检测GNAS基因位点突变的引物和方法与流程

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测gnas基因位点突变的引物，采用普通pcr技术，可用于快速检测gnas位点的突变情况。

背景技术：

gnas基因位于20号染色体，由13个外显子和12个内含子组成，编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(g蛋白)的α亚基(gsα)。gsα与β和γ亚基形成异源三聚体g蛋白复合物，介导从大量激素和生长因子激活的跨膜受体到多种细胞内信号通路的信号转导。配体结合的g蛋白偶联受体通过促进gs在gsα上的gdp交换而激活gs蛋白，从而导致与受体和βγ-复合物的解离。游离的gsα亚基与腺苷酸环化酶相互作用以刺激camp的合成，直到gtp的水解将其转化为不活跃的gdp结合形式，其与βγ-复合物重新结合进入新的循环。基因突变对氨基酸编码造成的影响可能会破坏内在的水解活性，导致camp大量合成。在肾上腺增生和卵巢囊肿以及甲状腺癌(5％)，肾上腺皮质，垂体(22-40％)，肾脏(17％)和leydig细胞肿瘤(67％)中均确定了gnas的激活突变。这些器官具有内分泌或外分泌功能，表明突变的gnas应与分泌功能相关。总的来说，gnas的激活突变可以修饰细胞生长并且可能是致癌的，然而，gnas作为致癌基因的作用仍然不清楚，因此gnas基因突变检测对于肿瘤的诊断、辨别和预防就显得至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测gnas基因位点突变的引物，采用pcr技术，可用于快速检测gnas基因位点的突变情况。所述检测gnas基因位点突变情况的引物，包括：扩增gnas基因5号外显子的引物，其碱基序列为：

gnas-exon-5-f：tgtaaaacgacggccagtgcagtgagaaggcaaccaa

gnas-exon-5-r：aacagctatgaccatgggctgtcactcatgttcctat。

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

所述引物用于扩增的第5号外显子包括12384gcc>gct和12450atc>att突变热点。

本发明提供了检测gnas基因位点突变情况的方法，包括以下步骤：

(1)抽提血液中的基因组dna；

(2)用pcr扩增步骤1中提取的dna；

(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；

(4)对测序结果进行判断，确定gnas位点是否发生突变。

所述方法用于检测第5号外显子是否发生12384gcc>gct和12450atc>att突变。

本发明还提供了一种检测gnas基因位点突变的试剂盒，包括

(i)血液dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr扩增反应液；

(iii)测序体系试剂；

近年相关文献也报道了患者所产生有关突变，而本次研究在gnas基因5号外显子发现了新的突变点，分别为12384gcc>gct和12450atc>att。但该突变位点并未造成gnas的激活突变，这在其他文献中并未报道。针对5号外显子新发现的突变点，本发明设计了扩增gnas基因热点区域的5号外显子的引物。采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测gnas基因突变热点的方法，可以一次将gnas基因突变类型检测出来，相比较荧光定量pcr法降低了检测的成本和难度。荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计3个探针，而且不能在同一管里检测，成本高，检测难度大。

附图说明

图1为gnas基因在染色体上的定位图。

图2为gnas基因1对引物的1～15号样本的电泳截图。

图3为gnas基因5号外显子12384位碱基的阴性样本的测序截图。

图4为gnas基因5号外显子12384位碱基的阳性样本的测序截图。

图5为gnas基因5号外显子12450位碱基的阴性样本的测序截图。

图6为gnas基因5号外显子12450位碱基的阳性样本的测序截图。

具体实施方式

实施例1

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

一种检测gnas基因位点突变的引物，该引物的设计是针对5号外显子12384gcc>gct和12450atc>att位点突变热点，包括：

扩增gnas基因突变热点区域的引物，其碱基序列为：

gnas-exon-5-f：tgtaaaacgacggccagtgcagtgagaaggcaaccaa

gnas-exon-5-r：aacagctatgaccatgggctgtcactcatgttcctat

一种检测gnas基因位点突变的试剂盒，包括

(i)血液dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr反应液；

(iii)测序体系试剂；

(iv)阳性对照品和阴性对照品。

其中，血液dna抽提试剂可购自天根dna抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系pcr扩增反应液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；gnas基因外显子上、下游引物(10μm)。

测序体系试剂包括：测序纯化液(exoi:0.6u，cip:1.2u)、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：m13f和m13r(3.2μm)。

实施例2

血液基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的基因组dna

1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀。

2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。

3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。

6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。

9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份18μl分装：

x＝19μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系pcr反应液中1μldna；阳性对照和阴性对照直接加1μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：

pcr扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

gnas-exon-5-f：tgtaaaacgacggccagtgcagtgagaaggcaaccaa

gnas-exon-5-r：aacagctatgaccatgggctgtcactcatgttcctat(5)sanger测序：

取9μlpcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlcbl后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(abi3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与gnas(genbankaccn：nc_000020.11)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取15例临床样品，按实施例1和2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。样本加入检测体系pcr反应液中1μl。电泳结果如图2所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样本的检测结果如图3和图4所示。图3和图4为gnas基因5号外显子12384位碱基的阴性和阳性样本的测序截图。图5和图6为gnas基因5号外显子12450位碱基的阴性和阳性样本的测序截图。

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把热点区域序列包括在内了，且能够扩增出gnas基因5号外显子，并且测序结果完全准确。其中5号外显子上有阳性突变，分别为12384gcc>gct和12450atc>att，对应氨基酸为a108和i131。而这两个点突变在已知文献中并未报道，经过对多个样本测序的结果显示，此突变为gnas基因现发现的新的点突变，因为点突变的结果为同义突变，所以对氨基酸的编码并未产生影响，但便于判断和分析产生的基因突变是否会造成相关疾病以及辅助筛查造成疾病的病因。

序列表

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<120>检测gnas基因位点突变的引物和方法

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<213>人工序列(artificialsequence)

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