技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种小分子抑制剂，具体来说是一种天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂及其用途。
背景技术：
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脑胶质瘤是起源于胶质细胞的肿瘤，是中枢神经系统最常见的肿瘤，约占成人颅内肿瘤的40％-50％。其中恶性度最高的为胶质母细胞瘤(glioblastoma，gbm)，在所有类型的胶质瘤中占60％以上。恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35-54岁患者的第3位死亡原因。尽管gbm的手术率达71.6％，手术后规范化放化疗率为51.4％，但gbm细胞呈浸润性生长，和正常脑组织没有明显界线，使手术难以完全切除肿瘤，加上肿瘤细胞对放、化疗不敏感，gbm患者的五年生存率仅3％左右，中位生存期仅为14.6个月左右，预后极差。目前恶性脑肿瘤的诊断和治疗方法仍相对缺乏。
目前临床上胶质瘤患者的治疗缺乏积极有效的治疗药物。
技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂及其用途，所述的这种天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂及其用途要解决现有技术中对于脑胶质瘤疾病的治疗效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂，其结构式如下所示：
本发明还提供了上述的一种天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂在制备治疗脑胶质瘤中的用途。
发明人通过研究设计出天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂，该抑制剂可显著抑制天冬酰胺内肽酶的活性，并且随着抑制剂浓度的增加，天冬酰胺内肽酶的活性逐渐降低。同时在颅内胶质瘤原位小鼠模型中，天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂可显著抑制肿瘤体积，明显提高小鼠的存活率及存活时间。因此，天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂能够通过有效的抑制天冬酰胺内肽酶活性达到治疗肿瘤患者的目的。
本发明所提供的天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂对降低脑胶质瘤中天冬酰胺内肽酶的活性具有显著作用，对延长胶质瘤患者的生存期具有重要意义。
本发明研究和已有药物相比，其疗效是显著和积极的。本发明所提供的小分子抑制剂可用于临床及科研中，可对胶质母细胞瘤患者的发展进行有效的控制干预，对改善胶质瘤患者的预后具有重要意义。本发明将在医学治疗领域发挥重要作用，将在肿瘤治疗领域发挥重要作用。
附图说明：
图1为本发明的天冬酰胺内肽酶(aep)抑制剂(小分子化合物)对天冬酰胺内肽酶活性的影响。
图2为本发明的天冬酰胺内肽酶(aep)抑制剂(小分子化合物)对荷瘤小鼠的疗效。
具体实施方式：
实施例1建立颅内胶质瘤原位动物模型
采用6周领的雄性裸鼠(8只/组)，以立体定向仪注射gbm细胞-u87-mg制作裸鼠原位脑胶质瘤模型。参照裸小鼠脑解剖图谱，以前囟中点向右旁开1.8mm，往前0.5mm为目标注射位点。用5号针针头在颅骨上成形约1mm直径窗口，通过微注泵吸取5μl，约5x105细胞数。进针3mm，缓慢注入，注入后缓慢拔针。当任何一组小鼠出现消瘦、少动或行为异常时行小鼠头颅mri成像，小鼠成像后，将其放入动物房继续饲养，当出现禁食时，将其进行过量麻药注射，并对其血管系统用预冷的生理盐水盥洗，用手术器械掀开颅骨，取下脑组织。
