编程式的核酸恒温扩增方法及其试剂盒应用与流程

本发明涉及生物技术领域中核酸分子生物学检测方法，具体的涉及编程式的核酸恒温扩增方法及其试剂盒应用。

背景技术：

根据世界卫生组织对全球的流行病趋势调查研究表明，以往常规的病原菌检测方法(例如细菌培养、外部形态结构和生理生化鉴定以及血清学鉴定等)由于其耗时费力、步骤繁琐和对仪器设备的依赖等不足，已经无法有效的满足人类对致病微生物进行快速和特异检测的要求。分子生物学技术的快速发展，使得人们可以从分子水平来对目前常规检测手段难以检测的病原微生物进行快速/正确地鉴定，极大的提高病原菌的检测水平，并对传染病传播的起到了良好的控制效果。目前，高度敏感、高度特异的核酸扩增技术可以直接在不需要对病原微生物进行分离培养的基础上直接用于临床标本的检测，并能在较短时间内(2-3小时)得出结果，在感染性疾病的诊断中应用越来越广泛。这些分子检测技术与其他分子生物学技术以及生物信息学手段结合，正向快速朝着准确、快速、灵敏以及自动化的方向发展。

目前的核酸检测技术根据扩增过程中对温度的要求可以分为两类：

1.在扩增中依赖于温度循环往复变化的扩增技术，如聚合酶链反应(pcr)和连接酶链式反应(1igasechainreaction，lcr)。pcr/lcr反应的每一循环都包括模板变性，引物复性和引物的延伸/连接反应。每次循环新合成的dna片段又可成为下次循环的模板，这就可以使靶序列dna数量能指数扩增的方式增加。其中pcr技术是目前最成熟的核酸扩增技术，并已经得到了极为广泛的应用和发展。但是，普通的pcr技术需要专门的仪器，而且还存在容易交叉污染和操作过程繁琐的缺点。而荧光实时pcr(real-timepcr)虽然能比较好的解决了交叉污染的问题，并简化了相应的操作步骤，但是其却需要复杂昂贵的定量扩增仪器。这些缺点限制了其在现场检测事件和基层社区医院的推广和应用。

2.核酸恒温扩增系统是指核酸扩增过程中只在一个恒定温度的条件下进行，并不需要通过循环往复的对反应液体进行升温降温过程。目前比较常见的技术如链置换扩增技术(stranddisplacementamplification，sda)，核酸序列扩增技术(nucleicacidsequencebasedamplification,nasba)，转录酶扩增技术(transcriptionmediatedamplification,tma)，滚环扩增技术(rollingcircleamplification,rca)，连环恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)，解链酶扩增技术(helicasedependentamplification,hda)，和交叉引物扩增技术(crossprimingamplification,cpa)等。这些技术除了高特异性和高灵敏度外，相对pcr技术而言，操作简单，对仪器设备的要求低往往一台水浴锅甚至简易的保温杯即能有效实现扩增反应；同时检测结果的判读也比较简单，如lamp的反应结果可以通过肉眼观察白色浑浊或者绿色荧光的生产进行有效的判断，简便快捷，因此适合现场检测以及在基层医疗单位的推广使用。

核酸恒温扩增技术根据所参与的酶参与的数量的多少又可以大致的分为单酶体系(如lamp和cpa)以及多酶体系(如rca，tma，had等)。lamp是目前应用最广泛的单酶恒温扩增体系，其扩增体系中主要包括bst大片段dna聚合酶和两对特殊的内引物(fip由f1c和f2组成；bip由bic和b2组成)、一对外引物(f3和b3)组成。fip引物的f2序列与靶dna上互补序列配对，启动循环链置换反应。f3引物与模板上的f3c区域互补，引起合成与模板dna互补的双链，从而挤掉fip引起的dna单链。与此同时，bip引物与被挤掉的这条单链杂交结合，形成的环状结构被打开，接着b3引物在bip外侧进行碱基配对，在聚合酶的作用下形成新的互补链。被置换的单链dna两端均存在互补序列，从而发生自我碱基配对，形成类似哑铃状的dna结构。lamp反应以此dna结构为起始结构，进行再循环和延伸，靶dna序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎一环结构的dna。

