本发明涉及肥料技术领域，具体涉及一种脲酶抑制剂的制备方法。
背景技术：
水稻旱直播是一项新型高效省工、节水和易于机械化的栽培技术，也是当前水稻生产技术转型期稳定面积、提高产量的优选技术之一。作为新型高效节水栽培技术，水稻旱直播在稳定水稻种植面积方面发挥着不可替代的作用，在我国具有广阔的发展前景。然而在大面积生产上，成苗率低和出苗不整齐是成为旱直播大面积推广的关键制约因子。究其原因，施用大量尿素做基肥后较高浓度的氨挥发为旱直播水稻出苗不整齐和成苗率低的主要原因。
素具有许多优良特性，是目前世界和我国农业生产中应用最广泛、数量最多的氮肥，约占50%的世界氮肥生产及消费市场，也是牛、羊、兔等反刍动物用来合成自身蛋白（MCP）的最廉价且广泛使用的非蛋白氮（NPN）饲料，同时也是人体和动物体中大量含氮化合物的代谢产物。作为化肥，它有促进穗大粒重，养根健叶、壮秆防倒伏的作用。尿素本身无毒，能够稳定地存在于水溶液中，但环境和生物体中广泛存在的脲酶能将尿素迅速催化水解成NH3，其速度是未经催化水解的1014倍，极大地降低了动植物对氮素的利用，使尿素利用率通常只有30%～40%，全国每年因此损失化学氮素约1.0×107 t左右。尿素的快速分解，不仅造成农业资源的严重浪费，同时对人类、动物和植物等也有严重的危害：导致植物“烧苗”和亚硝酸盐污染农产品，增加农业成本，引起严重的环境氮污染和农村面源污染，并导致水体富营养化。因此，如何提高尿素利用率，解决脲酶所引起的经济、环境和健康等问题，已成为当前农、牧业生产上一个迫切需要解决的难题，也是当今世界经济和农业可持续发展上的一个挑战性课题。
脲酶的活性是影响尿素分解的最主要因素。在土壤中脲酶作用下，尿素水解为简单无机离子，水解的速度非常快，通常在15天内就接近完全水解。若要使尿素的分解速度与植物吸收氮的速度同步，关键是要控制能引起尿素分解的脲酶的活性。目前较为常用的做法是在尿素中添加适量脲酶抑制剂，脲酶抑制剂是对土壤脲酶活性有抑制作用的一类物质，它在短期内能延缓尿素的水解，减少氮的损失，添加适量脲酶抑制剂适当抑制土壤中脲酶的活性，以达到延缓尿素的水解，提高氮肥利用率的目的。
脲酶抑制剂的作用机制主要表现为：第一，竞争性抑制，在反应过程中同尿素竞争结合到脲酶上去，降低了尿素与脲酶活性中心的结合几率，从而起到了降低尿素分解的作用；第二，使脲酶变性失活，失去分解尿素的能力，降低有效的脲酶浓度，从而抑制了尿素的分解；第三，调控脲酶分子的表达，通过一定的抑制剂来阻止细菌内合成脲酶分子，使表达脲酶的基因受阻，有效降低脲酶浓度等。
至今已使用过的脲酶抑制剂有100多种，主要分为Ag、Hg等金属盐、有机物小分子和植物提取物等三大类。由于金属盐毒性较大，限制了其应用；有机类则高残留、毒副作用大、易溶易流失、有效抑制时间短；而植物源脲酶抑制剂一般具有制剂成分复杂、不易标准化、发挥药效慢、活性成分易分解等缺点，不易为农民接受。使用最多的脲酶抑制剂主要有磷酸二酰胺、磷酸三酰胺、乙酰氧肟酸、苯醌等，主要运用在人类医学和土壤上，较少用于动物养殖业。尿酶抑制剂还普遍存在价格昂贵，作用时间较短、容易被微生物适应而钝化或被微生物分解产生的酶降解而失活等缺点。
因此，发明一种新型的脲酶抑制剂组合物，以此来解决现有脲酶抑制剂的不足，适应于社会和有关行业的需求，是一件十分有必要的事情。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题：本发明的目的是针对目前脲酶抑制剂毒副作用大、易溶易流失、有效抑制时间短，活性成分易分解的问题，提供一种脲酶抑制剂的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：
