BCMA和CD3双特异性T细胞接合抗体构建体的制作方法

双特异性抗体衍生的分子，例如(双特异性t细胞接合器)抗体构建体是由两个柔性连接的抗体衍生的结合结构域制得的重组蛋白构建体。抗体构建体的一个结合结构域对于靶细胞上所选择的肿瘤相关表面抗原具有特异性；第二结合结构域对cd3(即t细胞上t细胞受体复合物的亚单位)具有特异性。通过其特定设计，抗体构建体独特地适于瞬时连接t细胞与靶细胞，并同时强效地活化t细胞针对靶细胞的固有细胞溶解潜力。随着amg103和amg110是在cd3ε链的n-末端结合到上下文独立表位的双特异性抗体构建体的供应(wo2008/119567)，第一代的抗体构建体的重要的进一步发展(参见wo99/54440和wo2005/040220)发展成临床。结合到这个所选择表位的抗体构建体不仅显示了人和狨毛猴(callithrixjacchus)、绒顶柽柳猴(saguinusoedipus)或松鼠猴(saimirisciureus)cd3ε链的种间特异性，而且，由于认识到这种特异性表位(而非双特异性t细胞接合分子中的先前描述的cd3的表位结合剂)不会非特异性活化t细胞至与前一代t细胞接合抗体所观察到的程度相同的程度。t细胞活化的这种降低与患者中较少或减少的t细胞重新分布相关，后者被鉴定为副作用的风险。如wo2008/119567中所述的抗体构建体可能遭受从身体快速清除；因此，虽然其能够快速到达身体的大部分部位，并且产生迅速并且更容易处理，但是其体内应用可能受到其在体内的短暂持续性的限制。由于这种小的单链分子的体内半衰期短，因此使用通过连续静脉内输注的长期施用来实现治疗效应。然而，所述连续静脉输注分类为对患者不方便，并且因此，如果更方便的替代治疗方法，阻碍选择证实在治疗各种疾病中更有效的化合物。因此，本领域需要保留类似治疗功效并具有直接产生的格式、并且具有有利的药代动力学性质(包括更长的半衰期)的双特异性治疗剂。延长的半衰期通常可用于免疫球蛋白、特别是抗体并且最特别是小尺寸的抗体片段的体内应用。在本领域中描述的来实现所述效应的方法包括将小的双特异性抗体构建体融合到较大的蛋白质，其优选地不干扰的的治疗效应。双特异性t细胞接合器的这种进一步发展的实例包括例如在us2014/0302037、us2014/0308285、wo2014/144722、wo2014/151910和wo2015/048272中描述的双特异性fc分子。另一替代策略是使用与双特异性分子融合的hsa或仅与人白蛋白结合肽融合(参见例如wo2013/128027、wo2014/140358)。bcma(b细胞成熟抗原、tnfrsf17、cd269)是属于tnf受体超家族的跨膜蛋白。由于其可能与其配体baff(b细胞活化因子，也称为tall-1或tnfsf13b)和april(增殖诱导配体)的必需相互作用，其被确立为b细胞发育和体内稳态所必需的b细胞标记物(schliemann等，(2001)science293(5537)：2111-2114)。bcma表达限于b细胞谱系并且主要存在于浆细胞和浆母细胞上并且在一定程度上存在于记忆b细胞上，但在外周和幼稚b细胞上实质上不存在。bcma也在多发性骨髓瘤(mm)细胞上表达并参与白血病和淋巴瘤。连同其家族成员taci(跨膜活化剂和亲环素受体配体相互作用物)和baff-r(b细胞活化因子受体，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员13c)，bcma调节体液免疫、b细胞发育和体内稳态的不同方面。bcma的表达在b细胞分化中表现得相当晚，并且有助于骨髓中浆母细胞和浆细胞的长期存活。小鼠中bcma基因的靶向缺失导致骨髓中长寿浆细胞的数量显著减少，指示bcma对其存活具有重要性。根据这一发现，bcma还支持多发性骨髓瘤(mm)细胞的生长和存活。novak等发现mm细胞系和新鲜分离的mm细胞在其细胞表面上表达bcma和taci蛋白，并在其细胞表面上具有baff-r蛋白的可变表达(novak等，(2004)blood103(2)：689-694)。多发性骨髓瘤(mm)是第二常见的血液恶性病，并占所有癌症死亡的2％。mm是一种异质性疾病，并且大部分由染色体易位引起，尤其t(11；14)、t(4；14)、t(8；14)、del(13)和del(17)。由于骨髓浸润、骨破坏、肾衰竭、免疫缺陷和癌症诊断的心理负担，患mm的患者可能会经历各种疾病相关的症状。骨髓瘤是一种不可治愈的疾病，其通常会伴随复发过程，许多患者(pts)需要多线疗法。rrmm的结果仍然很差，特别是在基于蛋白酶体抑制剂(pi)和/或免疫调节药物(imid)的治疗失败后。mm仍然是一种难以治疗的疾病，并且仍然不可治愈。其通常伴随复发过程，许多患者需要多线疗法。诸如化学疗法和干细胞移植方法的疗法正在变得可用并且具有改善的存活率，但通常带来不想要的副作用。迄今为止，针对多发性骨髓瘤患者的两种最常用的治疗选项是类固醇、沙利度胺、来那度胺、硼替佐米或各种细胞毒性剂的组合，以及对于年轻患者使用自体干细胞移植的高剂量化学疗法概念。大多数移植是自体类型的，即，使用患者自身的细胞。所述移植虽然不可治愈，但已被证明可以延长所选择患者的生命。其可以在新诊断患者中作为初始疗法进行或在复发时进行。有时，在所选择患者中，可能会推荐一个以上移植来充分控制疾病。由于年老、存在其他严重疾病或其他身体限制，干细胞移植可能并非许多患者的选项。化学疗法仅部分控制多发性骨髓瘤，其很少导致完全缓解。复发难治性mm的结果仍然很差，特别是在基于蛋白酶体抑制剂(pi)和/或免疫调节药物的治疗失败后。因此，迫切需要新的创新治疗。bellucci等(blood.2005年5月15日；105(10))在多发性骨髓瘤患者接受供体淋巴细胞输注后鉴定到bcma特异性抗体。这些患者的血清能够通过adcc和cdc介导bcma特异性细胞溶解，并且仅在具有抗肿瘤应答的患者中检测到(4/9)，但在无应答患者中未检测到(0/6)。作者推测bcma特异性抗体的诱导有助于消除骨髓瘤细胞和长期缓解患者。ryan等(molcancerther.2007年11月；6(11)：3009-18)报道了拮抗性bcma特异性抗体的产生，其阻止与正常和恶性b细胞中强效的促存活信号传导途径相关的nf-кb活化。