本发明涉及一种新型的核酸恒温扩增方法，其特点是针对靶基因的不同区域设计不同的引物，然后在具有链置换功能的dna聚合酶的作用下完成核酸扩增过程。其扩增产物可以通过在反应中加入特异性的荧光染料直接进行可视化检测或者在相关的仪器上进行实时检测。

技术实现要素：

本发明针对生物技术领域中核酸分子生物学检测所面临的耗时费力、步骤繁琐和对仪器设备的依赖等不足，目的在于为人们提供一种操作简单，价格低廉的核酸恒温检测方法，从而使得先进的分子检测手段能有效在现场检测事件和基层社区医院中得到广泛的推广和应用

编程式核酸恒温扩增技术是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计6种特异引物，利用一种链置换dna聚合酶在恒温条件(62℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳等过程。

编程式核酸恒温扩增技术所涉及的引物设计包括以下要求(附图1)，

a)内扩增引物的设计：设计一对内扩增引物，内扩增引物是指参与编程式的核酸恒温扩增反应的主要的单链寡核苷酸序列之一；

内扩增引物的设计方案一：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为一个通用的人工序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为一个通用的人工序列；

或内扩增引物的设计方案二：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端为正向内扩增引物的3’末端序列；

或内扩增引物的设计方案三：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端为正向外扩增引物的3’末端序列。

b)外扩增引物的设计：设计一对外扩增引物，外扩增引物是指参与编程式的核酸恒温扩增反应的主要的单链寡核苷酸序列之一；

外扩增引物的设计方案一：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向内扩增引物的3’末端序列完全一致；

或外扩增引物的设计方案二：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向内扩增引物的3’末端序列完全一致；

或外扩增引物的设计方案三：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向外扩增引物的3’末端序列完全一致。

c)剥离引物的设计，分别包括正向剥离引物，反向剥离引物和通用剥离引物；正向剥离引物和反向剥离引物分别与靶基因的反义链和正义链完全互补；通用剥离引物与通用人工序列一致。

同时，编程式核酸恒温扩增技术的扩增过程包括以下扩增步骤(附图2)：

1.正向内扩增引物和正向外扩增引物分别与靶核酸分子的反义链杂交；然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；

2.正向剥离引物与靶核酸分子反义链杂交；然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；从而剥离出两条分别由正向内扩增引物和正向外扩增引物延伸所产生的单链产物；

3.所剥离的两条分别由正向内扩增引物和正向外扩增引物延伸所产生的单链产物可作为反向内扩增引物和反向外扩增引物杂交/延伸的模板；

4.反向剥离引物可分别与两条由正向内扩增引物和正向外扩增引物延伸所产生的单链产物进行杂交，然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；该延伸过程将产生四条末端包含不同内扩增引物和外扩增引物序列的单链dna序列；

5.所产生的四条末端分别包含不同内扩增引物和外扩增引物序列的单链dna序列由于序列中存在互补序列，因此可以在分子热力学的作用下，进而形成4个不同组成的二级结构；

6.所形成的不同组成的二级结构可以作为扩增的模板，通过与通用引物，内扩增引物和外扩增引物进行反复的杂交和延伸；所形成的产物可以形成更多的能形成二级结构的单链或者双链产物；所形成的这些产物又可作为扩增的模板参与下一阶段的扩增，从而能达到快速扩增靶序列的目的。

一方面，本发明还提供了一种靶核酸序列的快速检测的方法和试剂盒，其中包括以下步骤：

(1)引物设计：

1.1内扩增引物的设计：设计一对内扩增引物，内扩增引物是指参与编程式的核酸恒温扩增反应的主要的单链寡核苷酸序列之一；

内扩增引物的设计方案一：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为一个通用的人工序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为一个通用的人工序列；

内扩增引物的设计方案二：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端为正向内扩增引物的3’末端序列；

内扩增引物的设计方案三：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端为正向外扩增引物的3’末端序列。

1.2外扩增引物的设计：设计一对外扩增引物，外扩增引物是指参与编程式的核酸恒温扩增反应的主要的单链寡核苷酸序列之一；

外扩增引物的设计方案一：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向内扩增引物的3’末端序列完全一致；

