一种提高肺癌干细胞富集效率的细胞培养容器的制作方法

本实用新型属于干细胞领域，具体涉及一种提高肺癌干细胞富集效率的细胞培养容器。
背景技术：
：肺癌是目前对人类的健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一。迄今为止，现有的肺癌治疗方法仅可延长患者的生存期，改善其生活质量，几乎所有的患者最终仍死于原发病。近年来有学者提出，在肿瘤组织中存在极小一部分具备无限增殖潜能和自我更新能力的干细胞群体，对肿瘤的发生、发展起着至关重要的作用，针对这部分细胞的靶向治疗将会给肿瘤治疗带来深远影响。但由于肿瘤干细胞(cancerstemcells,CSCs)在肿瘤组织中的含量极少，这成为制约CSCs研究发展的主要障碍。因此，建立一种高效的富集CSCs方法，对后续实验研究的顺利进行非常必要，也是目前CSCs领域研究的重要课题之一。当前肺癌干细胞研究的焦点是分离和鉴定肺癌干细胞，一般采用流式细胞仪分选可能的肺癌细胞亚群，再进行生物学鉴定，以证明其干细胞特性。但由于缺乏特异性的干细胞筛选的分子标志，筛选结果争议较大。肿瘤干细胞标志物是一些在肿瘤干细胞中特异性高表达(阳性表达)、不表达或低表达(阴性表达)的分子。国外一些学者通过研究报道，CD133(+)/nestin(+)可能为肺癌干细胞的标记物。研究过程中，可以按照肿瘤干细胞具有能在无血清悬浮培养条件下富集的特性，采用添加生长因子的无血清培养基对肺癌细胞进行悬浮培养，获得肺癌细胞球体，然后对分离到的肺癌细胞球体进行生物学功能鉴定。目前，在实际的动物细胞培养过程中，血清是最为常用和基本的添加物。无血清培养基则可以在不添加血清的条件下即为细胞的体外生长和繁殖提供良好的条件。从原代肿瘤中获取肿瘤细胞，在含有适当生长因子(如碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子等)的无血清培养基中培养，非肿瘤干细胞由于“血清饥饿”，将无法正常存活，但肿瘤干细胞却可以存活并繁殖，由此肿瘤细胞将得到纯化并维持干细胞状态，其得率也将提高，更好进行各项研究。无血清培养具有实用、简单、快捷等诸多优点，可快速获得足够数量的干细胞。以陈平等人的研究为例(肺癌干细胞富集及相关标志物的表达，中国组织工程研究第19卷第14期)，使用含有表皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1以及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基对SPCA-1肺癌细胞诱导培养5-10d可获得悬浮生长细胞球体。RT-PCR检测肺球体细胞，除表达肺癌干细胞标志CD24和CD221外，还表达细支气管肺泡干细胞标志CCSP和SP-C，此外，肺球体细胞表达胚胎干细胞的主干基因OCT4、Nanog、Bmi-1和肺干细胞的主干基因TTF-1。上述方法确实可以有效获得肺癌干细胞，但是培养过程较为繁琐且诱导效率较低，需要培养5-10d才可获得悬浮生长细胞球体，且在球体形成之前每隔2d就需要添加一次生长因子。技术实现要素：本实用新型的目的在于提供一种提高肺癌干细胞富集效率的细胞培养容器，以高效、快捷获取悬浮生长细胞球体及肺癌干细胞，提高科研效率。上述目的是通过如下技术方案实现的：一种提高肺癌干细胞富集效率的培养容器，包括培养容器主体，培养容器主体内壁还设有包被层，包被层为γ聚谷氨酸材质。优选地，所述γ聚谷氨酸分子量为70万克/摩尔。优选地，所述培养容器为培养瓶。更优选地，培养瓶规格为25cm2、75cm2、175cm2。优选地，所述培养容器为培养皿。更优选地，培养皿规格为35mm、60mm、100mm。优选地，所述培养容器为培养板。更优选地，培养板规格为6孔、12孔、24孔。一种制备上述培养容器的方法，包括如下步骤：步骤S1，将无菌γ聚谷氨酸溶于无菌水中，制成浓度为0.1-0.2mg/mL的γ聚谷氨酸溶液，用0.22μm滤膜过滤，备用；步骤S2，取上述γ聚谷氨酸溶液加入培养容器中，充分摇匀使其均匀铺满于整个细胞培养容器的底部，放入37℃培养箱中静置4-6小时；步骤S3，从培养箱中取出培养器皿，用无菌水清洗2-3次，置于37℃培养箱备用。本实用新型的有益效果：本实用新型提供的含有γ聚谷氨酸包被层的培养容器可以显著提高悬浮生长细胞球体的形成效率，24小时内即可形成理想的悬浮生长细胞球体，且肺癌干细胞在该悬浮生长细胞球体中高度富集，比现有的无血清培养基加细胞生长因子法效率更高，更便捷。