尽管bcma、baff-r和taci(即属于tnf受体超家族的b细胞受体)和其配体baff和april在抵抗癌症和/或自体免疫病症中经受疗法的事实，但仍需要具有治疗所述医学病况的可用的其他选项。一种这样的方法是双特异性抗体衍生的t细胞接合器。发明概要本领域描述的双特异性t细胞接合分子的所有半衰期延长格式(hle格式)(其包括异源fc(也称为异二聚体fc、hetfc或hfc)格式和人血清白蛋白(也称为hsa或halb)的融合物))具有个别缺点，例如非特异性t细胞活化、补体活化、不稳定性或不符合所需分子半衰期延长的药物代谢动力学曲线。因此，本发明的目的是提供bcmaxcd3双特异性t细胞接合分子的半衰期延长格式，其克服了至少一种且当然优选多于一种针对最先进的分子观察到的这些个别缺陷。因此，本发明提供特异性fc模式的抗体构建体，其特征在于包含结合到bcma的第一结构域、结合到人和/或猕猴cd3ε链的细胞外表位的第二结构域；以及第三结构域，其是特异性fc模式。此外，本发明提供了编码抗体构建体的多核苷酸、包含这种多核苷酸的载体、表达构建体的宿主细胞以及包含其的药物组合物。附图简述图1：图1a显示了本发明的抗体构建体的一个实施方案的图。图1b显示了异源二聚体fc抗体构建体，并且图1c显示了本领域中描述的x-体构建体。引入指示的带电对以实施异源二聚化。图1d显示了抗体构建体与人血清白蛋白的融合物(hsa/halb)。图2：评价由靶标抗体构建体的靶标独立的t细胞活化。2(a)48h活化测定中利用人pbmc(3x)、连续稀释液(起始为20nm；1∶5，7x+空白)的本发明的抗体构建体；无或具有fcr阻断[10mg/mlhuigg(kiovog、baxter)]；cd4+、cd8+t细胞上的cd69和cd25[未显示]表达的facs测量。2(b)48h活化测定中利用人pbmc和cd14+/cd33+细胞耗竭的pbmc(3x)、连续稀释液(起始为20nm；1∶5，7x+空白)的异源fc抗体构建体；cd4+、cd8+t细胞上的cd69和cd25[未显示]表达的facs测量。图3：评价由抗体构建体的靶标独立的t细胞活化。3(a)48h活化测定中利用人pbmc(3x)、连续稀释液(起始为20nm；1∶5，7x+空白)的本发明的靶标b抗体构建体；无或具有fcr阻断[10mg/mlhuigg(kiovog、baxter)]；cd4+、cd8+t细胞上的cd69和cd25[未显示]表达的facs测量。3(b)48h活化测定中利用人pbmc和cd14+/cd33+细胞耗竭的pbmc(3x)、连续稀释液(起始为20nm；1∶5，7x+空白)的靶标b异源fc抗体构建体；cd4+、cd8+t细胞上的cd69和cd25[未显示]表达的facs测量。3(c)48h活化测定中利用人pbmc和cd14+/cd33+细胞耗竭的pbmc(3x)、连续稀释液(起始为20nm；1∶5，7x+空白)的靶标bx体构建体；cd4+、cd8+t细胞上的cd69和cd25[未显示]表达的facs测量。3(d)-3(f)将来自三个不同健康人供体的分离的pbmc与增加浓度的对靶标b具有特异性的hle双特异性抗体构建体一起培养48h。使用对cd69具有特异性的pe-cy7缀合的mab通过流式细胞术分析测定cd4+和cd8+t细胞上活化标记物cd69的表达。图4：fc融合抗体构建体的补体c1q结合。将fc融合抗体构建体(单链fc(三角形)、异源fc(正方形)、规范的(圆形))涂覆在maxisorp板上(以稀释系列)，之后与汇集的人血清一起孵育并与多克隆抗人cc1q鼠类抗体一起孵育，通过山羊抗小鼠fc-ap缀合物可视化。图5：在食蟹猴中单次剂量施用后两个不同的bcma靶向的抗体构建体的平均pk曲线。出于可比性的原因，将血清浓度剂量标准化至15μg/kg并以nmol指示。图6：九个不同的抗体构建体的pk曲线，各抗体构建体融合到scfc半衰期延长部分。出于可比性的原因，将血清浓度剂量标准化至15μg/kg并以nmol指示。图7：双特异性scfc变体d9f(seqidno：105)、t2g(seqidno：106)、d3l(seqidno：107)、t7i(seqidno：108)和k6c(seqidno：109)。本发明的抗体构建体的优选的第三结构域是由seqidno：105涵盖的第三结构域。图8：与人fcrn的结合的基于表面等离子体共振(spr)的测定。在spr(biacore)实验中测试构建体d9f、t2g、d3l、t7i和k6c各自结合人fcrn的能力。测量所有构建体在注射阶段期间的最大结合作为相应的应答单位(ru)，其等同于由于结合构建体而在fcrn涂覆的cm5芯片上的分子量增加。所有构建体都一式两份测量。图8a和8b绘示了重复测定的平均值。图9：在spr(biacore)实验中测试构建体d9f、t2g、d3l、t7i和k6c和人iggl-к抗体mt201各自结合人fcrn的能力。测量所有构建体在注射阶段期间的最大结合作为相应的应答单位(ru)，其等同于由于结合构建体而在fcrn涂覆的cm5芯片上的分子量增加。所有构建体都一式两份测量。绘示了重复测定的平均值，包括标准偏差误差杠。发明详述除了本发明的双特异性抗体构建体的显著延长的半衰期以外，特异性fc模式的融合也对本发明的抗体构建体的第一和第二结合结构域造成了令人惊讶的显著影响。因此，尽管t细胞接合抗体构建体的其他半衰期延长模式显示个别优选的特征，但选择本特异性fc模式允许提供通常显示稳健分子格式的广谱优选特征的双特异性分子，并且因此允许开发有前景的药物组合物。因此，本发明提供了一种抗体构建体，其包含：·结合到bcma的第一结构域，·结合到人和/或猕猴cd3ε；链的细胞外表位的第二结构域；和·包含两个多肽单体的第三结构域，各多肽单体包含铰链、ch2结构域和ch3结构域，其中所述两个多肽单体通过肽接头彼此融合。术语“抗体构建体”是指其中结构和/或功能是基于抗体、例如全长或完整免疫球蛋白分子的结构和/或功能的分子，和/或是从抗体或其片段的可变重链(vh)和/或可变轻链(vl)结构域提取出的分子。因此，抗体构建体能够结合到其特异性靶标或抗原。此外，根据本发明的抗体构建体的结合结构域包含允许靶结合的抗体的最低结构要求。这种最低要求可以例如通过存在至少三个轻链cdr(即vl区的cdr1、cdr2和cdr3)和/或三个重链cdr(即vh区的cdr1、cdr2和cdr3)、优选全部六个cdr来定义。