外扩增引物的设计方案二：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向内扩增引物的3’末端序列完全一致；

外扩增引物的设计方案三：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向外扩增引物的3’末端序列完全一致。

1.3剥离引物的设计，分别包括正向剥离引物，反向剥离引物和通用剥离引物；正向剥离引物和反向剥离引物分别与靶基因的反义链和正义链完全互补；通用剥离引物与通用人工序列一致；

(2)扩增步骤：将所设计的引物、具有链置换功能的dna聚合酶、靶向核酸序列和反应的缓冲体系混匀在一起；并将混匀后的液体放置在55-65℃之间30-60分钟；即可对靶核酸序列进行快速的扩增。其扩增过程包含以下特征：

2.1正向内扩增引物和正向外扩增引物分别与靶核酸分子的反义链杂交；然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；

2.2正向剥离引物与靶核酸分子反义链杂交；然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；从而剥离出两条分别由正向内扩增引物和正向外扩增引物延伸所产生的单链产物；

2.3.所剥离的两条分别由正向内扩增引物和正向外扩增引物延伸所产生的单链产物可作为反向内扩增引物和反向外扩增引物杂交/延伸的模板；

2.4.反向剥离引物可分别与两条由正向内扩增引物和正向外扩增引物延伸所产生的单链产物进行杂交，然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；该延伸过程将产生四条末端包含不同内扩增引物和外扩增引物序列的单链dna序列；

2.5.所产生的四条末端分别包含不同内扩增引物和外扩增引物序列的单链dna序列由于序列中存在互补序列，因此可以在分子热力学的作用下，进而形成4个分别由不同序列组成的但是可以进行空间折叠的二级结构；这些二级结构可以通过快速的自身折叠形成发夹式结构；

2.6.所形成的由不同序列组成的可进行空间折叠的二级结构可以作为扩增的模板，通过与通用引物，内扩增引物和外扩增引物进行反复的杂交和延伸；所形成的产物可以形成更多的能形成可进行空间折叠的二级结构的单链或者双链产物；所形成的这些产物又可作为扩增的模板参与下一阶段的扩增，从而能达到快速扩增靶序列的目的。

(3)扩增产物检测：通过在反应中加入染料，随着反应的进行，反应中的靶向基因浓度不断升高，导致相应的染料信号逐渐发生变化；或者随着反应的进行，反应中的靶向基因的浓度不断升高，导致相应的染料的颜色发生变化。

另一方面，本发明还提供了快速靶核酸序列检测的试剂盒；以及所述试剂盒在细菌和病毒等病原微生物的核酸检测中和其在人类遗传性相关的基因诊断中的用途。

附图说明：

下面结合附图对具体实施方式作进一步的说明，其中：

图1说明了所涉及的内扩增引物，外扩增引物和剥离引物的位置。

图2说明了编程式核酸恒温扩增技术的扩增原理。

图3说明了主要由内扩增引物参与的恒温扩增技术的原理。

图4说明了主要由内扩增引物和一条正向外扩增引物参与的恒温扩增技术的原理。

图5说明了改变内扩增引物和外扩增引物组成的设计。

图6说明了分别用abi7500荧光pcr仪，凝胶成像系系统和手持式紫光源对阳性对照和结核分枝杆菌全基因组dna进行检测的结果。(a).用凝胶成像系系统分别对阳性对照和结核分枝杆菌全基因组dna进行检测的结果。l为100bp的ladder；1为浓度为10³ifu的全基因组dna；3为10³拷贝/微升的阳性对照浓度；2和4分别为阴性对照。结果显示两者在条带上并不存在明显的区别。(b).用手持式紫光源分别对阳性对照和结核分枝杆菌全基因组dna进行检测的结果。1为浓度为10³ifu的全基因组dna；3为10³拷贝/微升的阳性对照浓度；2和4分别为阴性对照。(c).用abi7500荧光pcr仪对不同浓度的阳性对照进行检测的结果。1-3号曲线的阳性对照浓度分别为：10³拷贝/微升、10²拷贝/微升和10¹拷贝/微升；4号曲线为阴性对照。随着反应时间的延长，反应溶液中的荧光信号也不断的增强，但是达到饱和后就出现了一个平台期。

