DNASE2作为帕金森症诊断标志物的用途的制作方法

本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于帕金森症诊断的分子标志物，具体涉及血液中的分子标志物-dnase2基因在制备诊断帕金森症的产品中的应用。
背景技术：
：pd是继阿尔兹海默病后的第二大常见的、缓慢发生的、与年龄相关的神经退行性疾病，又名震颤麻搏。病理上中脑黑质多巴胺能神经元(dopaminergicneurons,dns)选择性丧失、残存神经元中路易小体化(lewybody,lb)形成和纹状体多巴胺含量明显减少，导致了静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常这4个主要的临床症状(braakh,tredicikd，etal.stagingofbrainpathologyrelatedtosporadicparkinson,sdisease.neurobiologyofaging,2003,24(2)：197-211)。在工业化国家，pd患者占总人口的化3％，占60岁以上人口的1％，全世界每年每100000人中新増8-18例pd患者(delaulm,bretelermm.epidemiologyofparkinson’sdisease.thelancetneurology,2006,5(6):525-535)。stephen(ks.incidenceofparkinson’sdisease:variationbyage,gender,andrace/ethnicity,2003:157,1015-1022)研究了pd发生率与年龄、性别和种族的关系，发现在60岁以上发病率会快速増加，而50岁以下的病例只占4％；男性患者是女性患者的1.9倍；不同种族pd的发生率则是变化的，总的来说白人pd发生率比亚洲人高，黑人则是最低。目前除了spect或者pet影像方法具有部分辅助诊断作用外，帕金森病统一评分量表(unifiedpakinson’sdiseaseratingscale,updrs)和改良的hoehn和yahr帕金森病分期量表(h-y分期)是pd临床诊断和治疗评估的常用方法。一般来说，排除如脑外伤、脑血管疾病、金属中毒等可引起继发性帕金森病的病因，也没有眼外肌麻痹、小脑征、锥体系损害以及肌萎缩等体征下，根据英国脑库的帕金森病诊断标准，患者有少动，再加上静止性震颤、肌强直、姿势步态异常三种症状中的一种，即可诊断为pd。此外，尿和脑脊液中多巴胺及其代谢产物降低，对药物左旋多巴的反应良好也有助于区分pd和其他神经退行性疾病。事实上多巴胺能神经元变性缺失50％-70％以上方出现临床症状，这往往使患者错失了早期诊断、早期治疗的机会，所以极需方便有效的生物标志物能帮助pd早期诊断并提高诊断的正确性。神经退行性疾病，包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、和肌萎缩性脊髓侧索硬化症等，它们共同的特征是在中枢神经系统的不同部位有异常蛋白的存储和特发性神经元丢失(rossca，poirierma.proteinaggregationandneurodegenerativedisease.natmed，2004,10suppl：s10-s17)从而导致了运动和认知等功能障碍。神经退行性疾病因为病理改变发生在脑部，脑组织取得都是在死后剖尸所得，所以病理机制研究进展缓慢。总的来说，神经退行性疾病是各种基因和环境共同影响的结果。基因表达调控网络系统在癌症研究领域取得引人注目的进展，在许多肿瘤组织中如肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌等，某些基因的表达水平与其来源正常组织存在稳定而明显的差异。不同组织来源的肿瘤，甚至同一组织来源不同分化状态的加瘤，基因表达谱都不尽相同，表明基因表达具有明显的组织特异性和发育阶段特异性。因为神经退行性疾病病理上的直接特征是疾病特异性蛋白质的过量表达，所以推测特异性基因的异常改变了功能蛋白的表达水平，从而引起了疾病。现已越来越多的研究发现特异基因能够成为诊断帕金森的生物标志物，如以下申请号的专利公开的：201510713527.3、201510464905.9、201510463593.x、201510463617.1、201510809837.5。大部分疾病都是多基因调控的疾病，为了提高疾病的诊断准确率，将大量基因联合诊断成为必然，因此需要发掘更多与帕金森病相关的分子比标志物以便临床应用。技术实现要素：为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于帕金森症早期诊断的分子标志物。相比传统的帕金森症的诊断方法，使用基因标志物来诊断帕金森症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了检测dnase2基因表达的产品在制备诊断帕金森症的工具中的应用。进一步，上面所提到的检测dnase2基因表达的产品包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测dnase2基因表达水平以诊断帕金森症的产品。进一步，所述用rt-pcr诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增dnase2基因的引物；所述用实时定量pcr诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增dnase2基因的引物；所述用免疫检测诊断帕金森症的产品包括：与dnase2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断帕金森症的产品包括：与dnase2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断帕金森症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与dnase2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与dnase2基因的核酸序列杂交的探针。在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量pcr诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增dnase2基因的引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测dnase2基因表达的产品可以应用于该平台实现对dnase2基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知dnase2基因的异常与帕金森症相关也属于dnase2基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。