定义抗体的最小结构要求的替代方法是分别定义特异性靶标结构内的抗体表位、构成表位区(表位簇)的靶蛋白的蛋白结构域或通过参考与所定义抗体的表位竞争的特异性抗体。根据本发明的构建体所基于的抗体包括例如单克隆、重组、嵌合、去免疫、人源化和人抗体。根据本发明的抗体构建体的结合结构域可以例如包含上文提及的cdr组。优选地，那些cdr包含在抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)的框架中；但是，其不一定包含两者。fd片段具有例如两个vh区，并且经常保留了完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体片段、抗体变体或结合结构域的格式的其他实例包括(1)fab片段，即具有vl、vh、cl和ch1结构域的单价片段；(2)f(ab′)2片段，即具有在铰链区由二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(3)具有两个vh和ch1结构域的fd片段；(4)具有抗体单臂的vl和vh结构域的fv片段，(5)具有vh结构域的dab片段(ward等，(1989)nature341：544-546)；(6)分离的互补决定区(cdr)，和(7)单链fv(scfv)，后者是优选的(例如，源自scfv文库)。根据本发明的抗体构建体的实施方案的实例描述于以下中：例如wo00/006605、wo2005/040220、wo2008/119567、wo2010/037838、wo2013/026837、wo2013/026833、us2014/0308285、us2014/0302037、wo2014/144722、wo2014/151910和wo2015/048272。全长抗体的片段(例如vh、vhh、vl、(s)dab、fv、fd、fab、fab’、f(ab′)2或“rigg”(“半抗体”))也在“结合结构域”或“结合的结构域”的定义内。根据本发明的抗体构建体还可以包含抗体的修饰片段，也称为抗体变体，诸如scfv、二-scfv或二(双)-scfv、scfv-fc、scfv-拉链、scfab、fab2、fab3、双链抗体、单链双抗体、串联双链抗体(tandab)、串联二-scfv、串联三-scfv、“多价抗体”(例如三价抗体或四价抗体)，以及单一结构域抗体(例如纳米抗体)或单一可变结构域抗体，其仅包含一个可变结构域，可以是独立于其他v区或结构域而特异性结合抗原或表位的vhh、vh或vl。如本文所用，术语“单链fv”、“单链抗体”或“scfv”是指单一多肽链抗体片段，其包含来自重链和轻链的可变区，但无恒定区。通常，单链抗体进一步包含vh和vl结构域之间的多肽接头，其使其能够形成允许抗原结合的所需结构。单链抗体详细论述于以下中：pluckthuninthepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburg和moore编辑，springer-verlag，newyork，第269-315页(1994)。产生单链抗体的各种方法是已知的，包括以下中所描述的那些：美国专利号4,694,778和5,260,203；国际专利申请公开号wo88/01649；bird(1988)science242：423-442；huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：5879-5883；ward等(1989)nature334：54454；skerra等(1988)science242：1038-1041。在具体实施方案中，单链抗体还可以是双特异性的、多特异性的、人和/或人源化的和/或合成的。此外，术语“抗体构建体”的定义包括单价、二价和多价(polyvalent/multivalent)构建体，以及因此特异性结合到仅两个抗原结构的双特异性构建体，以及通过不同的结合结合域特异性结合超过两个(例如三个、四个或更多个)抗原结构的多特异性(polyspecific/multispecific)构建体。此外，术语“抗体构建体”的定义包括仅由一条多肽链组成的分子以及由超过一条多肽链组成的分子，所述链可以是相同的(同源二聚体、同源三聚体或同源寡聚物)或不同的(异源二聚体、异源三聚体或异源寡聚物)。上文鉴定的抗体和其变体或衍生物的实例尤其描述于以下中：harlow和lane，antibodiesalaboratorymanual，cshlpress(1988)和usingantibodies：alaboratorymanual，cshlpress(1999)，kontermann和dübel，antibodyengineering，springer，第2版，2010和little，recombinantantibodiesforimmunotherapy，cambridgeuniversitypress2009。如本文所用，术语“双特异性”是指“至少双特异性”的抗体构建体，即其至少包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合到一种抗原或靶标(此处为bcma)，并且第二结合结构域结合到另一抗原或靶标(此处为cd3)。因此，根据本发明的抗体构建体包含针对至少两种不同抗原或靶标的特异性。例如，第一结构域优选不结合到本文所述的一种或多种物种的cd3ε的细胞外表位。术语“靶细胞表面抗原”是指由细胞表达的抗原结构，其存在于细胞表面，使得其可用于本文所述的抗体构建体。其可以是蛋白质，优选蛋白质的细胞外部分；或碳水化合物结构，优选蛋白质的碳水化合物结构，可如糖蛋白。其优选是肿瘤抗原。术语本发明的“双特异性抗体构建体”还涵盖多特异性抗体构建体，例如三特异性抗体构建体，后者包括三个结合结构域，或具有超过三种(例如四种、五种......)特异性的构建体。鉴于根据本发明的抗体构建体是(至少)双特异性的，其不是天然存在的并且其与天然存在的产物明显不同。因此，“双特异性”抗体构建体或免疫球蛋白是具有至少两个具有不同特异性的不同结合侧的人工杂交抗体或免疫球蛋白。双特异性抗体构建体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或fab′片段的连接。参见例如songsivilai和lachmann，clin.exp.immunol.79：315-321(1990)。