具体实施方式

本发明提供了一种编程式核酸恒温扩增方法，其特征包括以下步骤：

(1)引物设计：

1.1内扩增引物的设计：设计一对内扩增引物，内扩增引物是指参与编程式的核酸恒温扩增反应的主要的单链寡核苷酸序列之一；

内扩增引物的设计方案一：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为一个通用的人工序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为一个通用的人工序列；

内扩增引物的设计方案二：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端为正向内扩增引物的3’末端序列；

内扩增引物的设计方案三：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端为正向外扩增引物的3’末端序列。

1.2外扩增引物的设计：设计一对外扩增引物，外扩增引物是指参与编程式的核酸恒温扩增反应的主要的单链寡核苷酸序列之一；

外扩增引物的设计方案一：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向内扩增引物的3’末端序列完全一致；

外扩增引物的设计方案二：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向内扩增引物的3’末端序列完全一致；

外扩增引物的设计方案三：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向外扩增引物的3’末端序列完全一致。

1.3剥离引物的设计，分别包括正向剥离引物，反向剥离引物和通用剥离引物；正向剥离引物和反向剥离引物分别与靶基因的反义链和正义链完全互补；通用剥离引物与通用人工序列一致；

(2)扩增步骤：将所设计的引物、具有链置换功能的dna聚合酶、靶向核酸序列和反应的缓冲体系混匀在一起；并将混匀后的液体放置在55-65℃之间30-60分钟；即可对靶核酸序列进行快速的扩增。编程式核酸恒温扩增方法扩增过程包含以下特征：

2.1正向内扩增引物和正向外扩增引物分别与靶核酸分子的反义链杂交；然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；

2.2正向剥离引物与靶核酸分子反义链杂交；然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；从而剥离出两条分别由正向内扩增引物和正向外扩增引物延伸所产生的单链产物；

2.3.所剥离的两条分别由正向内扩增引物和正向外扩增引物延伸所产生的单链产物可作为反向内扩增引物和反向外扩增引物杂交/延伸的模板；

2.4.反向剥离引物可分别与两条由正向内扩增引物和正向外扩增引物延伸所产生的单链产物进行杂交，然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；该延伸过程将产生四条末端包含不同内扩增引物和外扩增引物序列的单链dna序列；

2.5.所产生的四条末端分别包含不同内扩增引物和外扩增引物序列的单链dna序列由于序列中存在互补序列，因此可以在分子热力学的作用下，进而形成4个分别由不同序列组成的但是可以进行空间折叠的二级结构；这些二级结构可以通过快速的自身折叠形成发夹式结构；

2.6.所形成的不同组成的二级结构可以作为扩增的模板，通过与通用引物，内扩增引物和外扩增引物进行反复的杂交和延伸；所形成的产物可以形成更多的能形成二级结构的单链或者双链产物；所形成的这些产物又可作为扩增的模板参与下一阶段的扩增，从而能达到快速扩增靶序列的目的。

(3)扩增产物检测：通过在反应中加入染料，随着反应的进行，反应中的靶向基因浓度不断升高，导致相应的染料信号逐渐发生变化；或者随着反应的进行，反应中的靶向基因的浓度不断升高，导致相应的染料的颜色发生变化。

在另一项备选的实施方案中，本发明可以仅选择内扩增引物然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；该延伸过程将形成1个不同组成的二级结构；而这个二级结构可以做为模板参与后续的反应，从而达到扩增靶序列的目的(图3)。

在另一项备选的实施方案中，本发明可以仅选择一条外扩增引物(正向外扩增引物或反向外扩增引物)和两条内扩增引物然后在具备链置换功能的dna聚合酶作用下进行延伸；该延伸过程将形成3个不同组成的二级结构；而这些二级结构可以做为模板参与后续的反应，从而达到扩增靶序列的目的(图4)。

在另一项备选的实施方案中，本发明可以改变内扩增引物和外扩增的组成。如正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’的杂交末端序列与反向外扩增引物的3’端一致；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’的杂交末端序列与正向内扩增引物的扩增延伸序列一致；正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向外扩增引物的3’末端序列完全一致(图5)；

