本发明属于微生物领域，涉及一种结直肠癌微生物标志物及其应用。
背景技术：
：结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内新增病例数约为100万/年，死亡人数约为50万。随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，结直肠癌已成为我国发病率增长最快的恶性肿瘤之一，每年约有14万新患病例，占全部癌症患者的6.8％，在恶性肿瘤中居第4位。据预测，结直肠癌将成为我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率将在今后很长一段时期内继续上升。尽管手术、化疗、放疗等综合治疗手段已用于结直肠癌的治疗，但是仍有25％左右的结直肠癌出现复发和转移现象。因此，结直肠癌的早期诊断是降低结直肠癌发病率和死亡率的有效手段。结直肠癌的诊断方法主要包括x射线检查、肠镜检查和癌胚抗原(cea)检查。其中，癌胚抗原(cea)对早期病例的诊断价值不大，肠镜检查虽然准确度高，但是创伤性较大，许多高危人群拒绝接收定期的肠镜筛查。有研究表明，mir-92具有作为结直肠癌标志物的潜能，但是根据血液中mir-92的含量进行结直肠癌的诊断，错误率高达30％。随着人类基因组测序计划的完成以及高通量测序技术的发展，基因筛查技术已成为一种新的结直肠癌的诊断方法，在结直肠癌的早期诊断中具有显著的优势，但是由于结直肠癌在疾病早期没有明显症状，潜在患者仍然需要通过肠镜检查进一步确诊。因此，提供一种结直肠癌标志物，辅助进行结直肠癌的早期诊断，具有重要意义。技术实现要素：为了解决现有技术的不足，本发明提供一种结直肠癌微生物标志物及其应用，所述结直肠癌微生物标志物能够较为准确地确定个体是否患有结直肠癌，具有非侵入性辅助诊断结直肠癌的作用。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种结直肠癌微生物标志物，所述标志物包括微生物，所述微生物包括牛链球菌(treptococcusbovis)、腐败梭菌(clostridiumsepticum)、微单胞菌属(parvimonasmicra)或幽门螺杆菌(helicobacterpylori)中的任意一种或至少两种的组合。本发明中，通过对结直肠癌个体和健康个体的粪便样本中微生物的丰度进行差异分析和比较，确定了牛链球菌(treptococcusbovis)、腐败梭菌(clostridiumsepticum)、微单胞菌属(parvimonasmicra)和幽门螺杆菌(helicobacterpylori)具有作为结直肠癌标志物的潜能，所述标志物在结直肠癌患者的粪便样本中的含量显著高于在健康个体的粪便样本中的含量，且具有统计学意义，能够较为准确地确定个体是否患有结直肠癌，具有非侵入性辅助诊断结直肠癌的作用。优选地，所述标志物包括微生物，所述微生物包括牛链球菌(treptococcusbovis)、腐败梭菌(clostridiumsepticum)、微单胞菌属(parvimonasmicra)或幽门螺杆菌(helicobacterpylori)中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是牛链球菌(treptococcusbovis)、腐败梭菌(clostridiumsepticum)、微单胞菌属(parvimonasmicra)和幽门螺杆菌(helicobacterpylori)的组合、牛链球菌(treptococcusbovis)、腐败梭菌(clostridiumsepticum)和微单胞菌属(parvimonasmicra)的组合、牛链球菌(treptococcusbovis)、腐败梭菌(clostridiumsepticum)和幽门螺杆菌(helicobacterpylori)的组合、腐败梭菌(clostridiumsepticum)、微单胞菌属(parvimonasmicra)和幽门螺杆菌(helicobacterpylori)的组合、牛链球菌(treptococcusbovis)和腐败梭菌(clostridiumsepticum)的组合或微单胞菌属(parvimonasmicra)和幽门螺杆菌(helicobacterpylori)的组合，优选为牛链球菌(treptococcusbovis)、腐败梭菌(clostridiumsepticum)、微单胞菌属(parvimonasmicra)和幽门螺杆菌(helicobacterpylori)的组合。第二方面，本发明提供了一种检测微生物丰度的方法，包括以下步骤：(1)从所述个体粪便样本中提取dna进行测序，得到测序数据；(2)将步骤(1)所述测序数据中的读段组装为组装片段；(3)将步骤(2)所述的组装片段与如第一方面所述微生物的基因组进行比对，得到所述组装片段的丰度；(4)根据步骤(3)所述组装片段的丰度，得到所述个体粪便样本的微生物标志物的丰度。本发明中，测序数据是测读出来的片段，称为读段。优选地，步骤(2)所述的组装片段为非冗余序列。作为优选技术方案，本发明提供了一种检测微生物丰度的方法，包括以下步骤：(1)从所述个体粪便样本中提取dna进行测序，得到测序数据；(2)将步骤(1)所述测序数据中的读段组装为非冗余组装片段；(3)将步骤(2)所述的组装片段与如第一方面所述微生物的基因组进行比对，得到所述组装片段的丰度；(4)根据步骤(3)所述组装片段的丰度，得到所述个体粪便样本的微生物标志物的丰度。