本发明的抗体构建体的至少两个结合结构域和可变结构域(vh/vl)可以包含或可以不包含肽接头(间隔肽)。根据本发明，术语“肽接头”包含如下氨基酸序列：通过其，本发明的抗体构建体的一个(可变和/或结合)结构域和另一(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列彼此连接。肽接头也可以用于将第三结构域与本发明的抗体构建体的其他结构域融合。所述肽接头的基本技术特征在于其不包含任何聚合活性。合适的肽接头是在美国专利4,751,180和4,935,233或wo88/09344中描述的那些。肽接头也可用于将其他结构域或模块或区(例如半衰期延长结构域)连接到本发明的抗体构建体。本发明的抗体构建体优选为“体外产生的抗体构建体”。这个术语是指根据上述定义的抗体构建体，其中在非免疫细胞选择、例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其中可以测试候选序列与抗原结合的能力的任何其他方法中产生可变区(例如，至少一个cdr)的全部或一部分。因此，这个术语优选排除仅由动物免疫细胞中基因组重排产生的序列。“重组抗体”是通过使用重组dna技术或基因工程制得的抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”(mab)或单克隆抗体构建体是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除了可少量存在的可能的天然存在的突变和/转译后修饰(例如，异构化、酰胺化)外，包含个别抗体的群体相同。与通常包括针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，单克隆抗体针对抗原上的单一抗原侧或决定簇具有高度特异性。除了其特异性外，单克隆抗体的优点在于其通过杂交瘤培养物合成，因此不会被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”将抗体的特征指示为从基本上均质的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。对于单克隆抗体的制备，可以使用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。例如，待使用的单克隆抗体可以通过koehler等，nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法来制得，或可以通过重组dna方法制得(参见例如美国专利号4,816,567)。用以产生人单克隆抗体的其他技术的实例包括三源杂交瘤技术、人b细胞杂交瘤技术(kozbor，immunologytoday4(1983)，72)和ebv-杂交瘤技术(cole等，monoclonalantibodiesandcancertherapy，alanr.liss公司(1985)，77-96)。然后可以使用标准方法(例如酶联免疫吸附测定(elisa)和表面等离子体共振(biacoretm)分析)筛选杂交瘤以鉴定产生与指定抗原特异性结合的抗体的一种或多种杂交瘤。任何形式的相关抗原均可用作免疫原，例如重组抗原、天然存在形式、其任何变体或片段以及其抗原肽。如在biacore系统中采用的表面等离子体共振可用于提高结合到靶细胞表面抗原的表位的噬菌体抗体的效率(schier，humanantibodieshybridomas7(1996)，97-105；malmborg，j.immunol.methods183(1995)，7-13)。另一种制备单克隆抗体的示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体展示或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于以下中：例如，ladner等，美国专利号5,223,409；smith(1985)science228：1315-1317，clackson等，nature，352：624-628(1991)和marks等，j.mol.biol.，222：581-597(1991)。除了使用展示文库之外，还可以使用相关抗原来免疫非人动物，例如啮齿动物(例如小鼠、仓鼠，兔或大鼠)。在一个实施方案中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，有可能用人ig(免疫球蛋白)基因座的大片段来工程化小鼠抗体产生中缺乏的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以产生并选择衍生自具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见例如xenomousetm，green等(1994)naturegenetics7：13-21、us2003-0070185、wo96/34096和wo96/33735。单克隆抗体也可以从非人动物获得，并且然后使用本领域已知的重组dna技术进行修饰，例如人源化、去免疫、呈现嵌合等。修饰的抗体构建体的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和性成熟”抗体(参见例如hawkins等，j.mol.biol.254，889-896(1992)和lowman等，biochemistry30，10832-10837(1991))和具有改变的效应功能抗体突变体(参见例如美国专利5,648,260，kontermann和dübel(2010)，上述引文和little(2009)，上述引文)。在免疫学中，亲和性成熟是如下过程：通过其，在免疫应答的过程中b细胞产生与抗原的亲和性增加的抗体。由于反复暴露于相同的抗原，宿主会产生依次更大亲和性的抗体。像天然原型一样，体外亲和性成熟是基于突变和选择的原则。体外亲和性成熟已经成功地用于优化抗体、抗体构建体和抗体片段。使用辐射、化学诱变剂或易错pcr在cdr内引入随机突变。此外，遗传多样性可以通过链改组来增加。使用展示方法(例如噬菌体展示)进行两轮或三轮突变和选择通常会产具有在低纳摩尔范围内的亲和性的抗体片段。