在另一项备选实施方案中，本发明提供了基于扩增产物自发形成二级结构从而达到扩增靶核酸序列的目的和方法。其特征为扩增过程中能自发形成二级结构的单链或者双链产物；而这些单链或者双链产物能在分子热力学的作用下发生自身的折叠，进而形成二级结构，并暴露出引物的杂交结合位点；这使得引物与二级结构的结合变得简便快速；引物一旦与二级结构结合后可以在具有链置换功能的dna聚合酶的作用下形成新的扩增产物；而这些扩增产物可以在分子热力学的作用下发生自身的折叠，进而形成新二级结构参与后续的扩增过程；如此循环往复的扩增，即可达到快速扩增靶向核酸序列的目的。

因此编程式的核酸恒温扩增技术的绝大部分产物为能形成二级结构的单链或者双链产物；由于人工的引入了一些引物结合位点，这样也使得其产物组成变的相当的复杂，具体表现为在凝胶电泳图上，可见许多长短不一的条带(附图6a)。

根据本发明的备选实施方案，编程式的核酸恒温扩增技术中所述的dna聚合酶选自市场上已经销售的bstdna聚合酶、klenowdna聚合酶、ventdna聚合酶、phi29dna聚合酶或gstdna聚合酶。

根据本发明的备选实施方案，编程式的核酸恒温扩增技术中所述的dna聚合酶选自市场上已经销售的bstdna聚合酶、klenowdna聚合酶或gstdna聚合酶。

根据本发明的备选实施方案，编程式的核酸恒温扩增技术中所述的dna聚合酶选自市场上已经销售的bstdna聚合酶或gstdna聚合酶。

根据本发明的备选实施方案，编程式的核酸恒温扩增技术中所述的荧光染料选自市场上已经销售的evagreen、sybrgreen1、钙黄绿素和羟基萘酚蓝。

根据本发明的备选实施方案，编程式的核酸恒温扩增技术中所述的荧光染料选自市场上已经销售的evagreen和钙黄绿素。

根据本发明的备选实施方案，编程式的核酸恒温扩增技术中所述的荧光染料选自市场上已经销售的evagreen。

本发明突出的效果是利用一种具有链置换功能的dna聚合酶在恒温条件(63℃)下放置30-60分钟，即可完成对靶核酸序列的扩增。因此整个扩增只需一个简单的恒温装置即可完成所有的扩增过程，这极大降低了其对仪器的要求，甚至简易的保温杯即能有效实现扩增反应。同时，如果在反应中加入相应的荧光染料，即可通过荧光计数仪得到相应的扩增曲线或者通过肉眼直接判断扩增反应结果。这些优点使得针对靶核酸序列扩增检测的整个变得快速简便，而且对其结果的检测也不需要涉及打开反应管和繁琐的电泳检测过程。本发明以其特异性、操作简单和对对仪器设备的要求低等特点可以获得很广泛的应用前景，而且特别适合现场检测以及在基层医疗单位的推广使用，如：

1.与直接相关的人类遗传性疾病的分子诊断；

2.病原体微生物的检测；

3.对肿瘤癌症的诊断及预后的评估；

4.某些微生物的分型。

在另一项实施方案中，本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒在检测病原微生物、环境微生物或微生物分型中的用途。

在另一项实施方案中，本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒在检测人类、动物或植物传染病病原体中的用途。

在另一项实施方案中，本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒在检测食品或生物武器中传染病病原体的用途。

在另一项实施方案中，本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒在检测人类遗传病或者健康风险基因及其评估中的用途。

在本发明的说明书中，所使用的技术术语具有如下含义：

所涉及的引物为人工合成的单链寡核苷酸序列。

剥离引物是指位于扩增引物后方的短链单链寡核苷酸序列，其作用是在具有链置换功能的dna聚合酶的作用下，将扩增引物所延伸的产物从模板上剥离下来。

外扩增引物是指参与编程式的核酸恒温扩增反应的主要的单链寡核苷酸序列之一。外扩增引物的设计方案一：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向内扩增引物的3’末端序列完全一致；

