本发明涉及药物合成技术领域，尤其涉及一种氨基取代的二苯乙烯衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
二苯乙烯类化合物通常是指含有两个苯环间由一个乙烯基相连接的二苯乙烯母体结构的化合物，其多种活性的不断发现及应用范围的不断拓展，已经引起了国内外有机合成研究人员的高度重视。
Combretastatin A-4(CA-4)是由Pettit等从南非灌木柳树皮combretumcaffrum中分离得到的一种二苯乙烯类化合物，它能够特异性地识别和破坏肿瘤血管，以致肿瘤细胞得不到足够的养分而“饿死”。通过作用于秋水仙碱结合位点，CA-4能够抑制微管蛋白的聚合从而阻止肿瘤血液流动。然而由于CA-4及其衍生物目前还存在许多缺陷，比如水溶性差、顺式结构不稳定、反式结构没有活性等，使其在临床试验中受到很大阻碍。所以，长久以来围绕CA-4类似物的结构改造做了大量的研究工作。多数情况下，在对CA-4结构改造中，往往只保留A环部分，对连接桥和B环进行改造。
近年来，含氟药物在临床治疗药物中占有很大的比重，在小分子药物中引入氟原子或含氟基团，是改善药物活性的重要策略之一。氟原子具有最大的元素电负性和与氢原子相近的原子半径，在小分子药物中引入氟原子或含氟基团后，对其分子体积几乎没有影响，但是对其理化性质包括电子效应和立体效应、生物活性、药代动力学性质、代谢稳定性和配体与靶标蛋白的相互作用力以及选择性等可能产生显著影响，而且还可以增强小分子的亲脂性，使其更容易透过细胞膜，进而提高生物活性。之前对于CA-4类似物的研究很多，但是对于氨基取代CA-4衍生物未见报道。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种氨基取代的二苯乙烯衍生物及其制备方法和应用。
本发明的技术方案具体介绍如下。
本发明提供一种氨基取代的二苯乙烯衍生物，其结构如通式(I)所示：
其中：R1、R2和R3独立的选自-OH、-OMe或-F中任一种，R4选自-OMe,-Me,-F,-OCF2H,-CF2CH3,-CHFCH3,或CF3中任一种。
本发明中，R4为-CF2CH3,-CHFCH3或-CF3中任一种。
本发明中，其结构为E型。
本发明还提供一种上述的二苯乙烯衍生物的制备方法，当R1、R2和R3中一个以上为-OH时，其合成路线如下：
具体步骤如下：
(1)当R1、R2和R3中一个以上为-OH时，首先将中的羟基用叔丁基二甲基氯硅烷保护，获得相应的TBS羟基保护产物；
(2)将TBS羟基保护产物和三苯基磷叶立德进行wittig反应，得到带有硝基和TBS的二苯乙烯类化合物；
(3)将带有硝基和TBS的二苯乙烯类化合物还原，得到相应的氨基取代的二苯乙烯衍生物。
上述制备方法中，R1、R2和R3均不为-OH时，省略羟基用叔丁基二甲基氯硅烷保护的步骤；直接将发生wittig反应。
本发明进一步提供一种上述氨基取代的二苯乙烯衍生物在制备微管蛋白聚集抑制剂中的应用。
本发明进一步提供一种上述氨基取代的二苯乙烯衍生物在制备微管蛋白聚集抑制剂中的应用。
本发明进一步提供氨基取代的二苯乙烯衍生物在制备作为抗肿瘤血管破坏剂，对各种肿瘤具有血管靶向作用的药物中的应用；所述各种肿瘤主要包括有：肺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠癌、卵巢癌、膀胧癌、子宫颈癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓状癌、支气管癌、骨细胞癌、上皮癌、胆管癌、绒毛膜癌、胚癌、精原细胞癌、维尔姆斯癌、胶质细胞癌、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血细胞瘤、声带神经瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、成纤维细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、纤维软骨瘤、纤维囊瘤、纤维粘液瘤、纤维骨瘤、纤维粘液肉瘤、纤维乳头状瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液软骨瘤、粘液软骨肉瘤、粘液软骨纤维肉瘤、粘液腺瘤、成粘液细胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂细胞瘤、脂肪软骨瘤、脂肪纤维瘤、脂肪血管瘤、粘液脂瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、软骨肌瘤、脊索瘤、绒毛膜腺瘤、绒毛上皮瘤、成绒毛膜细胞瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、骨软骨纤维瘤、骨软骨肉瘤、骨软骨瘤、骨囊瘤、骨牙质瘤、骨纤维瘤、骨纤维肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管软骨瘤、成血管细胞瘤、血管角质瘤、血管神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