本发明还提供了一种诊断帕金森症的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测dnase2基因转录水平的针对dnase2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的dnase2蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括dnase2基因在内的多个基因(例如，与帕金森症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括dnase2蛋白在内的多个蛋白质(例如与帕金森症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与帕金森症的标志物同时检测，可大大提高帕金森症诊断的准确率。其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测dnase2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括dnase2蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测dnase2基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对dnase2基因的引物和/或探针。根据dnase2基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测dnase2基因表达水平的引物和探针。与dnase2基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。所述高通量测序平台包括检测dnase2基因表达水平的试剂。所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测dnase2基因的转录水平。进一步，所述dnase2蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述dnase2蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与dnase2蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。在本发明的具体实施方案中，所述针对dnase2基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物如seqidno.2所示。用于诊断帕金森症的dnase2基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组dna的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断帕金森症的dnase2基因及其表达产物的来源是血液。在本发明的上下文中，“dnase2基因”包括dnase2基因以及dnase2基因的任何功能等同物的多核苷酸。dnase2基因(chromosome19,nc_000019.10(12875211..12881521,complement))序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。在本发明的上下文中，dnase2基因表达产物包括dnase2蛋白以及dnase2蛋白的部分肽。所述dnase2蛋白的部分肽含有与帕金森症相关的功能域。“dnase2蛋白”包括dnase2蛋白以及dnase2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括dnase2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与dnase2的dna杂交的dna所编码的蛋白质。通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是dnase2蛋白的融合蛋白。对于与dnase2蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留dnase2蛋白的生物学活性即可。在本发明的上下文中，“诊断帕金森症”既包括判断受试者是否已经患有帕金森症、也包括判断受试者是否存在患有帕金森症的风险。本发明的优点和有益效果：本发明首次发现了dnase2基因表达与帕金森症相关，通过检测受试者中dnase2的表达，可以判断受试者是否患有帕金森症、或者判断受试者是否存在患有帕金森症的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。本发明发现了一种新的分子标记物-dnase2基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现帕金森症的早期诊断，从而降低帕金森症的死亡率。附图说明图1显示利用基因芯片检测dnase2基因在帕金森症患者和正常人中的表达差异；图2显示利用qpcr检测dnase2基因在帕金森症患者和正常人中的表达差异。具体的实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1筛选帕金森症患者和正常人中差异表达的基因1、研究对象：收集原发性pd患者10例，男5例，女5例，年龄32-85岁，病程5个月-20年。pd入组标准：诊断标准均符合pd临床诊断标准(参考“蒋雨平，王坚，丁正同，等，原发性帕金森病的诊断标准，2005，中国临床神经科学，2006，14:40”)。排除标准：(1)特发性震颤；(2)继发性帕金森综合征；(3)严重痴呆、构音障碍者；(4)患有其他精神疾患者。此项研究己通过医院伦理委员会批准且所有患者签署知情同意书。正常组：选取年龄32-80岁的健康志愿者10例，男女各5例。两组之间年龄、性别差异无统计学意义(p>0.10)，具有可比性。2、血液中总rna的提取(1)匀浆处理(homogenization)直接取新鲜的血液(外周血)，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mltrizol。(2)分层(phaseseparation)a.样品加入trizol后，室温放置5min，使样品充分裂解。b.每1mltrizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。(3)rna沉淀(rnaprecipitation)a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，rna沉淀于管底。(4)rna漂洗(rnawash)a.rna沉淀中加入1ml75％乙醇(用rnase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mltrizol加入1ml75％乙醇。b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。