完成。

所述的深度测序是在illuminamiseq平台上，以pe250模式做16srdna的v5高变区片段高通量测序，每个系统土壤样品dna至少产出5.0万条有效tag以用于聚类成otu。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

1、玉米材料：郑58；bz-136含badh耐盐碱基因玉米。

2、田间试验设计：

大田试验地点在哈尔滨市，每一种玉米种植于三个或三个以上小区，每个小区面积不小于20m²(4m×5m)。每个小区有两个取样点，每个取样点取两棵或两棵以上植株。

3、样品采集：

先除去地面杂草和枯枝落叶，铲除大田土壤表面1-2cm的表土，然后将苗期、拔节期、抽丝散粉期、成熟期的玉米植株连根从土中取出，用抖落法去除根系抖落土，将细根放入装有25mlpbs液的50ml离心管中，利用涡旋震荡将根际土从根上分离，混合均匀，并于-80℃保存；

4、土壤样品中微生物宏基因组dna的提取：

从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的pcr抑制因子的powersoildnaisolationkit(mobiolaboratoriesinc.,carlsbad,ca,usa)提取高质量微生物宏基因组dna(图2)。

5、宏基因组dna中16srdna的v4高变区文库的构建

用双标签融合引物对，其一含p5illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物515f(seqidno.1：5‘-gtgccagcmgccgcggtaa-3’)，另一引物含p7illumina接头序列、8核苷酸的标签以及806r(seqidno.2：5‘-ggactachvgggtwtctaat-3’)，做pcr扩增所述宏基因组dna中16srdna的v4高变区片段以构建文库。

6、合格文库的高通量测序

对合格的文库用illuminahiseqpe250进行深度测序，并对读取序列reads进行质量控制。

7、生物信息学内容分析

把纯净的成对reads拼接成tag，然后聚类成“可操作分类学单元”(otu)；然后做alpha多样性、结构、组成及在不同分类水平上相对丰度差异的显著性分析等。

8、数据整合与比较分析

以根际土壤(so)原核微生物群落的alpha多样性、结构(主成分分析，图3；beta多样性，图4)、组成及在门分类水平上的相对丰度差异的显著性分析(图5)、在纲分类水平上的相对丰度差异的显著性分析作为系统对照，克服土壤异质性的影响，准确测定根际土壤原核微生物群落的alpha多样性、结构(主成分分析，图3；beta多样性，图4)、组成及在门分类水平上的相对丰度差异的显著性分析(图5)、在纲分类水平上的相对丰度差异的显著性分析以及在转基因玉米根际土壤中主要的物种显著性差异统计，比较转基因耐盐碱玉米根际土壤原核微生物群落之间的异同。

本发明实施例提供的转基因玉米根际土壤中超过95％的主要细菌类别，在纲(classes)分类水平上相对丰度的差异分析中。p<0.05。

本发明实施例提供的转基因玉米根际土壤中主要的物种显著性差异统计中。其中p<0.05。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>东北农业大学

<120>一种基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法及系统

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

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