神经瘤、血管粘液瘤、血管网状内皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉芽瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纤维瘤、淋巴细胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴细胞瘤、内皮瘤、成内皮细胞瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、结缔组织瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纤维瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌粘液瘤、急性淋巴白血病、急性骨髓性白血病、慢性病细胞、红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
本发明进一步提供一种上述的氨基取代的二苯乙烯衍生物在制备治疗非正常新生血管引起的疾病的药物中的应用；所述疾病主要包括有：风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、早熟视网膜病、视网膜静脉闭塞、牛皮癣、红斑痤疮、卡波济肉瘤、特异性反应性角膜炎、流行性角膜结膜炎、新生血管性青光眼、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疤疹感染、带状疤疹感染、原生动物感染、分支杆菌感染、多动脉炎、肉样瘤、巩膜炎、潮红、口干眼燥关节炎综合症、全身性红斑狼疮、艾滋病综合症、梅毒。
本发明中，其药物制剂的剂型为静脉注射形式给药的冻干粉剂、粉剂、注射剂、脂质体、乳剂、微囊、悬浮液或溶液；口服形式给药的颗粒剂、片剂、胶囊或糖浆；或是栓剂。
本发明的有益效果在于，本发明的氨基取代的CA-4类似物对多数肿瘤细胞具有较强的抗肿瘤活性。且E型结构的抗肿瘤活性比Z型结构的好；制备方法简单。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细介绍。
实施例1 3,4,5-三甲氧基-2’-氨基-4’-(1,1-二氟乙基)二苯乙烯的制备
在氮气保护下，在装有温度计并干燥过的100mL三口烧瓶中，加入溴化2-硝基-4-(1,1-二氟乙基)亚甲基三苯基膦3.03g(5.6mmol)和24mL的无水四氢呋喃。将其放入到事先冷却至的-40℃的冷却循环装置中，待瓶内温度冷却到-40℃后，慢慢滴入2.5mL正丁基锂四氢呋喃溶液(2.5M)，滴加完后仍保持-40℃继续搅拌1小时。然后再缓慢滴入3,4,5-三甲氧基苯甲醛1g(5.1mmol)的四氢呋喃溶液(10mL)，约10分钟滴完，然后将反应装置从冷却循环装置中取出自然缓慢升温至室温，继续反应2小时。关闭搅拌装置，加入20mL水，然后再加入30mL乙酸乙酯，分出乙酸乙酯层，水层用乙酸乙酯20mL×2萃取；合并乙酸乙酯层，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂得到黄色液体,该液体用乙酸乙酯溶解后，经快速柱层析仪层析分离，最后得到黄色油状物Z式异构体和黄色晶体E式异构体。然后分别将其与锌粉0.95g(14.52mmol)，冰醋酸(13mL)混合至单口烧瓶中，室温搅拌，反应2小时，反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液10mL，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，浓缩，经快速柱层析仪层析分离得到红色油状物Z式异构体A1-1 0.80g HRMS-ESI(m/z):350.3778(M+H)+,found:350.3662(M+H)+；红色固体E式异构体A1-2 0.8g HRMS-ESI(m/z):350.3778(M+H)+,found:350.3662(M+H)+，还原反应产率97％，Z/E之比为1:1。
实施例2 4,5-二甲氧基-3-羟基-2’-氨基-4’-(1,1-二氟乙基)二苯乙烯的制备
按实施例1进行，用叔丁基二甲基氯硅烷保护过的4,5-二甲氧基-3-羟基苯甲醛1.5g(5.1mmol)四氢呋喃溶液(10mL)代替3,4,5-三甲氧基苯甲醛。经快速柱层析仪层析分离，分别得到有叔丁基二甲基氯硅烷保护的黄色油状Z式(1.1g)和黄色晶体E式(1.08g)异构体。然后分别将其溶于四氢呋喃3.5mL中，分别加入四丁基氟化胺的四氢呋喃溶液3.5mL(1M)，室温下搅拌5分钟左右反应结束后，直接减压蒸馏经快速柱层析仪层析分离分别得到淡黄色油状物Z式异构体。然后分别将其与锌粉0.95g(14.52mmol)，冰醋酸(13mL)混合至单口烧瓶中，室温搅拌，反应2小时，反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液10mL，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，浓缩，经经快速柱层析仪层析分离得到淡黄色液体Z式异构体A2-1 530mg HRMS-ESI(m/z):336.3508(M+H)+,found:336.3483(M+H)+；淡黄色固体E式异构体A2-2 530mg HRMS-ESI(m/z):336.3508(M+H)+,found:336.3483(M+H)+；还原反应产率93％，Z/E之比约为1:1。