(5)溶解rna(redissolvingtherna)沉淀中加入50-100μlrnase-free水，轻弹管壁，以充分溶解rna，-70℃保存。3、rna质量和纯度检测rna质量：通过rna完整性来表示，可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1.2％胶；0.5×tbe电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。rna纯度：od260/od280比值是衡量rna样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的rna样品，od260/od280值(10mmtris,ph7.5)在2.0左右。4、基因芯片杂交及扫描总rna经线性化扩增后，cy3-utp标记，荧光标记后的crnas采用rneasyminikit纯化，用amhion的rnafragmentationreagents对标记好的crnas进行片段化处理。采用美国agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x44k基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用agilentdnamicroarrayscanner扫描仪扫描。5、芯片数据处理与分析杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。6、统计学处理采用spss13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，p<0.05差异有显著性意义。7、结果结果显示(如图1所示)，与正常人相比，帕金森症患者血液中dnase2基因的mrna水平显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。实施例2qpcr实验验证帕金森症患者和正常人中差异表达的基因1、研究对象：筛选标准同实施例1，帕金森症患者和正常人各50例。2、血液中总rna的提取步骤同实施例1。3、逆转录用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。4、qpcr(1)引物设计根据genbank中dnase2基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：dnase2基因：正向引物为5’-cagcatcacactcacatc-3’(seqidno.1)；反向引物为5’-agtacaggtcatctccaa-3’(seqidno.2)，gapdh基因：正向引物为5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)；反向引物为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。(2)按照表1配制pcr反应体系：其中，sybrgreen聚合酶链式反应体系购自invitrogen公司。表1pcr反应体系试剂体积正向引物1μl反向引物1μlsybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl模板2μl去离子水补足25μl(3)pcr反应条件：95℃10min，(95℃10s，60℃40s)*45个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。5、统计学方法结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。6、结果结果如图2所示，与正常人相比，帕金森症患者血液中dnase2基因的mrna水平显著增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，结果同基因芯片实验。实施例3免疫印迹实验验证帕金森症患者和正常人中差异表达基因的表达产物1、临床对象：同实施例2。2、单核细胞分离帕金森症患者和正常人取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的hbss(nacl8.0g，na2hpo40.132g，kh2po40.06g，kcl0.4g，酚红1ml，nahco30.35g，d-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的hbss洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％nacl溶液，2000r/min离心，去上清，经细胞计数后用hbss溶液调整细胞至1×106个/ml备用。3、单核细胞总蛋白质提取将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×106个/ml)室温1000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min离心1h；取上清用brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。4、westernblot检测细胞总蛋白用brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80v恒压，看见marker后增加至120v；将电泳后的胶取出，使用bio.rad半干转印系统于100v转移50min；转膜完毕后，用1xpbs洗一次，浸入封闭液，40c过夜；倒掉封闭液，加入western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ecl试剂显影、定影检测蛋白表达。5、统计学处理将蛋白条带的灰度值使用imagej软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。6、结果结果显示，以正常人组血液中的蛋白相对表达水平为1，帕金森症组血液中dnase2蛋白水平为5.13±1.57，显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。序列表<110>北京泱深生物信息技术有限公司<120>dnase2作为帕金森症诊断标志物的用途<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cagcatcacactcacatc18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agtacaggtcatctccaa18<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tttaactctggtaaagtggatat23<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggtggaatcatattggaaca20当前第1页12