本发明涉及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于lamp技术的干粉化金黄色葡萄球菌核酸快速检测试剂盒。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌(staphylococusaureus,sa)，在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一。金黄色葡萄球菌为侵袭性细菌，能产生毒素，对肠道破坏性大，所以金黄色葡萄球菌肠炎易引起病急，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻。国内外由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒屡屡发生，在细菌性食物中毒事件中仅次于副溶血性弧菌和变形杆菌，并被列为我国食品卫生微生物常规检测项目之一，因此食品卫生中对金黄色葡萄球菌的防控尤为重要。在检测手段上，目前国内外检测机构仍然主要采用传统的微生物学检验方法对金黄色葡萄球菌进行检测，整个过程一般需要3～5天，且操作过程繁琐，随着致病微生物规模化检测的需求不断增大以及快速准确检测的现实需求，传统的检测方法已经不能完全满足规模化检测需求，因此迫切需要建立新的快速检测技术和方法。金黄色葡萄球菌检验的传统检验方法主要为baird-parker平板涂布法、为提高检测效率，也可用纸片法、酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增技术等分子生物学检测方法，进行快速检测和结果初筛。这些技术试图突破传统的形态学、生化反应等传统模式，不需要对目标菌进行分离提纯，而直接用样品或者样品的增菌液检测，使得检测向准确、快速和低成本方向发展。另一方面，这些快速方法也有其天然的缺陷，普通的pcr检测需要专门的仪器，检测过程相对繁琐，样品容易污染出现假阳性的情况，这使得其应用受到了限制。real-timepcr需要更为昂贵的检测仪器，并且成本比较高。免疫学的检测方法依赖高质量的单克隆抗体，否则无法提供准确的结果。lamp技术是2000年由日本研究人员notomi等开发的一种新型的体外恒温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的bstdna聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在恒温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。lamp用于快速检测无需复杂仪器，具有操作便捷、灵敏度高、特异性好、判读简单、检测范围广以及成本低的优点。在常规操作中，检测前均要配制对应的溶液反应体系，其中组分较多，频繁操作极易导致试剂污染、检测区间污染以及结果误差等，加之该反应体系中部分试剂需要冷冻储存，如bstdna聚合酶需在-20℃条件下储存，温度过高会影响其酶活性，造成检测试剂失活。因此对高温下冷链运输以及现场应用提高了要求，也提高了相应成本。同时，作为非标方法尚未在食品安全、医疗卫生等领域推广开来，而且目前已有的lamp产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方式方法均无提及。且市场上基于环介导恒温扩增技术的金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有金黄色葡萄球菌检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于lamp技术可常温运输的干粉化金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒以及其制备方法。该试剂盒和使用方法涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足食品安全生产和流通各个环节的快速检测的需求。本发明所采取的技术方案是：一种金黄色葡萄球菌的lamp引物组，包括外引物f3/b3、内引物fip/bip以及环引物lf/lb，其序列如下：金黄色葡萄球菌-f3：agccaggcgttcaatgc金黄色葡萄球菌-b3：gttgttacccaggcgacg金黄色葡萄球菌-fip：tcacctcgccgagccagtactgcttctgcgcaagtacccga金黄色葡萄球菌-bip：ggtcagccagagctaccccatccgccagcttgtacagaga金黄色葡萄球菌-lf：gccggagtactggctgt金黄色葡萄球菌-lb：agccagaaggtgcccga。一种金黄色葡萄球菌的干粉化lamp快速检测试剂盒，其lamp引物组如上所示。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液和封闭液。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，干粉化的检测试剂冻干前含有0.9～1.6mmol/ldntps、0.3～0.4u/μlbstdna聚合酶、0.1～0.5μmol/l外引物f3/b3、1.0～2.0μmol/l内引物fip/bip、0.5～1.5μmol/l环引物lf/lb以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。冻干复合保护剂优选含3％～5％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白。特别的，冻干复合保护剂为：3％海藻糖(w/v)、0.01％甘氨酸(w/v)、0.1％牛血清白蛋白。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有2～9mmol/lmgso4、8～12mmol/lkcl、15～20mmol/ltris-hcl、8～12mmol/l(nh4)2so4、0.1～0.3％tritonx-100以及0.5～1.5mol/l甜菜碱。