抗体构建体的氨基酸取代变化的优选类型涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个超变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生其的亲本抗体将具有改善的生物性质。产生这种取代变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和性成熟。简而言之，将几个超变区侧(例如6-7个侧)突变以在每侧产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体粒子展示为与每个粒子内包装的m13的基因iii产物的融合物。然后筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和性)，如本文所公开。为了鉴定用于修饰的候选超变区侧，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的超变区残基。或者或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定结合结构域与例如人bcma之间的接触点可能是有利的。根据本文阐述的技术，所述接触残基和相邻残基是用于取代的候选者。一旦产生了所述变体，就如本文所述对这组变体进行筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异性质的抗体用于进一步的开发。本发明的单克隆抗体和抗体构建体特定来说包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及所述抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要其赚钱所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；morrison等，morrisonetal.，proc.natl.acad.sci.usa，81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)和人恒定区序列的可变结构域抗原结合序列的“经初始化”的抗体。已经描述了多种制备嵌合抗体的方法。参见例如morrison等，proc.natl.acad.sclu.s.a.81：6851，1985；takeda等，nature314：452，1985，cabilly等，美国专利号4,816,567；boss等，美国专利号4,816,397；tanaguchi等，ep0171496；ep0173494；和gb2177096。通过例如wo98/52976或wo00/34317中公开的方法，抗体、抗体构建体、抗体片段或抗体变体也可以通过特异性缺失人t细胞表位(称为“去免疫化”的方法)而被修饰。简而言之，可以针对结合到ii类mhc的肽分析抗体的重链和轻链可变结构域；这些肽代表潜在的t细胞表位(如wo98/52976和wo00/34317中所定义)。为了检测潜在t细胞表位，可以应用称为“肽穿线”的计算机建模方法，并且另外针对vh和vl序列中存在的基序，可以搜索人mhcii类结合肽的数据库中，如wo98/52976和wo00/34317中所描述。这些基序与18种主要的mhcii类dr同种异型中的任一种结合，并且因此构成潜在t细胞表位。检测到的潜在t细胞表位可以通过取代可变结构域中的少量氨基酸残基来消除，或者优选通过单个氨基酸取代来消除。通常进行保守取代。通常但不排他地，可以使用人种系抗体序列中的位置共有的氨基酸。人种系序列公开在以下中：例如tomlinson等(1992)j.moi.biol.227：776-798；cook，g.p.等(1995)immunol.today，第16(5)卷：237-242；和tomlinson等(1995)emboj.14：14：4628-4638。vbase目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由tomlinson，la.等编辑，mrccentreforproteinengineering，cambridge，uk)。这些序列可以用作人序列的来源，例如用于框架区和cdr。也可以使用共有的人框架区，例如如美国专利号6,300,064中所描述。“人源化”抗体、抗体构建体、其变体或片段(例如fv、fab、fab′、f(ab′)2或抗体的其他抗原结合子序列)是主要人序列的抗体或免疫球蛋白，所述序列含有(a)衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。对于大部分来说，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的超变区(也称为cdr)的残基被来自非人(例如啮齿类)物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)的具有所需特异性、亲和性和能力的超变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv构架区(fr)残基被相应的非人残基置换。此外，本文使用的“人源化抗体”还可以包含既不存在于受体抗体也不存在于供体抗体中的残基。进行这些修改以进一步改进和优化抗体性能。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于其他详情，参见jones等，nature，321：522-525(1986)；reichmann等，nature，332：323-329(1988)；和presta，curr.op.struct.biol.，2：593-596(1992)。人源化抗体或其片段可以通过用人fv可变结构域的等效序列置换不直接参与抗原结合的fv可变结构域的序列来产生。产生人源化抗体或其片段的示例性方法由以下提供：morrison(1985)science229：1202-1207；oi等(1986)biotechniques4：214；以及us5,585,089、us5,693,761、us5,693,762、us5,859,205和us6,407,213。