本发明属于植物保护领域，涉及一种辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法及其应用。
背景技术：
温带为黄瓜花叶病毒病(cmv)的主要分布地区，热带地区呈现逐年加重的趋势。目前为止，cmv的寄主范围超过100个科1200种植物，对多种蔬菜作物和观赏植物的危害尤为严重。cmv主要是通过多种蚜虫以非持续方式传播，部分植物可种子传毒。广泛的寄主范围，蚜虫传毒和作物品种更替频率小等原因使得cmv可周年存活，导致其难以防治。我国辣椒主产区cmv检测率很高，北京、陕西、湖广以及江浙地区的检出率均在50％以上。
cmv侵染辣椒后表现为渐进的发病过程。发病早期幼嫩的叶片基部黄化，然后黄化症状逐渐扩展到整个叶片；随后新生叶片表现出明显的花叶；随着植株发育，叶片出现严重皱缩，植株矮化，叶色表现为无光泽的深绿色。辣椒感染cmv症状的严重程度取决于感染时的株龄，一般幼苗期感染cmv会造成秃顶、矮化并减产，严重时可造成绝收；而成株感染cmv后的症状相对较轻。
抗病性鉴定是抗病材料筛选、抗性遗传规律研究和抗病品种选育的基础，其关键在于能够准确反映材料的抗性水平。辣椒抗cmv鉴定大多采用人工接种鉴定的方法。目前cmv人工接种方法包括手指摩擦接种、磨砂玻匙接种、喷枪接种和病毒汁液浸沾接种。前3种方法在接种前需在叶表喷撒一薄层600目(直径大约为23μm)的金刚砂，接种30min后将多余的接种物清洗掉。手指摩擦接种和磨砂玻匙接种容易操作，但是接种不均匀。喷枪接种所用的喷枪为油漆喷枪，接种时喷枪距幼苗2cm左右，空气压缩机的工作压力为2.1～2.5kg·cm，喷枪接种适用于大量材料的抗性鉴定，存在接种不均匀和漏接的问题。在我国该种方法在辣椒抗cmv材料筛选中有部分应用。病毒汁液浸根法是指将幼苗根部的泥土洗净，浸入接种液中，该方法的接种效果最好，但是工作量大，不易操作，使用不多。针对以上接种方法中存在的问题，建立一种新的、更为有效的辣椒抗cmv接种方法势在必行。
技术实现要素：
本发明的目的在于：针对目前我国辣椒抗cmv苗期鉴定方法中存在的问题，提供一种新的、更为有效和完善的苗期接种方法及其应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法，包括如下步骤：
(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟(nicotianatabaccumcvssamunnn)上人工注射接种，接种后12～15天采收病叶；将病叶加入磷酸缓冲液冰浴匀浆，过滤或离心，其滤液或上清液即为接种液；
(2)辣椒种子消毒后人工培养至幼苗2片真叶完全展开时即可接种；
(3)用1ml无菌注射器吸取1ml菌液，用针头在子叶上扎出2个针孔，去掉针头，在子叶背面针孔处将接种液缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液，接种后，昼夜温度保持在25℃，幼苗正常生长管理。
其中，所述的磷酸缓冲液优选为ph值为7的0.02mol·l-1的磷酸缓冲液；每克病叶加入5ml所述的磷酸缓冲液进行冰浴匀浆。
所述的过滤方法优选双层纱布过滤；所述的离心的条件为3500转·分-1离心15分钟。
辣椒种子在5％的次氯酸钠中消毒20分钟后，用无菌水冲洗3-4次。
人工培养辣椒种子的方法优选为：辣椒种子消毒后在培养皿中于25℃黑暗条件下萌发，种子萌发后播种于8×8的营养钵中生长，生长期温度为昼25摄氏度/夜20℃，幼苗2片真叶完全展开时即可接种。
本发明所述的方法在快速鉴定和筛选辣椒资源中具有黄瓜花叶病毒病抗性的种质资源中的应用。
所述的应用优选按照所述的辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法接种辣椒幼苗，接种14天后对辣椒幼苗进行病情调查。
所述的应用进一步优选，优选依据我国“八五”辣椒抗病育种攻关组制定的分级标准对病情进行分级，0级-无任何症状；1级-心叶明脉或接种叶急性小枯斑；3级-系统花叶或茎上产生坏死斑点；5级-系统重花叶、畸形或茎上产生坏死条斑；7级-多数叶片畸形、蕨叶、植株矮化或茎、枝和叶脉系统坏死；9级-植株严重矮化，停止生长或严重系统坏死，至全株死亡；病情指数＝∑(病情级别×该级株数)/(调查总株数×9)]×100。材料或群体抗病性划分标准为：免疫(i)：di＝0；高抗(hr)：0﹤di≦5；抗病(r)：5﹤di≦20；中抗(mr)：20﹤di≦40；感病(s)：di﹥40。
一种辣椒抗cmv苗期接种鉴定方法，包括以下步骤：