优选地，本发明提供了一种利用如第一方面所述的标志物确定个体状态的方法，包括以下步骤：(1)从所述个体粪便样本中提取dna进行测序，得到测序数据；(2)将步骤(1)所述测序数据中的读段组装为非冗余组装片段；(3)将步骤(2)所述的组装片段与如第一方面所述微生物的基因组进行比对，得到所述组装片段的丰度；(4)根据步骤(3)所述组装片段的丰度，得到所述个体粪便样本的微生物标志物的丰度；(5)将步骤(4)得到的微生物标志物的丰度分别与健康个体和结直肠癌患者粪便样本的微生物标志物的丰度进行比对，确定个体是否患有结直肠癌。本发明中，所述利用如第一方面所述的标志物确定个体状态的方法为早期诊断结直肠癌提供了一种非侵入性的辅助检测方法。第三方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括降低如第一方面所述标志物的丰度的药物。本发明中，所述药物组合物通过抑制肠道内潜在致病菌的生长，扶持肠道内有益菌的生长，修复了缺损的肠道屏障，改善并恢复了肠道的微生态结构，达到了降低标志物的含量的目的。优选地，所述药物组合物包括氨基糖苷类抗生素、万古霉素或克拉霉素中的任意一种和至少两种的组合。优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的标志物在制备结直肠癌诊断试剂和/或结直肠癌诊断药物中的应用。第五方面，本发明提供了一种如第三方面所述的药物组合物在制备治疗结直肠癌药物和/或食品中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的结直肠癌微生物标志物具有作为结直肠癌标志物的潜能，能够较为准确地确定个体是否患有结直肠癌，具有非侵入性辅助诊断结直肠癌的作用，具有较高的灵敏性；(2)使用本发明的微生物标志物进行样本检测，结直肠癌患者的检出率为100％，检测的准确率为99.12％，假阳性率为1.96％，实现了非侵入性辅助诊断结直肠癌的功能。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1个体粪便样本dna的提取(1)采集114名受检者(63名结直肠癌患者和51名健康个体)的粪便样本，立即进行冷冻处理，实验前置于冰上融合；(2)称取200mg固体粪便于2ml离心管中，加入800μl粪便dna提取缓冲液(stooldnabuffera)，充分震荡混匀5min左右，1800g离心1min；(3)从中取出50μl重悬液于干净的1.5ml离心管中，加入800μl裂解液(lysis-bindingbuffer)旋涡震荡混匀，70℃裂解5min，离心5min后转移上清至干净的1.5ml离心管中；(4)加入20μl混匀的磁珠，旋涡震荡20s，室温静置4min，置于磁架上，静置20s，吸取上清；(5)加入500μl洗涤液i(washbufferw1)，旋涡震荡20s，混匀磁珠，置于磁架上，静置20s，弃上清；(6)加入750μl洗涤液ii(washbufferw2)，旋涡震荡20s，混匀磁珠，置于磁架上，静置20s，弃上清，重复一次，尽量除去所有液体；(7)置于磁力架上开盖干燥7-8min，尽量除去所有液体；(8)加入50μl溶解液(elutionbuffer)或双蒸水，旋涡震荡15s，混匀磁珠，65℃下加热7min(期间旋涡震荡10s)，旋涡震荡15s，置于磁架上，静置2min，吸上清于收集管中，得到所述粪便dna。实施例2测序和序列分析(1)将dna进行建库测序，获得的下机数据称为读段；(2)利用soapdenovo软件对读段进行组装，得到组装片段；(3)利用metagenemark软件将组装片段与微生物标志物的参考序列进行比对，依据组装片段与微生物标志物的参考序列的相似性不小于90％，确定组装片段来源于微生物标志物，统计得到组装片段的丰度；(4)根据组装片段的丰度的平均值，确定个体粪便样本的微生物标志物的丰度。实施例3个体状态的确定利用平行试验确定微生物标志物在健康个体和结直肠癌患者粪便样本中的相对丰度，根据公式临界值＝微生物丰度结直肠癌×0.7+微生物丰度健康×0.3得到如表1所示的预定的临界值。当样本的微生物标志物的丰度大于临界值，则被诊断为疾病状态。表1结直肠癌微生物标志物的相对丰度物种名称健康个体结直肠癌患者临界值牛链球菌treptococcusbovis0.0050.1760.1247腐败梭菌clostridiumsepticum0.0310.2420.1787微单胞菌属parvimonasmicra00.0180.0126幽门螺杆菌helicobacterpylori0.3261.1980.9364样本的检测结果见表2。表2检测结果样本名称样本数目检测出的数目检出率结直肠癌患者6364100％健康人515098.04％在114例样本中，本发明的方法共检出64例结直肠癌，另外50例为健康个体。与临床诊断结果相比，63例结直肠癌全部检出，1例健康个体检测为结直肠癌高风险，结直肠癌患者的检出率为100％，检测的准确率为99.12％，假阳性率为1.96％。综上所述，本发明的结直肠癌微生物标志物具有作为结直肠癌标志物的潜能，结直肠癌患者的检出率为100％，检测的准确率为99.12％，假阳性率为1.96％，实现了非侵入性辅助诊断结直肠癌的功能。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12