本发明属于动物疫病检测
技术领域：
，具体涉及一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr引物、检测方法及试剂盒。
背景技术：
：口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，fmdv)属于小rna病毒科(picornaviridae)，口蹄疫病毒属(aphthovirus)的成员，为无囊膜的单股正链rna。到目前为止，己经发现了7个血清型，80多个亚型和众多差异明显的病毒株。我国主要流行o型、a型和asiali型。塞内加谷病毒(senecavalleyvirus，svv)是小核糖核酸病毒科(picornaviridae)senecavirus病毒属的典型代表。hales等通过对svv-001遗传序列进行分析后将senecavirus列为小rna病毒科的新的病毒属(halesetal.,2008)，为无囊膜的单股正链rna。svv最初被认为是细胞培养物中的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清(reddyetal.,2007)。到2007年，一批自加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡，蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，经检测排除口蹄疫、水泡性口炎病和猪水疱病，最终通过pcr检测确定为svv阳性(pasmatetal.,2008)。2014年11月，巴西也出现猪群感染svv的报道。2015年3月，我国广东某猪场超期断奶猪被发现跛行，出现鼻镜水泡，送检水泡液、水泡皮、脚皮样品，检测结果显示猪口蹄疫、猪水疱病病原均阴性。继而查找资料，确定发病猪群感染svv。随后在2015年10月、11月及2016年1月、2月陆续在其他猪场发现猪群感染svv病例。由于svv感染动物所引起的症状与其他病毒性疾病如口蹄疫临床表现十分相似，给临床确诊带来了难度。因此，需要实验室技术加以确定。目前主要包括病毒分离、抗体检测和抗原检测等。然而这些方法操作比较繁复，且很难准确区分塞内加谷病毒感染还是口蹄疫病毒感染。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的fmdv和svv联合检测鉴别方法，准确认别猪感染的病因并对症下药，对生猪养殖行业意义重大。技术实现要素：为解决以上问题，本发明提供用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr引物、检测方法及试剂盒，建立一种能够同时鉴别诊断fmdv和svv病毒的双重pcr检测方法，且具有很高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，从而实施正确的治疗方案，挽回经济损失。本发明第一方面提供一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr引物，所述引物根据检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的高度保守的特异性序列设计双重pcr引物，其中，猪口蹄疫病毒的检测引物，由seqidno：1所示的核苷酸序列的正向引物和seqidno：2所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪塞内加谷病毒的检测引物，由seqidno：5所示的核苷酸序列的正向引物和seqidno：6所示的核苷酸序列的反向引物组成。上述的检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr引物在制备检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的制品中的应用。本发明第二方面提供一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品制备基因组总dna；2)以制备的基因组dna为模板，利用如权利要求1所述的双重pcr引物，在同一反应体系中进行双重pcr扩增，得到扩增产物；3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。在本发明一实施例中，所述用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr反应体系总体积为50μl，包括：1)10μm的seqidno：1、seqidno：2、seqidno：5、seqidno：6所示核苷酸序列各1μl；2)10×pcrbμffer5.0μl；3)dntpmixtμre4.0μl；4)rtaqdna聚合酶1.0μl；5)rnasefreeddh2032.0μl；6)待测样品的dna模板4μl。在本发明一实施例中，所述用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr反应条件包括：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环结束后；72℃终延伸10min。在本发明一实施例中，所述的用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr检测方法，其检测灵敏度可达102拷贝/μl。本发明第三方面提供一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr检测试剂盒，包括如本发明第一方面所述的检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr引物，还包括10×pcrbuffer、dntp、mgcl2、taq酶、阳性质控品、阴性质控品。在本发明一实施例中，所述的用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr检测试剂盒可特异性检测鉴定猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒，不能检测出猪流行性腹泻病毒、猪水泡病病毒、水疱性口炎病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒中的一种或多种。本发明第四方面提供一种如本发明第一方面所述的双重pcr引物、如本发明第二方面所述的双重pcr检测方法或如本发明第三方面所述的双重pcr检测试剂盒在猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。附图说明图1为本发明实施例提供的双重pcr检测的引物筛选电泳图，其中，m为dl1000dnamarks，泳道1为阴性对照，泳道2为fmdv-1-f/r与svv-1-f/r，泳道3为fmdv-1-f/r与svv-2-f/r，泳道4为fmdv-2-f/r与svv-2-f/r；图2为本发明实施例提供的双重pcr检测的引物浓度优化电泳图，其中，m为dl1000dnamarks，1为阴性对照，2-9为fmdv-1-f/r与svv-1-f/r引物浓度组合，其中泳道7即fmdv-1-f/r与svv-1-f/r的加入浓度均为0.2μmol/l为最优；图3为为本发明实施例提供的双重pcr检测的退火温度优化电泳图，其中，m为dl1000dnamarks，1为阴性对照，2-9为不同退火温度，分别为60.0℃、59.2℃、58.0℃、56.1℃、53.7℃、51.9℃、50.7℃、50.0℃；图4为本发明实施例提供的双重pcr检测的特异性试验的电泳图，其中泳道2为猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒混合检测的电泳结果，泳道3为猪塞内加谷病毒检测的电泳结果，泳道4为猪口蹄疫病毒检测的电泳结果，5、6、7、8、9、10分别为猪流行性腹泻病毒、猪水泡病病毒、水疱性口炎病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的电泳结果，显示未检出；图5为本发明实施例提供的猪塞内加谷病毒pcr检测的敏感性试验的电泳图，其中泳道2-14分别为1011-10-1拷贝/μl；图6为本发明实施例提供的猪口蹄疫病毒pcr检测的敏感性试验的电泳图，其中泳道2-14分别为1011-10-1拷贝/μl；图7为本发明实施例提供的猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重pcr检测的敏感性试验的电泳图，其中泳道2-14分别为1011-10-1拷贝/μl；具体实施方式以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。