(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟(nicotianatabaccumcvssamunnn)上人工注射接种，接种后12～15天采收病叶，每1g病叶加入5mlph值为7的0.02mol·l-1的磷酸缓冲液冰浴匀浆，双层纱布过滤或3500转·分-1离心15分钟，其滤液或上清液即为接种液；
(2)辣椒种子在5％的次氯酸钠中消毒20分钟后，用无菌水冲洗3-4次；
(3)辣椒种子消毒后在培养皿中于25℃黑暗条件下萌发，种子萌发后播种于8×8的营养钵中生长，生长期温度为昼25℃/夜20℃，幼苗2片真叶完全展开时即可接种；
(4)用一次性注射器吸取1ml菌液，用针头在子叶上扎出2个针孔，去掉针头，在子叶背面针孔处将接种液缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液。接种后，昼夜温度保持在25℃，幼苗正常生长管理；
(5)接种14天后对辣椒幼苗进行病情调查，依据我国“八五”辣椒抗病育种攻关组制定的分级标准进行分级，计算病情指数；分级标准为：0级-无任何症状；1级-心叶明脉或接种叶急性小枯斑；3级-系统花叶或茎上产生坏死斑点；5级-系统重花叶、畸形或茎上产生坏死条斑；7级-多数叶片畸形、蕨叶、植株矮化或茎、枝和叶脉系统坏死；9级-植株严重矮化，停止生长或严重系统坏死，至全株死亡。
所述的病情指数计算方法优选为：病情指数＝∑(病情级别×该级株数)/(调查总株数×9)]×100。材料或群体抗病性划分标准为：免疫(i)：di＝0；高抗(hr)：0﹤di≦5；抗病(r)：5﹤di≦20；中抗(mr)：20﹤di≦40；感病(s)：di﹥40。
有益效果本发明的优点在于：相对于目前常用接种方法，该方法不需要喷洒金钢砂，减少了操作步骤，直接针头注射，易于控制病毒接种量且对叶片损伤较小，接种液可直接注射到叶肉细胞，易于观察，减少漏接。本发明对研究室现有的部分辣椒种质资源进行鉴定取得了满意结果。表明该方法可以用于快速筛选我国辣椒资源中具有抗cmv的辣椒种质资源进行鉴定，拓宽辣椒抗cmv的资源利用。
具体实施方式
实施例1
(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟(nicotianatabaccumcvssamunnn)上繁殖，人工注射接种，接种后12～15天采收病叶。每1g病叶加入5mlph值为7的0.02mol·l-1的磷酸缓冲液冰浴匀浆，双层纱布过滤或3500转·分-1离心15分钟，其滤液或上清液即为接种液；
(2)辣椒种子在5％的次氯酸钠中消毒20分钟后，用无菌水冲洗3-4次；
(3)辣椒种子消毒后在培养皿中于25℃黑暗条件下萌发，种子萌发后播种于8×8的营养钵中生长，生长期温度为昼25摄氏度/夜20℃，幼苗2片真叶完全展开时即可接种。
(4)用一次性注射器(1ml)吸取1ml菌液，去掉针头，将菌液在辣椒子叶的背面缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液。接种后，昼夜温度保持在25℃，幼苗正常生长管理。
(5)接种14天后对辣椒幼苗进行病情调查。主要是依据我国“八五”辣椒抗病育种攻关组制定的分级标准，0级-无任何症状；1级-心叶明脉或接种叶急性小枯斑；3级-系统花叶或茎上产生坏死斑点；5级-系统重花叶、畸形或茎上产生坏死条斑；7级-多数叶片畸形、蕨叶、植株矮化或茎、枝和叶脉系统坏死；9级-植株严重矮化，停止生长或严重系统坏死，至全株死亡。病情指数＝∑(病情级别×该级株数)/(调查总株数×9)]×100。品种群体抗病性划分标准为：免疫(i)：di＝0；高抗(hr)：0﹤di≦5；抗病(r)：5﹤di≦20；中抗(mr)：20﹤di≦40；感病(s)：di﹥40。鉴定试验设三次重复，每处理10株。试验材料以易感病材料c.annumng29和抗病材料c.frutescenspbc688(g.j.guo，s.b.wang，j.b.liuetal，rapididentificationandcharacterizationofqtlsunderlyingresistancetocucumbermosaicvirusinpepper(capsicumfrutescens).theorapplgenet,2016，130,1:41-52.)作为对照品种。
依据病害程度调查结果，按照病害分级和病情指数对辣椒资源进行评价。
如本试验中，部分材料鉴定结果如表1，在鉴定的140份辣椒材料中，15份材料病情指数介于5-20，属于抗性材料；47份材料的病情指数介于20-40，属于中抗材料；78份材料的病情指数大于40，属于感病材料；未发现对cmv免疫和高抗的辣椒资源，说明在辣椒抗cmv研究中需要进一步扩大种质资源筛选范围，为辣椒抗cmv研究提供材料基础。
表1辣椒种质资源抗cmv鉴定结果