那些方法包括分离、操作和表达编码来自重链或轻链中的至少一者的全部或部分免疫球蛋白fv可变结构域的核酸序列。所述核酸可以从产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤获得，如上所述，以及从其他来源获得。然后可以将编码人源化抗体分子的重组dna克隆到合适的表达载体中。人源化抗体还可以使用转基因动物(例如表达人重链和轻链基因但不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的小鼠)产生。winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例性cdr移植方法(美国专利号5,225,539)。特定人抗体的所有cdr都可以被非人cdr的至少一部分置换，或者仅一些cdr可以被非人cdr置换。仅需要替换人源化抗体结合预定的抗原所需的cdr数。可以通过引入保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变来优化人源化抗体。所述改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的几种技术中的任一种来制得(例如，teng等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.，80：7308-7312，1983；kozbor等，immunologytoday，4：7279，1983；olsson等，meth.enzymol.，92：3-16，1982和ep239400)。术语“人抗体”、“人抗体构建体”和“人结合结构域”包括具有抗体区(例如基本上对应于本领域已知的人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区或结构域，包括例如由kabat等(1991)(上述引文)描述的那些)的抗体、抗体构建体和结合结构域。本发明的人抗体、抗体构建体或结合结构域可以包括例如cdr中、特别是cdr3中不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体、抗体构建体或结合结构域可以具有至少1个、2个、3个、4个、5个或更多个被不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基置换的位置。然而，如本文使用的人抗体、抗体构建体和结合结构域的定义也涵盖“完全人抗体”，其仅包括非人工和/或遗传改变的人抗体序列，如可通过使用诸如xenomouse技术或系统衍生的那些。优选地，“完全人抗体”不包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的抗体构建体是“分离的”或“基本上纯的”抗体构建体。当用于描述本文公开的抗体构建体时，“分离的”或“基本上纯的”意指抗体构建体已从其生产环境的组分中鉴定、分离和/或回收。优选地，抗体构建体不与或基本上不与来自其生产环境的所有其他组分结合。其生产环境的污染物组分，例如由重组转染细胞产生的污染物组分，是通常会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。抗体构建体可以例如占给定样品中总蛋白质的至少约5重量％或至少约50重量％。应该理解，根据情况，分离的蛋白质可以占总蛋白质含量的5重量％至99.9重量％。通过使用诱导型启动子或高表达启动子，可以以显著更高的浓度制备多肽，从而使其以增加的浓度水平制备。该定义包括在本领域已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗体构建体。在优选的实施方案中，抗体构建体(1)可以通过使用旋杯式序列分析仪纯化至足以获得至少15个n-末端或内部氨基酸序列的残基的程度，或(2)可以通过sds-page在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色纯化至均一。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体构建体。术语“结合结构域”结合本发明表征了与靶分子(抗原)(此处分别为bcma和cd3)上的给定靶表位或给定靶侧特异性结合/相互作用/识别的结构域。第一结合结构域(识别bcma)的结构和功能以及优选还有第二结合结构域(识别cd3)的结构和/或功能是基于抗体、例如全长或完整免疫球蛋白分子的结构和/或功能，和/或是从抗体或其片段的可变重链(vh)和/或可变轻链(vl)结构域中提取。优选地，第一结合结构域的特征在于存在三个轻链cdr(即vl区的cdr1、cdr2和cdr3)和/或三个重链cdr(即vh区的cdr1、cdr2和cdr3)。第二结合结构域优选还包含允许靶结合的抗体的最低结构要求。更优选地，第二结合结构域包含至少三个轻链cdr(即vl区的cdr1、cdr2和cdr3)和/或三个重链cdr(即vh区的cdr1、cdr2和cdr3)。设想第一和/或第二结合结构域是通过噬菌体展示或文库筛选方法产生或获得，而不是通过将来自预先存在的(单克隆)抗体的cdr序列移植到支架中产生或获得。根据本发明，结合结构域呈一种或多种多肽的形式。所述多肽可以包括蛋白质部分和非蛋白质部分(例如化学接头或化学交联剂，例如戊二醛)。蛋白质(包括其片段、优选生物活性片段和通常具有少于30个氨基酸的肽)包含通过共价肽键彼此偶联的两个或更多个氨基酸(产生氨基酸链)。如本文所用的术语“多肽”描述了一组分子，其通常由超过30个氨基酸组成。多肽可以进一步形成多聚体，例如二聚体、三聚体和更高级的寡聚物，即由多于一个多肽分子组成。形成所述二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此，所述多聚体的相应的更高级结构称为同源二聚体或异源二聚体、同源三聚体或异源三聚体等。异源多聚体的实例是在其天然形式下由两条相同的轻链多肽链和两条相同的重链多肽链组成的抗体分子。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”也指天然修饰的肽/多肽/蛋白质，其中修饰是例如通过转译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)来实现。