一种脲酶抑制剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
（1）将硝基苯甲醛与丙二酸、无水乙醇混合，搅拌回流，得硝基苯甲醛反应液，向硝基苯甲醛反应液中加入吡啶，搅拌回流，冷却、抽滤，得对硝基肉桂酸粗产物，将对硝基肉桂酸粗产物用蒸馏水洗涤3-5次，烘干，得烘干粗产物，将烘干粗产物加水溶解，得粗产物溶液，用NaOH溶液将粗产物溶液的pH值调至7.0±0.2，过滤取滤液A，向滤液A中加盐酸将pH值调至3.0±0.2，过滤，取滤液B，向滤液B中加入乙醇溶液重结晶，得高纯度过渡配合物基体晶体；
（2）将高纯度过渡配合物基体晶体与甲醇和稀氨水混合均匀，得混合液，向混合液中加入硫酸铜和二胺甲醇溶液混合均匀，搅拌，过滤，取滤液静置，有天蓝色晶体析出，得对硝基肉桂酸铜配合物。
所述步骤（1）中硝基苯甲醛与丙二酸、无水乙醇的质量比为1：1：30；硝基苯甲醛反应液与吡啶的质量比为20：3；烘干粗产物与水的质量比为1：10；滤液B与乙醇溶液的体积比1：5。
所述步骤（2）中高纯度过渡配合物晶体与甲醇和稀氨水的质量比为1：15：10；混合液与硫酸铜固体和二胺甲醇溶液的质量比为15：1：2。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
尿素的羰基氧首先与 Ni1 配位，同时或随后尿素的氨基氮与 Ni2 配位，接着桥连两个镍的羟基氧会进攻尿素的羰基碳，本发明以对硝基苯甲醛为原料合成了对硝基肉桂酸，再以其作为配体，采用溶液结晶法合成了新型对硝基肉桂酸过渡铜配合物，铜除了能抑制脲酶脱辅基蛋白的活化过程外，还会不可逆的占据本应属于镍的结合位点，从而对脲酶活性造成不可逆的抑制，对硝基肉桂酸也表现出一定的脲酶抑制活性，这是因为对硝基肉桂酸与脲酶结合时，可能会正好盖在脲酶的活性位点上，进而阻挡了尿素进入活性位点的路径，从而达到抑制脲酶活性的效果。
具体实施方式
一种脲酶抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将硝基苯甲醛按质量比1：1：30与丙二酸、无水乙醇混合，在80~85℃条件下，搅拌回流1~2h，得硝基苯甲醛反应液，向硝基苯甲醛反应液中按质量比20：3加入吡啶，搅拌回流约7~8h，冷却、抽滤，得对硝基肉桂酸粗产物，将对硝基肉桂酸粗产物用蒸馏水洗涤3~5次，烘干，得烘干粗产物，将烘干粗产物按质量比1：10加水溶解，得粗产物溶液，用NaOH溶液将粗产物溶液的pH值调至7.0±0.2，过滤取滤液A，向滤液A中加盐酸将pH值调至3.0±0.2，过滤，取滤液B，向滤液B中按体积比1：5加入乙醇溶液重结晶，得高纯度过渡配合物基体晶体；
（2）将高纯度过渡配合物基体晶体按质量比1：15：10与甲醇和稀氨水混合均匀，得混合液，向混合液中按质量比15：1：2加入硫酸铜和二胺甲醇溶液混合均匀，搅拌20 min，过滤，滤液于20~25℃静置4~6天，天蓝色晶体析出，得脲酶抑制剂对硝基肉桂酸铜配合物。
实施例1