外扩增引物的设计方案二：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向内扩增引物的3’末端序列完全一致；

外扩增引物的设计方案三：正向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与反向内扩增引物的3’末端序列完全一致；反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交序列与正向外扩增引物的3’末端序列完全一致。

内扩增引物是指参与编程式的核酸恒温扩增反应的主要的单链寡核苷酸序列之一。内扩增引物的设计方案一：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为一个通用的人工序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为一个通用的人工序列；

内扩增引物的设计方案二：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端为正向内扩增引物的3’末端序列；

内扩增引物的设计方案三：正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为反向外扩增引物的3’末端的扩增延伸序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端为正向外扩增引物的3’末端序列。

实施例1.结核分枝杆菌检测试剂盒

结核病(m.tuberculosis,tb)是严重危害人类健康的传染病，是阻碍国家经济和社会发展的重大问题，是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。近年来，全球结核病疫情的回升，引起了国际社会的高度重视，世界卫生组织已将结核病作为重点控制的传染病之一，并呼吁对以低收入和中等收入国家为目标的新的诊断工具进行工业投资。

目前应用于结核菌诊断的技术有很多种，这些常规检查方法在技术上虽然比较成熟，但目前尚存在一些问题：国际推荐的涂片和培养方法还分别存在特异性差、敏感性低和结果报出时间太长的不足，国际认可的结核菌快速培养系统虽大大提高了培养结果的报出时间，但由于仪器设备昂贵，检测成本太高而较难推广普及。pcr技术虽然具备快速、灵敏、特异等特点，但由于实验室扩增物污染极易造成假阳性结果而限制了其在临床上的广泛应用。进口诊断试剂则由于采购供货周期长，价格昂贵，基层单位难于常规应用。因此，开发简便、快速、准确、经济，尤其适宜于基层单位推广使用的结核分枝杆菌快速诊断试剂成了各国企业研究的重点。

近年来的发展起来针对结核分枝杆菌的荧光定量pcr(fluorescencequantitativepcr,fq-pcr)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点在结核分枝杆菌的基因检测水平上有着广泛的应用，是目前结核分枝杆菌检测的主要方法。fq-pcr虽然有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器。

本试剂盒可以不需pcr经过的变性、复性、延伸三个阶段，可在恒温条件下1小时内将目的序列扩增109倍以上，具有不需特殊设备，检测时间更短、敏感性更高的优点。试剂盒的组成包括：

1.dna提取试剂；

2.靶核酸序列扩增检测反应液：三条剥离引物，两条外扩增引物和两条内扩增引物，10×thermolbuffer，mgso4(6微摩)，dntps溶液(0.4微摩)，bstdna聚合酶(10个单位)和无菌双蒸水组成。

其中引物的具体序列组成为：

正向内扩增引物：

5-gctatacaatccctggg-aggcgaaccctgcccag

反向内扩增引物：

5-gctatacaatccctggg-tagcagacctcacctatg

正向外扩增引物：

5-aggcgaaccctgcccagaccaccagcacctaaccg

反向外扩增引物：

5-tagcagacctcacctatgtgtcgtcggtgacaaaggccacgt

通用剥离引物：5-gctatacaatccctggg

正向剥离引物：5-acagcccgtcccgccgat

反向剥离引物：5-tggccatcgtggaagcga

反应体系成分的浓度分别为：

10×thermolbuffer的组成：20mmtris-hcl(ph8.8),10mmkcl,10mm(nh4)2so4,2mmmgso4,0.1％tritonx-100。

所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。

阳性对照：含有结核分枝杆菌is6110基因[[ncbigenebanknumber:fj653663.1(39-83)]的dna片段。

将包含这个反应组分的反应液放置在abi7500荧光pcr仪器上60分钟，反应温度为63℃，然后设置每一分钟对反应所产生的荧光信号进行记录，即可得到相应的扩增曲线(图6c)。

实施例2.结核分枝杆菌扩增产物检测

在实施例1的反应体系中，用钙黄绿素取代evagreen并维持其他反应条件不变，然后分别用手持式紫光源和凝胶电泳系统对恒温扩增产物进行检测。检测的结果显示与图6b中。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。