一种用于检测基因突变的凸环‑ARMS引物及其应用方法与流程

本发明公开了一种用于检测基因突变的引物及其应用方法，特别涉及一种用于检测基因突变的凸环-arms引物及其应用方法。
背景技术：
：基因突变是指，由于dna分子中发生碱基对的增添、缺失或替换，而引起的基因结构的改变，基因突变在自然界各物种中普遍存在。不论是真核生物还是原核生物的突变，也不论是什么类型的突变，基因突变都具有随机性、低频性和可逆性等共同的特性。一般情况下，基因突变是有害的。比如，乙型肝炎病毒（hepatitisbvirus，hbv）是一种属于嗜肝dna病毒科的dna病毒，其核心颗粒直径28纳米，呈二十面体立体对称。它的基因组总长度约为3.2kb，为部分双链dna结构，其中其负链包含完整的hbv基因组，而与之互补的正链的长度是不固定的。目前临床上用于抗病毒治疗乙肝的两类主要药物是核苷（酸）类似物和干扰素类药物（如a-ifn)。其中核苷（酸）类药物的治疗原理是核苷（酸）类药物竞争性地跟hbvdna聚合酶的自然底物（三磷酸脱氧核苷）结合，从而使hbvdna合成终止，达到抑制hbv复制的目的，最终起到治疗乙肝的效果。虽然这类药物对乙肝的治疗有显著的疗效，但若长期用药会产生耐药性问题。而阿德福韦酯（adefovirdipivoxil,adv)是目前在我国上市应用于临床抗hbv药物的核苷（酸）类似物，也是我国临床治疗中应用最多的抗hbv药物之一。患者长期服用adv会有较高耐药率的发生，在接受阿德福韦酯治疗1、2、3、4、5年hbv累积耐药率分别为0%、3%、11%、18%、29%。其中最经典的adv耐药突变形式就是rtn236t（rtn236t是hbv的第236位点的aac突变为acc，即天冬氨酰被苏氨酸替代）。除此之外，hbv耐药基因突变还有rtal8lv、rtm204i、rtm204v。目前常用的检测基因突变的方法包括：一是直接测序法，二是arms法，三是常规探针检测法。直接测序法虽是金标准，但其灵敏度低，只能检测10%～20%突变，且操作步骤繁琐，时间长达1～2天，中间容易出差错，耗费人力、物力较多。arms法又名等位基因特异pcr法，原理是利用taqdna聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，pcr引物的3'端末位碱基必须与其模板dna互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因，该法在设计引物时，在引物3'端设计一错配碱基，一个与野生dna互补，一个与突变dna互补，使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。arms法操作简单、灵敏性高、重复性好，但相对于单碱基突变的基因检测，其特异性不够高，容易产生假阳性。常规探针检测法，是指采用常规引物，仅在探针序列的设计中区分突变与野生位点，本方法设计简单，但因野生型特异性探针与突变型特异性探针的差别碱基个数较少，仍无法克服特异性低、容易产生假阳性的缺陷。因此，急需找到一种简便易行且检测准确性与灵敏度高的方法用于检测基因突变。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种快速、有效、特异性高的用于检测基因突变的凸环-arms引物及其应用方法。本发明所采取的技术方案是：在arms引物基础上进行修饰，得到凸环-arms引物。设计原理为，针对需检测是否存在突变的核酸序列设计突变型引物，此引物的基因突变区域与突变区域后的核酸序列与模板序列完全互补配对，但在突变区域与突变区域后的核酸序列之间，插入若干个碱基，其与模板序列并不互补配对，从而凸起形成一个凸环结构，本凸环结构将引物分隔成了基因突变点区与突变点区后的碱基序列两个部分。因凸环结构与模板结合力较弱，当其3’端区域（即基因突变点所在区域）与模板完全互补配对时，引物可以发生延伸，即完成pcr扩增，并完成后续的检测过程；当3’端区域（即基因突变点所在区域）与模板不匹配时，在凸环结构的影响下，引物脱离模板序列，不能延伸，导致pcr扩增无法进行。最终，根据检测结果即可判断检测的核酸序列中是否存在相应突变。优选的，所述凸环-arms引物的设计中，引入碱基数量为3-8个。优选的，所述凸环-arms引物的设计中，引入碱基数量为4-5个。优选的，所述凸环-arms引物的设计中，插入的碱基类型可包括a、t、c、g中的任一个。优选的，所述凸环-arms引物的设计中，插入的若干碱基是连续排列的。优选的，可将所述凸环-arms引物扩增后的产物直接电泳，可根据电泳是否有相应大小的条带直观判断检测的核酸序列中是否存在相应突变。优选的，可将所述凸环-arms引物应用在荧光pcr技术上，如果完成pcr扩增，将产生荧光曲线；如果pcr扩增无法完成，将没有荧光曲线产生。优选的，所述凸环-arms引物可应用于hbv病毒基因突变的检测。优选的，所述凸环-arms引物可应用于hbv病毒rtn236t突变的检测。优选的，针对hbv的rtn236t突变设计突变型的凸环-arms引物，即引物r序列为：no1.5’-ccatctctttgttttgtaaaaag-3’，（arms引物r’为：no2.5’-ccatctctttgttttgtaaaaat-3’），其对应的公共上游引物f为：no3.5’-agtctgtacagcatcttgagtc-3’，公共探针p为：no4.5’-aatgtatacccaaagacaaaagaaaattgg-3’。