实施例3 3,5-二羟基-4-甲氧基-2’-氨基-4’-(1,1-二氟乙基)二苯乙烯的制备
按实施例1进行，用叔丁基二甲基氯硅烷保护过的3,5-二羟基-5-甲氧基苯甲醛2.0g(5.1mmol)四氢呋喃溶液(10mL)代替3,4,5-三甲氧基苯甲醛。经快速柱层析仪层析分离，得到有叔丁基二甲基氯硅烷保护的黄色油状Z式和E式异构体共(2.1g)。然后将其溶于四氢呋喃7.2mL中，分别加入四丁基氟化胺的四氢呋喃溶液7.2mL(1M)，室温下搅拌5分钟左右反应结束后，直接减压蒸馏经快速柱层析仪层析分离得到黄色油状物Z式异构体和黄色固体E式异构体。然后分别将其与锌粉0.95g(14.52mmol)，冰醋酸(13mL)混合至单口烧瓶中，室温搅拌，反应2小时，反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液10mL，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，浓缩，经经快速柱层析仪层析分离得到淡黄色液体Z式异构体A3-1 650mg HRMS-ESI(m/z):322.3238(M+H)+,found:322.3152(M+H)+；E式异构体A3-2 256mg HRMS-ESI(m/z):322.3238(M+H)+,found:322.3152(M+H)+；还原反应产率89％，Z/E之比为2.5:1。
实施例4 3,5-二甲氧基-4-羟基-2’-氨基-4’-(1,1-二氟乙基)二苯乙烯的制备
按实施例1进行，用叔丁基二甲基氯硅烷保护过的3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛1.0g(3.38mmol)四氢呋喃溶液(8mL)代替3,4,5-三甲氧基苯甲醛。经快速柱层析仪层析分离，分别得到有叔丁基二甲基氯硅烷保护的黄色油状Z式(780mg)和黄色晶体E式(570mg)异构体。然后分别将其溶于四氢呋喃2.5mL中，分别加入四丁基氟化胺的四氢呋喃溶液2.5mL(1M)，室温下搅拌5分钟左右反应结束后，直接减压蒸馏经快速柱层析仪层析分离分别得到淡黄色油状物Z式异构体和橘黄色固体E式异构体。然后分别将其与锌粉0.95g(14.52mmol)，冰醋酸(13mL)混合至单口烧瓶中，室温搅拌，反应2小时，反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液10mL，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，浓缩，经经快速柱层析仪层析分离得到淡黄色液体Z式异构体A4-1 567mg HRMS-ESI(m/z):336.3508(M+H)+,found:336.3473(M+H)+；橘黄色固体E式异构体A4-2560mg HRMS-ESI(m/z):336.3508(M+H)+,found:336.3473(M+H)+；还原反应产率88％，Z/E之比约为1:1。
实施例5 3,5-二甲氧基-4-氟-2’-,氨基-4’-(1,1-二氟乙基)二苯乙烯的制备
按实施例1进行，用3,5-二甲氧基-4-氟苯甲醛1.0g(5.43mmol)四氢呋喃溶液(8mL)代替3,4,5-三甲氧基苯甲醛。经快速柱层析仪层析分离，分别得到有直接减压蒸馏经快速柱层析仪层析分离分别得到浅黄色油状物Z式异构体和黄色固体E式异构体。然后分别将其与锌粉0.95g(14.52mmol)，冰醋酸(13mL)混合至单口烧瓶中，室温搅拌，反应2小时，反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液10mL，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，浓缩，经快速柱层析仪层析分离得到淡黄色液体Z式异构体A5-1 463mg HRMS-ESI(m/z):338.3422(M+H)+,found:338.3372(M+H)+；淡黄色液体E式异构体A5-2 463mgHRMS-ESI(m/z):338.3422(M+H)+,found:338.3372(M+H)+，还原反应产率86％，Z/E之比约为1:1。
实施例6 3,4-二甲氧基-5-氟-2’-氨基-4’-(1,1-二氟乙基)二苯乙烯的制备