一种脲酶抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将硝基苯甲醛按质量比1：1：30与丙二酸、无水乙醇混合，在80℃条件下，搅拌回流1~2h，得硝基苯甲醛反应液，向硝基苯甲醛反应液中按质量比20：3加入吡啶，搅拌回流约7h，冷却、抽滤，得对硝基肉桂酸粗产物，将对硝基肉桂酸粗产物用蒸馏水洗涤3次，烘干，得烘干粗产物，将烘干粗产物按质量比1：10加水溶解，得粗产物溶液，用NaOH溶液将粗产物溶液的pH值调至7.0±0.2，过滤取滤液A，向滤液A中加盐酸将pH值调至3.0±0.2，过滤，取滤液B，向滤液B中按体积比1：5加入乙醇溶液重结晶，得高纯度过渡配合物基体晶体；
（2）将高纯度过渡配合物基体晶体按质量比1：15：10与甲醇和稀氨水混合均匀，得混合液，向混合液中按质量比15：1：2加入硫酸铜和二胺甲醇溶液混合均匀，搅拌20 min，过滤，滤液于20℃静置4天，天蓝色晶体析出，得脲酶抑制剂对硝基肉桂酸铜配合物。
实施例2
一种脲酶抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将硝基苯甲醛按质量比1：1：30与丙二酸、无水乙醇混合，在83℃条件下，搅拌回流1h，得硝基苯甲醛反应液，向硝基苯甲醛反应液中按质量比20：3加入吡啶，搅拌回流约7h，冷却、抽滤，得对硝基肉桂酸粗产物，将对硝基肉桂酸粗产物用蒸馏水洗涤4次，烘干，得烘干粗产物，将烘干粗产物按质量比1：10加水溶解，得粗产物溶液，用NaOH溶液将粗产物溶液的pH值调至7.0±0.2，过滤取滤液A，向滤液A中加盐酸将pH值调至3.0±0.2，过滤，取滤液B，向滤液B中按体积比1：5加入乙醇溶液重结晶，得高纯度过渡配合物基体晶体；
（2）将高纯度过渡配合物基体晶体按质量比1：15：10与甲醇和稀氨水混合均匀，得混合液，向混合液中按质量比15：1：2加入硫酸铜和二胺甲醇溶液混合均匀，搅拌20 min，过滤，滤液于22℃静置5天，天蓝色晶体析出，得脲酶抑制剂对硝基肉桂酸铜配合物。
实施例3
一种脲酶抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将硝基苯甲醛按质量比1：1：30与丙二酸、无水乙醇混合，在85℃条件下，搅拌回流2h，得硝基苯甲醛反应液，向硝基苯甲醛反应液中按质量比20：3加入吡啶，搅拌回流约8h，冷却、抽滤，得对硝基肉桂酸粗产物，将对硝基肉桂酸粗产物用蒸馏水洗涤5次，烘干，得烘干粗产物，将烘干粗产物按质量比1：10加水溶解，得粗产物溶液，用NaOH溶液将粗产物溶液的pH值调至7.0±0.2，过滤取滤液A，向滤液A中加盐酸将pH值调至3.0±0.2，过滤，取滤液B，向滤液B中按体积比1：5加入乙醇溶液重结晶，得高纯度过渡配合物基体晶体；
（2）将高纯度过渡配合物基体晶体按质量比1：15：10与甲醇和稀氨水混合均匀，得混合液，向混合液中按质量比15：1：2加入硫酸铜和二胺甲醇溶液混合均匀，搅拌20 min，过滤，滤液于25℃静置6天，天蓝色晶体析出，得脲酶抑制剂对硝基肉桂酸铜配合物。
对比例：河南某生物科技有限公司生产的脲酶抑制剂
方法：选取四份等量的尿素肥料，分别使用实施例与对比例所制备的脲酶抑制剂进行抑制测定。
脲酶抑制剂具体检测情况如表1
表1
脲酶抑制剂有效抑制时间具体检测情况如表2
表2
由上可知，对比例所制备的脲酶抑制剂在使用后的14h左右开始不在产生抑制效果，而本发明所制备的脲酶抑制剂仍旧在有效使用。
因此，本发明所制备的脲酶抑制剂，有效抑制时间长，有效利用率高，且本发明所使用的原料对人体和环境无害，因此是一种安全且高效的脲酶抑制剂，值得推广和使用。