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，显色液由0.3～1.5mmol/l的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/l的mncl2按照混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/l，mncl2的终浓度为120～360μmol/l。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，裂解液含有：10～20mmol/ltris-hclph8.3、1mmol/ledta、0.3～1％sds。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为无菌石蜡油。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，阳性对照为提纯的金黄色葡萄球菌核酸基因组dna制成的冻干粉，阴性对照为非金黄色葡萄球菌核酸基因组dna制成的冻干粉。作为上述干粉化lamp快速检测试剂盒的进一步改进，使用方法包括如下步骤：(1)取25g样品至盛有225ml7.5％氯化钠肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225ml7.5％氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min；若样品为液态，吸取25ml样品至盛有225ml7.5％氯化钠肉汤的无菌锥形瓶中，振荡混匀；将上述样品匀液置于36℃±1℃培养8-12h，对增菌液中的菌体富集用于lamp快速检测；(2)增菌液6000r/min离心，去除上清；(3)分别向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液，充分悬浮，水浴或者金属浴99℃热裂解10min，裂解结束后12000r/min离心15min，上清即为待检样品粗提核酸；(4)取冻干粉管，向冻干粉管内加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，将检测的样品核酸加入反应管中，对照管分别加入经无菌超纯水溶解的金黄色葡萄球菌基因组dna作为阳性对照，以无菌超纯水溶解的非金黄色葡萄球菌基因组dna作为阴性对照，后按照一定比例加入显色液，充分混匀后加入石蜡油封闭液，进行61℃恒温反应；(5)反应后结果判读：反应结束后，建议在自然光线充足的环境条件下，将检测管平置于白色背景下观察，阴性对照检测管反应液呈淡橙色，无浑浊；阳性对照检测试剂管呈荧光绿，伴有不同程度的浑浊；待测样品反应管以此作为对照进行判读，若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。本发明的有益效果是：本试剂盒基于环介导恒温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌，利用3对特殊引物和具有链置换活性的bstdna聚合酶，特异性识别靶序列上的8个独立区域，实现在恒温条件下(60～65℃)进行链置换扩增反应，克服了传统pcr反应需要通过热变性过程获得单链模板、检测时间长、易污染等缺点，同时该方法在恒定温度条件进行，操作简便，对检测人员的操作要求低，便于对大样本实现成本低廉的快速筛选。目前国内主要以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化鉴定和血清学分型鉴定等通行方法进行食品微生物学相关检验，其初步鉴定一般需要2～3天，而最终完成鉴定报告则需5～7天，如采用本试剂盒检测从处理样本到检测完成仅需12～14小时，且本试剂盒含显色液，通过肉眼即可判读结果，更加直观清晰。①该试剂的干粉化制备工艺加入复合冻干保护剂，大大增加试剂稳定性，试剂的保质期时间可以延长到2年，且便于常温运输，节约运输成本；②该干粉化试剂已将反应体系中部分组分试剂按相应比例组合，并经复溶液溶解即用，减少溶液配置步骤，使用更加便捷、准确，更适于基层现场检测；③该反应过程在恒温条件下即可进行，无需特殊配套试剂以及仪器，大大降低了检测成本；④反应所需模板拷贝量少，灵敏度高，最低检验限可低至15cfu/test；⑤利用靶基因序列的3对特殊引物，特异性地识别靶序列上的8个独立区域，反应在30～45min内完成，高效而快速；⑥反应前加入由钙黄绿素和氯化锰混合的显色液，可通过肉眼观察颜色变化或者荧光监测仪器对荧光吸收值的变化对结果进行判读，阴阳性的颜色变化差异明显，判读直观方便，且可避免反应后开盖造成的气溶胶污染。具体实施方式下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。引物的筛选表1、不同的引物组序列表引物序列的编号如下：表2、引物组的序列编号表对以上6组引物采取统一的优化反应体系测试，经琼脂糖凝胶电泳观察反应产物，发现引物组1仅需31min即有明显的扩增条带，引物组2和引物组6需34min左右，引物组3、引物组4和引物组39min左右。试剂盒的制备(1)引物合成：按照引物组1提供的序列合成寡聚核苷酸引物，并定量配制。制备该试剂冻干粉：按照表3所示在无菌环境下混合需要冻干处理的相关组分混合液，封装于容器中，置于液氮预冻后再按照常规冷冻干燥，最后可得到干粉化的检测试剂。表3、不同实例冻干粉的组成表制备复溶液，其组成如表4所示：表4、复溶液组成表组分终浓度kcl8mmol/ltris-hcl,，ph8.816mmol/l(nh4)2so49mmol/lmgso46mmol/ltritonx-1000.2％甜菜碱1.2mol/l制备阳性对照干粉：向提纯的金黄色葡萄球菌基因组dna溶液分别加入3％的海藻糖(w/v)，分装于容器中，同样经上述冻干程序制备阳性对照干粉。制备阴性对照干粉：向提纯的非金黄色葡萄球菌基因组dna溶液分别加入3％的海藻糖(w/v)，分装于容器中，同样经上述冻干程序制备阴性对照干粉。