当在本文中提及时，“肽”、“多肽”或“蛋白质”也可以是化学修饰的，例如聚乙二醇化的。所述修饰在本领域中是公知的并且在下文描述。优选地，结合到bcma的结合结构域和/或结合到cd3ε的结合结构域是人结合结构域。包含至少一个人结合结构域的抗体和抗体构建体避免了与具有非人(例如啮齿动物(例如鼠类、大鼠、仓鼠或兔)))可变区和/或恒定区的抗体或抗体构建体有关的一些问题。所述啮齿动物衍生的蛋白质的存在可导致抗体或抗体构建体快速清除或可导致患者产生针对抗体或抗体构建体的免疫应答。为了避免使用啮齿动物衍生的抗体或抗体构建体，可以通过将人抗体功能引入啮齿动物中以使啮齿动物产生完全人抗体来产生人或完全人抗体/抗体构建体。在yac中克隆和重构兆碱基大小的人基因座并将其引入小鼠种系的能力为阐明非常大或粗略定位的基因座的功能组分以及产生有用的人疾病模型提供了强有力的方法。此外，使用所述技术将小鼠基因座取代为其人等效物可以提供关于人基因产物在发育过程中的表达和调节、其与其他系统的通信以及其参与疾病诱导和发展的独特见解。所述策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(ig)基因座引入其中内源ig基因已经失活的小鼠中提供了研究抗体的程序化表达和组装的根本机制以及其在b细胞发育中的作用的机会。此外，所述策略可以为完全人单克隆抗体(mab)的产生提供理想来源-这是满足人疾病中抗体疗法的前景的重要里程碑。预期完全人抗体或抗体构建体将小鼠或小鼠衍生的mab所固有的免疫原性和变应性应答最小化，从而增加施用的抗体/抗体构建体的功效和安全性。预计使用完全人抗体或抗体构建体可以在治疗需要重复施用化合物的慢性和复发性人疾病(例如炎症、自体免疫和癌症)中提供显著的优势。实现这一目标的一种方法是用人ig基因座的大片段工程化小鼠抗体产生中缺乏的小鼠品系，预期所述小鼠在不存在小鼠抗体的情况下会产生大量人抗体。大的人ig片段将保留大的可变基因多样性以及抗体产生和表达的适当调节。通过利用小鼠机制进行抗体多样化和选择以及缺乏对人蛋白质的免疫耐受性，在这些小鼠品系中复制的人抗体库应产生针对任何感兴趣的抗原(包括人抗原)的高亲和性抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地产生和选择具有所需特异性的抗原特异性人mab。结合第一种xenomouse小鼠品系的产生证实了这个一般策略(参见green等，naturegenetics7：13-21(1994))。用含有人重链基因座和к轻链基因座的分别245kb和190kb大小的种系构型片段的酵母人工染色体(yac)工程化xenomouse品系，所述片段含有核心可变区和恒定区序列。证明含有人ig的yac与小鼠系统相容以重排和表达抗体，并且能够取代失活的小鼠ig基因。这通过其诱导b细胞发育、产生完全人抗体的成人样人库和产生抗原特异性人mab的能力来证实。这些结果还表明，引入含有更多数量的v基因、额外的调控元件和人ig恒定区的更大部分的人ig基因座可基本上概括作为对感染和免疫的人体液应答的特征的完整库。green等的工作最近扩展到通过分别引入兆碱基大小的人重链基因座和к轻链基因座的种系构型yac片段来引入大于约80％的人抗体库。参见mendez等naturegenetics15：146-156(1997)和美国专利申请系列号08/759,620。xenomouse小鼠的产生进一步讨论和描绘于以下中：美国专利申请系列号07/466,008、系列号07/610,515、系列号07/919,297、系列号07/922,649、系列号08/031,801、系列号08/112,848、系列号08/234,145、系列号08/376,279、系列号08/430,938、系列号08/464,584、系列号08/464,582、系列号08/463,191、系列号08/462,837、系列号08/486,853、系列号08/486,857、系列号08/486,859、系列号08/462,513、系列号08/724,752和系列号08/759,620；以及美国专利号6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598；以及日本专利号3068180b2、3068506b2和3068507b2。还参见mendez等naturegenetics15：146-156(1997)以及green和jakobovitsj.exp.med.188：483-495(1998)、ep0463151b1、wo94/02602、wo96/34096、wo98/24893、wo00/76310和wo03/47336。在替代方法中，包括genpharminternational公司在内的其他公司已利用“微小基因座”方法。在微小基因座方法中，通过包括来自ig基因座的片段(单个基因)来模拟外源ig基因座。因此，将一个或多个vh基因、一个或多个dh基因、一个或多个jh基因、mu恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成为用于插入动物中的构建体。这种方法描述于以下中：美国专利号5,545,807，其颁予surani等；以及美国专利号5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458，其各自颁予lonberg和kay；和美国专利号5,591,669和6,023.010，其颁予krimpenfort和berns；美国专利号5,612,205、5,721,367和5,789,215，其颁予berns等；以及美国专利5,643,763，其颁予choi和dunn；以及genpharm国际美国专利申请系列号07/574,748、系列号07/575,962、系列号07/810,279、系列号07/853,408、系列号07/904,068、系列号07/990,860、系列号08/053,131、系列号08/096,762、系列号08/155,301、系列号08/161,739、系列号08/165,699、系列号08/209,741。