附图说明图1为本实用新型培养瓶结构示意图，图中1为γ聚谷氨酸包被层；图2为本实用新型培养皿结构示意图，图中1为γ聚谷氨酸包被层；图3为本实用新型培养板结构示意图，图中1为γ聚谷氨酸包被层。具体实施方式下面结合具体实施例和附图详细介绍本实用新型的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知。实施例1本实用新型培养瓶的制备取市售T-75培养瓶(国产科晶培养瓶，产品编号191-203118，透气滤膜盖，斜口，螺口，灭菌；T-75指平放时可用细胞培养面积为75cm2，此为本领域技术人员公知常识)备用，在此基础上实验室自制本实用新型提供的培养瓶，具体步骤如下：步骤S1，将γ聚谷氨酸(采用γ射线钴60照射灭菌，分子量70万克/摩尔)溶于无菌水中，制成浓度为0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液，用0.22μm滤膜过滤，备用；步骤S2，取γ聚谷氨酸溶液15mL加入上述T-75培养瓶中(溶液高度约0.2cm)，充分摇匀使其均匀铺满于整个细胞培养瓶的底部，放入37℃培养箱中静置5小时；步骤S3，从培养箱中取出培养瓶，用无菌水清洗培养瓶底部2-3次，置37℃培养箱备用。显微镜观察显示，细胞培养瓶底部形成均匀的γ聚谷氨酸包被层，包被层厚度约0.4mm。结构示意图如图1所示。还可以采用市售的T-25培养瓶、T-175培养瓶制成可用细胞培养面积分别为25cm2、175cm2的本实用新型培养瓶，制备时分别添加0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液5mL、35mL，包被层厚度约0.4mm。当然，为了提高科研人员的工作效率，可以制备成预包被培养瓶成品销售给科研人员。实施例2本实用新型培养皿的制备取市售规格60mm细胞培养皿(上海翼飞生物科技，灭菌；细胞生长面积21cm2，高度为15mm，此为本领域技术人员公知常识)备用，在此基础上实验室自制本实用新型提供的细胞培养皿，具体步骤如下：步骤S1，将γ聚谷氨酸(采用γ射线钴60照射灭菌)溶于无菌水中，制成浓度为0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液，用0.22μm滤膜过滤，备用；步骤S2，取γ聚谷氨酸溶液5mL加入上述60mm细胞培养皿(溶液高度约0.24cm)，充分摇匀使其均匀铺满于整个细胞培养皿的底部，放入37℃培养箱中静置5小时；步骤S3，从培养箱中取出培养皿，用无菌水清洗培养皿底部2-3次，置37℃培养箱备用。显微镜观察显示，细胞培养皿底部形成均匀的γ聚谷氨酸包被层，包被层厚度约0.48mm。结构示意图如图2所示。还可以采用市售的35mm培养皿(高度10mm，细胞生长面积8cm2)、100mm培养皿(高度20mm，细胞生长面积55cm2)制成本实用新型培养皿，分别添加0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液3mL、10mL，包被层厚度分别约为0.75mm、0.36mm。当然，为了提高科研人员的工作效率，可以制备成预包被培养皿成品销售给科研人员。实施例3本实用新型培养板的制备取市售6孔板(国产迈博瑞，灭菌；单孔面积9.5cm2，单孔体积16.5mL，此为本领域技术人员公知常识)备用，在此基础上实验室自制本实用新型提供的细胞培养皿，具体步骤如下：步骤S1，将γ聚谷氨酸(采用γ射线钴60照射灭菌)溶于无菌水中，制成浓度为0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液，用0.22μm滤膜过滤，备用；步骤S2，取γ聚谷氨酸溶液2.5mL加入上述6孔板(溶液高度约0.26cm)，充分摇匀使其均匀铺满于整个细胞培养孔的底部，放入37℃培养箱中静置5小时；步骤S3，从培养箱中取出培养板，用无菌水清洗培养孔底部2-3次，置37℃培养箱备用。显微镜观察显示，细胞培养孔底部形成均匀的γ聚谷氨酸包被层，包被层厚度约0.52mm。结构示意图如图3所示。