配制显色液：由0.3mmol/l钙黄绿素和7.2mmol/lmncl2等体积混合得到，钙黄绿素的终浓度为15μmol/l，mncl2的终浓度为360μmol/l，置于容器中。将封闭液液体石蜡油无菌分装，置于容器；配制裂解液：含有10～20mmol/ltris-hcl，ph8.3、1mmol/ledta、0.3～1％sds，置于容器中。稳定性试验根据上述试剂冻干粉制备获取9例不同组分的试剂冻干粉，并相应地组装成9种不同的试剂盒，存放于2～8℃环境中，每隔3个月对该9种试剂盒产品进行灵敏度试验，结果见表5。表5、不同实例检测试剂的稳定性数据采用例1、例3和例4复合冻干保护剂经过液氮预冻和冷冻干燥后，试剂冻干粉能保持较好的稳定性，其中例1的冻干试剂最长的保质期时间可达21～24个月，远高于同类型产品的12个月保质期。其余冻干保护剂制成的冻干粉保质期在12～18个月，除含5％海藻糖的复合保护剂有轻微吸潮现象外，其余复合保护剂冻干成粉状制剂后在各自保质期范围内均保持良好形态，没有塌陷和镂空现象。最低检验限和灵敏度的比较(1)用无菌接种环分别挑取金黄色葡萄球菌(atcc6538)的单菌落，用灭菌生理盐水进行梯度稀释(稀释倍数分别为100，101，102，103，104，105，106，107，108)，并分别取各个稀释菌液100μl螺旋接种到tsa平板进行培养和计数。(2)分别取以上稀释菌液100μl，6000r/min离心5min，弃上清，加入10μl裂解液充分悬浮菌体沉淀，99℃加热裂解菌体10min，菌体裂解液12000r/min离心15min，取上清即为粗提的菌体模板基因；(3)以上粗提dna为模板进行pcr和lamp反应，金黄色葡萄球菌pcr引物为：pf-5’-gatgctttgttgttagggca-3’(seqidno：37)，pr-5’-cgtttgtgctgatttccc-3’(seqidno：38)。(4)扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，35个循环。(5)取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μl，待管中干粉完全溶解后分别加入以上各个稀释菌液对应的粗提dna模板2.5μl，无菌超纯水2.5μl，充分混匀后每管加入20μl封闭液，紧盖，设置61℃恒温反应50min；(6)以上pcr与lamp扩增产物用琼脂糖凝胶电泳来判读，平板菌落计数确定最低检验限。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示金黄色葡萄球菌pcr的最低检验限在105倍数稀释处，lamp最低检验限制在106倍数稀释处。对应的菌落计数采用标准gb4789.2-2016食品微生物学检验菌落总数测定，金黄色葡萄球菌在106倍数稀释处为15cfu，结果显示lamp检测的灵敏度远高于pcr。纯菌的检测(1)样品处理用于纯菌的筛选鉴定中，用接种环挑取各菌的单菌落半环，转移到含有30μl裂解液的无菌pcr管中，充分混匀后水浴或者金属浴99℃热裂解10min；裂解结束后转到离心机中12000r/min离心10min，取上清即为样品粗提基因组dna，选用的菌株见表6。表6(2)恒温扩增反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μl，待管中干粉完全溶解，分别加入以上所有菌粗提的dna模板2.5μl。另取2管分别做阴性对照和阳性对照，加入对应的对照试剂2.5μl。最后分别向所有各管中加入显色液2.5μl，充分混匀后加入20μl封闭液，紧盖后经biometraprofessionalpcr仪设置61℃恒温反应50min；(3)反应后判读，反应结束后，对比反应前后颜色变化，若呈现荧光绿则为阳性，淡橙色则为阴性，若阴阳性对照结果与上述任一结果不符，则本次检测结果无效，应重新检测，整个观察过程不得打开管盖。检测结果见表7。表7结果，经本发明检测，以上所选的金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌的核酸快速检测中，金黄色葡萄球菌的标准菌株和分离株在各自的反应溶液中出现明显颜色变化呈荧光绿，而非金黄色葡萄球菌属各菌反应液前后均未出现颜色变化，仍为淡橙色，可见本发明具有极好的特异性，能有效检出金黄色葡萄球菌。食品中金黄色葡萄球菌的快速检测(1)样品处理，参照gb/t4789.10-2016《食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》，取25g样品至盛有225ml7.5％氯化钠肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛225ml7.5％氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min；若样品为液态，吸取25ml样品至盛有225ml7.5％氯化钠肉汤的无菌锥形瓶中，振荡混匀；(2)将上述样品匀液于36℃±1℃培养10h±2h，对增菌液中的菌体富集用于lamp快速检测(3)吸增菌液1ml到1.5ml规格的无菌离心管中，6000r/min离心5min，弃上清；加入30μl裂解液，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热10min，12000r/min离心15min，上清即为粗提的dna；(4)恒温扩增反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μl，待管中干粉完全溶解，分别加入以上所有菌粗提的dna模板2.5μl；另取2管分别做阴性对照和阳性对照，加入对应的对照试剂2.5μl；最后分别向所有各管中加入显色液2.5μl，充分混匀后加入20μl封闭液，紧盖，设置biometraprofessionalpcr仪至61℃恒温反应50min；(5)反应结束后，观察反应管中溶液由检测前的淡橙色变为荧光绿色，与阳性对照管变化相同，表示有金黄色葡萄球菌检出，如颜色无变化，表示无检出。