he染色
1)固定：将上述保存的脑组织解冻后用生理盐水冲洗一次，立即放入中性通用组织液中固定，固定时间为30-50分钟；
2)洗涤：将固定后的脑组织用流水冲洗，之后放入4℃冰箱过夜或室温下放置数小时(动作需轻柔以免损坏脑组织)；
3)脱水：固定好的脑组织依次按照70％、80％、90％不同浓度的各级乙醇溶液脱水，在每个梯度溶液中静置30分钟，之后再依次放在95％和100％的乙醇溶液中各2次，每次时间为20min(为保证乙醇浓度正确，需按时更换乙醇)；4)透明：依次将小鼠脑组织放入100％乙醇、二甲苯等量混合液中15分钟，二甲苯ⅰ15分钟、二甲苯ⅱ15分钟，直到其透明为止；
5)透蜡：将脑组织样本在放入二甲苯-石蜡各半的混合液内15min，再依次放入石蜡ⅰ、石蜡ⅱ内透蜡50～60分钟；
6)包埋：在包埋前，用镊子轻轻夹住石蜡模子在酒精灯上稍微加热，再放在平坦的桌面或操作台上，从温箱内取出盛放纯石蜡的杯子，倒入少许石蜡，再把镊子放在酒精灯上短暂加热，小心地夹取脑组织将切面朝下放入石蜡膜内，排列整齐，并放上包埋盒，倒入熔蜡；
7)切片：
a.将固定和修整好的石蜡块放在切片机的夹物台上，轻轻摇动推动螺旋使石蜡块与刀口贴近，调整蜡块与刀口之间的角度与位置，使刀片与切片成15度左右；
b.调整厚度调节器使石蜡切片呈一定厚度，一般为4μm，上述调节程序设置好后即可开始切片。右手摇动转轮(通常为40-50r/min)，左手用毛笔将蜡带轻轻提起，以免蜡带卷曲，其中较皱的一面朝上，光滑的一面则朝下；c.将切好的的蜡带放在放大镜下或者显微镜下观看，注意切片是否良好，切片完成后清理切片机内残存的组织碎片；
8)展片、贴片：先将切好的切片放在30％的乙醇中，使切片完全展开，片刻后，再将切片捞至40-45℃水浴锅中使切片充分展开，再将展开的切片捞起，使其位于载玻片的光滑端，另一段则做好标记，放至切片架上；
9)染色：
a.65℃温箱进行充分干燥(脱蜡的前一天放进温箱或60℃烤片1-2h)。
注意：进行高温干燥后迅速脱蜡，返回室温的情况下蜡容易变厚需延长脱蜡时间；
b.二甲苯ⅰ10min，二甲苯ⅱ10min，二甲苯ⅲ10min；
c.100％乙醇3次各5min
d.90％乙醇1次5min，80％乙醇1次5min，70％乙醇1次5min；
e.自来水冲洗10min；
f.1×pbs浸润5min；
g.苏木素核染5min；
h.自来水冲洗5min；
i.1％盐酸乙醇1-2秒；
j.自来水冲洗5min；
k.ddh2o略洗；
l.伊红染色2min；m.自来水稍洗；
n.70％乙醇上下晃动3-6次，80％乙醇上下晃动3-6次，90％乙醇上下晃动3-6次，
100％乙醇3次各上下晃动3-6次；
o.二甲苯ⅲ10min，二甲苯ⅱ10min，二甲苯ⅰ10min；
p.用适量的中性树脂封片
实施例2
发明人针对天冬酰胺内肽酶设计了小分子抑制剂，本发明的小分子抑制剂可以有效抑制天冬酰胺内肽酶的活性，随着天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂的浓度从0.1um增加至1um，aep的相对活性从0.699降至0.028，并且随着浓度的增加，天冬酰胺内肽酶的活性降低更显著。(如0.1um天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂中天冬酰胺内肽酶的活性较对照组显著下降，t＝10.54，p值小于0.001)，表明小分子抑制剂的效果显著(如图1所示)。
随后，在胶质瘤原位小鼠模型中，mri发现，给予aep小分子抑制剂能够显著抑制胶质瘤体积，p值小于0.001，磁共振观察发现aep抑制剂显著抑制肿瘤体积(图2a)。h&e染色结果同样表明aep抑制剂显著抑制肿瘤大小(图2b、c)。统计这些自发小鼠的存活时间，发现给予aep抑制剂治疗后的小鼠，存活率和存活时间要高于对照组(图2d)。
实施例3
本发明的小分子抑制剂的制备、纯化和鉴定的过程如下：