实施例11.猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒核酸模板的制备1)取临床样品于-80℃反复冻融3次后用于病毒核酸的提取。参照trizol法提取方法提取病毒总rna。2)将上述步骤1)提取所得的病毒总rna用反转录试剂盒制备cdna，-80℃保存备用。反应体系如下：第一步随机引物1μlrna5.75μl70℃水浴10min后冰浴2min，得rna引物混合物第二步30℃水浴10min，42℃水浴1h，冰浴冷却，反转录完成后合成的cdna置于冰上用于后续实验或置于-20℃保存。2.猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重pcr方法特异性引物筛选及体系优化1)猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重pcr引物设计根据genbank登录的口蹄疫病毒o型、a型、asiali型核酸的基因组全长序列，利用应用clustw软件进行多重比对，在三个型都高度保守的2c基因位置用primer5.0软件设计保守的通用型引物。选取塞内加谷病毒的保守基因vp4基因，用primer5.0基因分析软件设计高度保守的特异性引物，所有引物均有北京睿博生物科技有限公司合成，具体序列见表1：表1针对猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的特异性引物：2)猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重pcr的反应体系及反应条件猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重pcr的反应体系见表2：表2猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重pcr的反应体系反应试剂加入体积10×pcrbufferpcr扩增反应液5.0μldntpmixture4.0μl10μm引物(fmdv和svv)各1.0μlpcr扩增酶1.0μl核酸模板(fmdv和svv)各2.0μl补水至50μl反应条件：94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，72℃终延伸10min，反应结束后按照经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：如图1所示，fmdv-1-f/r与svv-1-f/r特异性条带较亮、清晰，因此，筛选fmdv-1-f/r与svv-1-f/r为猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重pcr鉴定引物。3)猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重pcr的引物浓度优化对筛选所得的猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重pcr引物fmdv-1-f/r与svv-1-f/r做引物浓度优化实验，引物浓度组合如表3所示：表3fmdv-1-f/r与svv-1-f/r引物浓度组合(μmol/l)按上述pcr反应条件进行扩增，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图2所示，组合7的引物浓度组合的双重pcr效果最好，即猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒引物浓度分别为0.2μmol/l时，条带较亮、清晰，确定双重pcr各引物浓度为0.2μmol/l为最优。4)猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重pcr的退火温度优化根据引物设计时primer5.0给出的参考值，对双重pcr退火温度进行摸索，设置50～60℃中的八个梯度(50.0℃、50.7℃、51.9℃、53.7℃、56.1℃、58.0℃、59.2℃、60.0℃)分别与cdna模板进行pcr扩增。结果：如图3所示，在退火温度为56.1℃时，条带较亮、清晰，因此，最佳退火温度为56.1℃。实施例2本发明试剂盒的性能验证1)特异性试验采用优化后的多重rt-pcr方法对猪口蹄疫病毒(fmdv)、猪塞内加谷病毒(svv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪水泡病病毒(svdv)、水疱性口炎病毒(vsv)、猪蓝耳病病毒(prrsv)、猪圆环病毒(pcv)、猪瘟病毒(csfv)进行扩增，并选择灭菌水做阴性对照，检验所建立方法的特异性。结果如图4所示，猪口蹄疫病毒(fmdv)的目的片段大小为312bp；猪塞内加谷病毒(svv)的目的片段大小为599bp；而猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒混合感染目的片段大小有两条，分别为312bp和599bp；pedv、svdv、vsv、prrsv、pcv、csfv病毒均未见特异性条带扩增。2)敏感性试验a)单重rt-pcr敏感性试验分别以svv和fmdv的混合质粒10倍倍比稀释的质粒(1011～10-1)作为模板，用建立好的多重rt-pcr方法进行扩增，扩增结果显示svv最低检测量为1.40×100拷贝/μl如所图5所示，fmdv最低检测量为1.10×101拷贝/μl，如图6所示。b)多重rt-pcr敏感性试验以svv和fmdv的混合质粒10倍倍比稀释的质粒(1011～10-1)作为模板，用建立好的多重rt-pcr方法进行扩增，扩增结果显示svv最低检测量为1.40×102拷贝/μl，fmdv最低检测量为1.10×102拷贝/μl，如图7所示。3)多重pcr重复性试验以svv和fmdv的混合质粒1011～10-1拷贝/μl为模板，利用建立好的多重rt-pcr方法进行3次重复试验，结果相同，表明此多重rt-pcr有较高的可重复性。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<110>华南农业大学<120>用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重pcr引物、检测方法及试剂盒<130>2017<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1caagcgtgtttgaagagc18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aaccatttgggcgaagta18<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cgttgaaatgaagagaatgcaac23<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gatcatgatcactatgtttgcca23<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ccgtccagcagcacagat18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggaacgagcaccataacg18<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ttgctagaggcacagaggagc21<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tactcatggtggtagcaatcacg23当前第1页12