sequencelisting<110>广东环凯微生物科技有限公司广东粤微食用菌技术有限公司广东环凯生物科技有限公司<120>金黄色葡萄球菌干粉化lamp快速检测试剂盒<130><160>38<170>patentinversion3.5<210>1<211>17<212>dna<213>人工引物<400>1agccaggcgttcaatgc17<210>2<211>18<212>dna<213>人工引物<400>2gttgttacccaggcgacg18<210>3<211>41<212>dna<213>人工引物<400>3tcacctcgccgagccagtactgcttctgcgcaagtacccga41<210>4<211>40<212>dna<213>人工引物<400>4ggtcagccagagctaccccatccgccagcttgtacagaga40<210>5<211>17<212>dna<213>人工引物<400>5gccggagtactggctgt17<210>6<211>17<212>dna<213>人工引物<400>6agccagaaggtgcccga17<210>7<211>25<212>dna<213>人工引物<400>7gaagtttatatacaggatacgctaa25<210>8<211>18<212>dna<213>人工引物<400>8gccatactatcgctcctt18<210>9<211>41<212>dna<213>人工引物<400>9accggacgtcttactttcgtacgtgttgaaaaacataaccg41<210>10<211>47<212>dna<213>人工引物<400>10tatgagacaaagtctgaagcattgacgcaatttcttttgtctggtat47<210>11<211>19<212>dna<213>人工引物<400>11gaggtcaaggagccaaata19<210>12<211>18<212>dna<213>人工引物<400>12acatttcttgataaacta18<210>13<211>19<212>dna<213>人工引物<400>13ttcaacggatgctttgttg19<210>14<211>20<212>dna<213>人工引物<400>14aaatccatgtgatgcattgt20<210>15<211>45<212>dna<213>人工引物<400>15ccattgcctgaacataagtccattagggcattttacaaaacctag45<210>16<211>45<212>dna<213>人工引物<400>16tgcgaaacatccacgacatatagatcattgaattgaaatgtgcgt45<210>17<211>20<212>dna<213>人工引物<400>17aacaaaagatattgtgttgg20<210>18<211>19<212>dna<213>人工引物<400>18cgcgccatacgacaagtgt19<210>19<211>21<212>dna<213>人工引物<400>19gggcattttacaaaacctaga21<210>20<211>25<212>dna<213>人工引物<400>20acgttactaaagtatattgtgaagg25<210>21<211>49<212>dna<213>人工引物<400>21cgtggatgtttcgcaaacaataacaatattgtgttggacttatgttcag49<210>22<211>42<212>dna<213>人工引物<400>22gcgcgacgcacatttcaattacgtttttcaaatccatgtgat42<210>23<211>18<212>dna<213>人工引物<400>23ggcaatggggtgataccc18<210>24<211>19<212>dna<213>人工引物<400>24tttaaatactttagtaacg19<210>25<211>19<212>dna<213>人工引物<400>25gaagcattgaagcgtgaat19<210>26<211>22<212>dna<213>人工引物<400>26atgactttaatggagttggaat22<210>27<211>49<212>dna<213>人工引物<400>27tgcccactaaatataatacagccatttataccagacaaaagaaattgcg49<210>28<211>48<212>dna<213>人工引物<400>28gagcagttgatgtattgaaacgtgcagtttactagttactctagtgtc48<210>29<211>19<212>dna<213>人工引物<400>29accaattggtaatttagca19<210>30<211>18<212>dna<213>人工引物<400>30ttcacaagcaatcatatc18<210>31<211>23<212>dna<213>人工引物<400>31attttaaagagaatcagcaacac23<210>32<211>25<212>dna<213>人工引物<400>32gactttcttaggttcaatattcact25<210>33<211>50<212>dna<213>人工引物<400>33ctgcaatcatgcaatcttcaagtgtatcaaaaagaagcacataagatagc50<210>34<211>43<212>dna<213>人工引物<400>34ggtggcaggctaaacatggttttctcatttcaaacaagacatc43<210>35<211>20<212>dna<213>人工引物<400>35cgagacatgagattatgtgt20<210>36<211>20<212>dna<213>人工引物<400>36ttcttttaataaatgacggg20<210>37<211>20<212>dna<213>人工引物<400>37gatgctttgttgttagggca20<210>38<211>18<212>dna<213>人工引物<400>38cgtttgtgctgatttccc18当前第1页12