本发明的有益效果：本发明的一种用于检测基因突变的凸环-arms引物及其应用方法，在arms引物的3’端上引入若干个碱基，形成一个凸环结构，降低了探针设计的难度，可以有效检测生物样本中的基因突变，且检测的准确性、灵敏度与特异性均更高。附图说明：图1为凸环-arms引物pcr技术原理；图2为凸环-arms引物扩增检测hbv病毒基因突变的电泳图；图3为凸环-arms引物和arms引物的灵敏度对比检测结果；图4为凸环-arms引物的特异性检测结果；图5为arms引物的特异性检测结果。具体实施方式实施例1凸环-arms引物扩增与电泳结合检测hbv病毒基因突变的方法将本发明的凸环-arms引物应用于检测hbv病毒基因突变的荧光pcr方法如下：针对hbv的rtn236t突变设计突变型的凸环-arms引物，引物r序列为：no1.5’-ccatctctttgttttgtaaaaag-3’，（arms引物r’为：no2.5’-ccatctctttgttttgtaaaaat-3’），其对应的公共上游引物f为：no3.5’-agtctgtacagcatcttgagtc-3’。分别扩增已确定为rtn236t突变的病毒样本及无rtn236t突变的病毒样本，扩增结束后琼脂糖电泳检测，电泳结果如图2所示，为rtn236t突变的病毒样本经扩增后电泳，存在明显的目的片段条带，无rtn236t突变的病毒样本经扩增后电泳，未有目的片段条带。表明本发明的凸环-arms引物扩增后，可采用电泳的方法检测样本中是否存在基因突变。实施例2凸环-arms引物和arms引物的灵敏度对比将本发明的凸环-arms引物应用于检测hbv病毒基因突变的荧光pcr方法如下：针对hbv的rtn236t突变设计突变型的凸环-arms引物，引物r序列为：no1.5’-ccatctctttgttttgtaaaaag-3’，（arms引物r’为：no2.5’-ccatctctttgttttgtaaaaat-3’），其对应的公共上游引物f为：no3.5’-agtctgtacagcatcttgagtc-3’，公共探针p为：no4.aatgtatacccaaagacaaaagaaaattgg。50μl的荧光pcr体系中，其各组分浓度分别为：12mmol/ltris-hcl、65mmol/lkcl、0.25mmol/ldntps（u）、3.5mmol/lmgcl2、0.06u/μl的快速taq酶、0.2μmol/l的引物、0.06μmol/l的探针，于abi7500荧光pcr仪进行pcr。pcr条件为：95度5min后；95℃5秒，58℃31秒（收集荧光），40个循环。按表1配制凸环-arms引物反应体系，按表2配制arms引物反应体系，分别以1%、5%、20%、50%hbvrtn236t突变为样本，对比两者灵敏度（结果见图3）。实施例3凸环-arms引物和arms引物的特异性对比按表1配制凸环-arms引物反应体系，按表2配制arms引物反应体系，分别以20%hbvrtn236t突变、hbv野生型、hcv为样本，对比两者的特异性（结果见图4、图5）。表1凸环-arms引物的反应体系（50μl）原辅料名称浓度引物f0.2μmol/l引物r0.2μmol/l探针p0.06μmol/ltris-hcl12mmol/lkcl65mmol/ldntps（u）0.25mmol/lmgcl23.5mmol/l快速taq酶0.06u/μl模板1ng/μl表2arms引物的反应体系（50μl）原辅料名称浓度引物f’0.2μmol/l引物r0.2μmol/l探针p0.06μmol/ltris-hcl12mmol/lkcl65mmol/ldntps（u）0.25mmol/lmgcl23.5mmol/l快速taq酶0.06u/μl模板1ng/μl从灵敏度结果看，所有样本都是阳性，但从ct值看，凸环-arms引物≥arms引物，说明凸环-arms引物具有更高的灵敏度。从特异性结果看，凸环-arms引物体系中：20%hbvrtn236t突变样本为阳性、hbv野生型样本为阴性，hcv样本为阴性；arms引物体系中：20%hbvrtn236t突变样本为阳性、hbv野生型样本为阳性，hcv样本为阴性。说明凸环-arms引物比arms引物具有更高的特异性。综上，本发明一种检测hbv病毒基因突变的凸环引物荧光pcr新方法具有高灵敏度、高特异性、等优点。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效试剂变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表<110>广州和实生物技术有限公司<120>一种用于检测基因突变的凸环-arms引物及其应用方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus)<400>1ccatctctttgttttgtaaaaag23<210>2<211>23<212>dna<213>乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus)<400>2ccatctctttgttttgtaaaaat23<210>3<211>22<212>dna<213>乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus)<400>3agtctgtacagcatcttgagtc22<210>4<211>30<212>dna<213>乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus)<400>4aatgtatacccaaagacaaaagaaaattgg30当前第1页12