反应条件及试剂：a：30％hbr/acoh常温，b:30％hbr/acoh，etoh，回流条件，4小时，c:naoet/etoh，常温，2小时，d:koh/etoh，常温，4h，e：肼，meoh，常温，16小时，f:2-溴乙酰胺，nmm,dmf，常温，36小时；g:5.edc,hobt,dmf，常温。
1)在冰浴上向d-(-)-tartrate(1,30g)中边搅拌边逐滴加入30％hbr/acoh(88ml)混合物。混合物室温下搅拌过夜，加入200ml冰水终止反应。用乙醚(200ml×3)提取水相，用水和盐水洗涤有机层，并na2so4风干。去除溶剂，留下复合物2为淡黄色油状物(42g,93％)。
2)将复合物2(19.4g,62.6mmol)溶于80ml酒精中，并逐滴加入30％hbr/acoh(7.1ml)混合物。反应在回流条件下持续4h，加入40ml冰水终止反应。用乙醚(200ml×3)提取水相，用水和盐水洗涤有机层，并na2so4风干。溶剂被蒸发留下复合物3为淡黄色油状物(14.5g,87％)
3)置于冰上冷却的烧瓶里将0.27g金属钠溶于15ml无水乙醇。加入溶于8ml无水乙醇的复合物3(2.67g,9.95mmol)，室温下搅拌2h，加入1ml乙酸。浓缩后，加入20ml冰水。用乙醚(200ml×3)提取水相，用水和盐水洗涤有机层，并na2so4风干。溶剂被蒸发留下复合物4为淡黄色油状物(1.5g,80％)。
4)将溶于10ml无水乙醇的复合物4(1.5g,7.9mmol)加入溶于3ml无水乙醇的氢氧化钾(460mg,7.9mmol)，0度下不断搅拌。室温下继续搅拌2h，室温下蒸发溶剂。用50ml乙醚稀释残留物。过滤未溶解的残渣，集中干燥溶剂呈固态物。为酸化该固态物，加入5％khso4，产生的混合物用ea(30ml×3)萃取。用水和盐水洗涤有机层，并na2so4风干。溶剂被蒸发留下复合物5为淡黄色油状物(1.0g,80％)。
5)无水肼(320mg,100mmol)室温下加入溶于60ml甲醇的复合物6(3.08g,10mmol)，室温下搅拌16h。蒸发去除过量的肼和溶剂，用乙醇和乙醚洗涤残留物，收集白色固体复合物7(2.1g,68％)。
6)在-10℃下将2-溴乙酰胺(1.16g,8.44mmol)边搅拌边逐滴加入复合物7(2g,6.49mmol)和溶于二甲基甲酰胺的nmm(0.85g,8.44mmol)，在-10℃下继续搅拌30min，室温下继续反应36h。二甲基甲酰胺挥发，残留物用硅胶柱纯化，1:9meoh/ch2cl2作为洗脱液。收集复合物8(2.0g,85％)为黄色固体。
7)复合物8(500mg,1.37mmol)加入复合物5(329mg,2.05mmol)，eci(520mg,2.74mmol)和溶于30ml二甲基甲酰胺的hobt(373mg,2.74mmol)。室温下搅拌复合物过夜。混合物用100mlea稀释，用水(100ml×4)和浓盐水(100ml)洗涤，并用na2so4干燥。去除溶剂，用制备型hplc纯化残留物得复合物9，呈白色固体(249mg,36％)，得到aep小分子抑制剂。
8)质子和碳核磁共振谱用500mhz的分光仪记录。nmr化学位移用δ(ppm)表示，用dmso(1hnmr)δ2.50信号和dmso(13cnmr)δ39.5信号作为内参，用lcmsmsd(hewlettpackard,paloalto,ca,usa)的esi模式测量质谱。按以下步骤鉴定：1hnmr(500mhzdmso)δ10.76(1h,br),8.19(1h,br),7.54(1h,s),7.33(6h,m),5,01(2h,q,j＝12.5hz),4.16(6h,m),3.60(2h,m),2.00(9h,m)；13cnmr(125mhzdmso)δ172.5,172.4,168.4,166.7,155.6,137.0,128.3,127.8(x2),72.4,65.4,61.5,51.5,51.1,49.7,17.9,17.0,13.8,ms(esi,m/e):508.1(m+1)+；在214nm和254nm下测hplc纯度:100％。