按实施例1进行，用3,4-二甲氧基-5-氟苯甲醛1.0g(5.43mmol)四氢呋喃溶液(8mL)代替3,4,5-三甲氧基苯甲醛。经快速柱层析仪层析分离，分别得到有直接减压蒸馏经快速柱层析仪层析分离分别得到浅黄色油状物Z式异构体和黄色固体E式异构体。然后分别将其与锌粉0.95g(14.52mmol)，冰醋酸(13mL)混合至单口烧瓶中，室温搅拌，反应2小时，反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液10mL，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，浓缩，经快速柱层析仪层析分离得到A6-1 487mg HRMS-ESI(m/z):338.3422(M+H)+,found:338.3372(M+H)+；黄色固体E式异构体A6-2 487mg HRMS-ESI(m/z):338.3422(M+H)+,found:338.3372(M+H)+，还原反应产率86％，Z/E之比约为1:1。
应用实施例1：CCK-8法测试化合物对多种肿瘤细胞的抗肿瘤活性
1、试验方法
取活细胞比例达90％以上的细胞进行实验。细胞增殖抑制试验采用EnoGeneCellTMCounting Kit-8(CCK-8)细胞活力检测试剂盒。细胞消化、计数、制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔1×104个细胞)；96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；每孔加入100μL相应的含药物的培养基，同时设阴性对照组，溶媒对照组，阳性对照组，每组5复孔；96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养72h后；每孔加入10μL CCK-8溶液,将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的OD值，计算目标化合物对人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、人胃癌细胞MGC-803、人宫颈癌细胞Hela等细胞的抑制率及IC50值。
2、试验结果
表1部分实施例化合物对多种肿瘤细胞株的体外抗肿瘤活性评价(CKK-8法)
体外培养肿瘤细胞的抗肿瘤活性评价，结果表明CA-4含氟类似物对HepG肝癌细胞株具有广泛的抑制活性，并且这些化合物的活性数值与对照药CA-4的活性数值相差不大，尤其化合物A4-2的IC50值为3.901μmol/mL小于CA-4的IC50值(16.04μmol/L)，说明在CA-4结构B环中引入两个氟原子有效地改善了化合物的抗肿瘤活性。通过分析这些CA-4类似物的活性可以发现，反式化合物有较好活性。而在对人胃癌细胞MGC803细胞株的抑制中，化合物A6-1的IC50值为0.9834μmol/mL，化合物A5-1的IC50值为3.289μmol/mL，化合物A4-2的IC50值为7.831μmol/mL以及化合物A2-2的IC50值为4.954μmol/mL均表现出与CA-4相当的活性，CA-4的IC50值为1.757μmol/mL。
此外，化合物A6-1对人宫颈癌Hela细胞株也具有较强的抑制活性，其对Hela的IC50值为8.641μmol/mL，相较于CA-4的IC50值11.33μmol/mL相差不大。其他的化合物对于人胃癌细胞MKN45、人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT-116也具有较强的抑制活性，显示出广谱的抗肿瘤活性，特别地，化合物A6-1对人宫颈癌细胞Hela、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HCT-116、人胃癌细胞MKN45、人胃癌细胞MGC803存在较强的抗肿瘤活性。
应用实施例2部分实施例化合物抗氧化能力测试
实验使用的主要仪器和试剂是美国MD SpectraMax M3多功能酶标仪，DPPH(Sigma)；槲皮素(Sigma)。
1.实验步骤：
化合物对DPPH的清除作用采用比色法检测，即使用96孔酶标板在酶标仪上测定。化合物先用少许DMSO溶解，再用甲醇溶液进行稀释，使其终浓度为50μg/mL、5μg/mL和0.5μg/mL，样品孔中加入甲醇溶液(185μL)，每孔25μL，加入DPPH甲醇液(40μL),37℃，30min后于517nm波长下比色测定。空白孔中注入相同体积的甲醇溶液。溶剂对照孔中注入与化合物相等浓度的甲醇。化合物抑制率由样品OD值对于空白和对照OD值计算。其中化合物对超氧阴离子的半抑制浓度(IC50)由剂量效应曲线得到。
Inhibition(％)＝[(Asolvent-control-Asample)/(Asolvent-control-Ablank)]×100
数据统计：每一个样品的每一个浓度梯度平行测定3次，然后求平均值，标准差。
结果判断：以抑制率大于70％为阳性。
质量控制：用槲皮素作为阳性比对，用来进行质量控制。
2.试验结果
表1部分实施例化合物抗氧化活性评价
我们通过比较化合物的抗肿瘤活性数据和抗氧化活性数据，发现抗肿瘤活性与抗氧化活性之间存在一定的相关性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。