还可以采用市售的12孔板(单孔面积3.9cm2，单孔体积6.5mL)、24孔板(单孔面积1.75cm2，单孔体积2.9mL)制成本实用新型培养板，分别添加0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液2mL、1mL，包被层厚度分别约为1mm、1.1mm。当然，为了提高科研人员的工作效率，可以制备成预包被培养板成品销售给科研人员。实施例4不同培养容器对肺癌干细胞成球的影响一、实验材料细胞株：人肺癌细胞株SPCA-1为本公司长期冻存，复苏后置于DMEM培养液(含体积分数为10％胎牛血清)中进行传代培养，得到活跃增殖期细胞备用。包被培养皿：按实施例2方法制备，规格60mm。常规培养皿A：直接采用实施例2中市售培养皿，规格60mm，无γ聚谷氨酸包被层。常规培养皿B：超低吸附培养皿，上海昨非实验室设备有限公司，规格60mm，无包被。无血清DF12培养液购于昆明中云美生物技术有限公司。其他仪器和试剂均为本领域技术易于获得的常规仪器和试剂。二、实验方法1、球体培养和分离包被培养皿：将活跃增殖期肺癌细胞置于无血清DF12培养液中，调整细胞浓度为2×107/L，取5mL细胞培养于包被培养皿中，常规条件培养至球体形成为止。收集细胞，离心(100×g)后留取球体细胞沉淀备用，对球体细胞进行免疫荧光检测。常规培养皿A：将活跃增殖期肺癌细胞置于无血清DF12培养液中，调整细胞浓度为2×107/L，取5mL细胞培养于常规培养皿A中，常规条件培养至球体形成为止。收集细胞，离心(100×g)后留取球体细胞沉淀备用，对球体细胞进行免疫荧光检测。常规培养皿B：将活跃增殖期肺癌细胞置于无血清DF12培养液中，调整细胞浓度为2×107/L，取5mL细胞培养于常规培养皿B中，分别加入20μg/L不同的细胞生长因子，包括重组人成纤维细胞生长因子10、重组人表皮细胞生长因子以及重组人胰岛素样生长因子1，每隔2d添加1次上述3种因子，常规条件培养至球体形成为止。收集细胞，离心(100×g)后留取球体细胞沉淀备用，对球体细胞进行免疫荧光检测。2、免疫荧光检测细胞浓度调整至1×109/L，取200μL滴于盖玻片培养过夜，用40g/L多聚甲醛进行固定，利用非离子型表面活性剂0.1％TritonX-100增加细胞膜通透性，然后进行染色；一抗为OCT4特异性抗羊多克隆IgG，稀释浓度为1:50，置于4℃湿盒中反应过夜，经PBS淋洗去除非结合的抗体，然后用异硫氰酸荧光素标记的驴抗羊多克隆IgG于室温中反应2h，再次PBS淋洗，DAPI染核，封固，置于荧光显微镜下进行观察。三、实验结果1、细胞球体形成速度现有技术多采用常规培养皿B的富集方法，无血清培养基加细胞生长因子诱导，一般5-10天可收获悬浮生长细胞球体。本实施例三组富集方法形成悬浮生长细胞球体时间如下表：包被培养皿常规培养皿A常规培养皿B时间22小时14天8天与常规培养皿A相比，常规培养皿B培养液中含有细胞生长因子，证明细胞生长因子确实可以诱导悬浮生长细胞球体形成；与常规培养皿A相比，包被培养皿于培养皿底部包被有γ聚谷氨酸包被层，但不含细胞生长因子，结果22小时即可形成理想的悬浮生长细胞球体。可以看出，与现有技术相比，本实用新型培养皿可以显著提高细胞球体形成速度。2、免疫荧光检测球体细胞标志物的表达OCT4为干细胞干性基因，肿瘤干细胞中OCT4基因表达呈阳性，且表达量高。通过测定细胞样本中OCT4阳性细胞的比率可以评估细胞样本中干细胞的含量。本实施例三组富集方法获得的悬浮生长细胞球体中OCT4阳性细胞比例如下表：与SPCA-1细胞相比，本实施例三组富集方法获得的悬浮生长细胞球体中OCT4阳性细胞比例均显著升高；与现有技术常规培养皿B相比，常规培养皿A培养法悬浮生长细胞球体中非干细胞比例较高，包被培养皿培养法悬浮生长细胞球体中干细胞含量略高。上述实验表明，本实用新型提供的含有γ聚谷氨酸包被层的培养容器可以显著提高悬浮生长细胞球体的形成效率，24小时内即可形成理想的悬浮生长细胞球体，且肺癌干细胞在该悬浮生长细胞球体中高度富集，比现有的无血清培养基加细胞生长因子法效率更高，更便捷。上述实施例的作用在于说明本实用新型的实质性内容，但并不以此限定本实用新型的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本实用新型的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本实用新型技术方案的实质和保护范围。当前第1页1 2 3