也参见ep0546073b1、wo92/03918、wo92/22645、wo92/22647、wo92/22670、wo93/12227、wo94/00569、wo94/25585、wo96/14436、wo97/13852和wo98/24884和美国专利号5,981,175。进一步参见taylor等(1992)，chen等(1993)，tuaillon等(1993)，choi等(1993)，lonberg等(1994)，taylor等(1994)和tuaillon等(1995)，fishwild等(1996)。kirin也证实了从小鼠中产生人抗体，其中通过微细胞融合，引入了大片染色体或整个染色体。参见欧洲专利申请号773288和843961。xenerexbiosciences正在开发用于人抗体的潜在产生的技术。在这种技术中，用人淋巴细胞(例如b和/或t细胞)重构scid小鼠。然后将小鼠用抗原免疫并可产生针对所述抗原的免疫应答。参见美国专利号5,476,996、5,698,767和5,958,765。人抗小鼠抗体(hama)应答已经导致该行业制备嵌合或其他人源化抗体。然而，预计特别是在抗体的长期或多剂量利用中会观察到某些人抗嵌合抗体(haca)应答。因此，期望提供抗体构建体，其包含针对bcma的人结合结构域和针对cd3ε的人结合结构域以便消除hama或haca应答的问题和/或效应。术语“(特异性)结合到”、(特异性)识别”、“(特异性)针对”和“(特异性)与...反应”意指根据本发明，结合结构域与靶分子(抗原)(此处分别为bcma和cd3ε)上的给定表位或给定靶侧相互作用或特异性相互作用。术语“表位”是指结合结构域(例如抗体或免疫球蛋白，或抗体或免疫球蛋白的衍生物、片段或变体)特异性结合的抗原上的一侧。“表位”是抗原性的，并且因此术语表位在本文中有时也称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此，结合结构域是“抗原相互作用侧”。所述结合/相互作用也被理解为定义“特定识别”。“表位”可以由连续的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。“线性表位”是其中氨基酸一级序列包含识别的表位的表位。线性表位通常在独特的序列中包括至少3个或至少4个、更通常地至少5个或至少6个或至少7个、例如约8个至约10个氨基酸。与线性表位相反，“构象表位”是其中包含表位的氨基酸的一级序列不是所识别的表位的唯一限定成分的表位(例如，其中氨基酸的一级序列不一定被结合结构域识别的表位)。通常，构象表位包含相对于线性表位增加数量的氨基酸。关于构象表位的识别，结合结构域识别抗原、优选为肽或蛋白质或其片段的三维结构(在本发明的上下文中，一个结合结构域的抗原结构包括于靶细胞表面抗原蛋白内)。例如，当蛋白质分子折叠以形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽主链并置，使得抗体能够识别所述表位。确定表位构象的方法包括但不限于x射线晶体学、二维核磁共振(2d-nmr)光谱学和定向自旋标记和电子顺磁共振(epr)光谱学。以下描述了用于表位定位的方法：当人bcma蛋白中的区(连续氨基酸拉伸物)与其非人和非灵长类bcma(例如小鼠bcma，但其他如鸡、大鼠、仓鼠、兔等也是可能的)的相应区交换/替换等等)时，预计会发生结合结构域结合的降低，除非结合结构域对于所使用的非人、非灵长类bcma具有交叉反应性。与人bcma蛋白中各个区的结合相比，所述降低优选为至少10％、20％、30％、40％或50％；更优选至少60％、70％或80％，并且最优选90％、95％或甚至100％，其中与人bcma蛋白中各个区的结合设置为100％。设想前述人bcma/非人bcma嵌合体在cho细胞中表达。还设想人bcma/非人bcma嵌合体与不同膜结合蛋白(例如epcam)的跨膜结构域和/或细胞质结构域融合。在用于表位定位的替代或额外的方法中，可以产生几种截短形式的人bcma细胞外结构域以确定由结合结构域识别的特定区。在这些截短形式中，不同的细胞外bcma结构域/亚结构域或区从n-末端开始逐步缺失。设想截短的bcma形式可以在cho细胞中表达。还设想截短的bcma形式可以与不同膜结合蛋白(例如epcam)的跨膜结构域和/或细胞质结构域融合。还设想截短的bcma形式可以在其n-末端涵盖信号肽结构域，例如源自小鼠igg重链信号肽的信号肽。此外设想，截短的bcma形式可以在其n-末端(在信号肽后)涵盖v5结构域，其允许验证其在细胞表面上的正确表达。预计对不再涵盖由结合结构域识别的bcma区的那些截短的bcma形式会发生结合减少或丧失。结合减少优选为至少10％、20％、30％、40％、50％；更优选至少60％、70％、80％，并且最优选90％、95％或甚至100％，其中将与整个人bcma蛋白(或其细胞外区或结构域)的结合设置为100。确定bcma的特定残基对抗体构建体或结合结构域的识别的贡献的另一种方法是丙氨酸扫描(参见例如morrisonkl和weissga.curopinchembiol.2001年6月；5(3)：302-7)，其中待分析的每个残基例如通过定点诱变被丙氨酸置换。丙氨酸的使用是因为其具有非巨大的、化学惰性的甲基官能团，但其仍然模仿许多其他氨基酸所具有的二级结构参考。在需要保守突变残基的大小的情形下，有时可以使用巨大的氨基酸(例如缬氨酸或亮氨酸)。丙氨酸扫描是一项已经使用了很长一段时间的成熟技术。结合结构域与表位或包含表位的区之间的相互作用意味着结合结构域对特定蛋白或抗原(此处分别为bcma和cd3)上的表位/包含表位的区展现可观的亲和性，并且通常与bcma或cd3以外的蛋白质或抗原不展现显著反应性。“可观的亲和性”包括以约10-6m(kd)或更强的亲和性结合。优选地，当结合亲和性为约10-12至10-8m、10-12至10-9m、10-12至10-10m、10-11至10-8m、优选约10-11至10-9m时，认为结合具有特异性。可以尤其通过比较结合结构域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域与bcma或cd3以外的蛋白质或抗原的反应容易地测试所述结合结构域与靶是否特异性反应或结合。优选地，本发明的结合结构域基本上或几乎不结合除bcma或cd3以外的蛋白质或抗原(即，第一结合结构域不能结合除bcma以外的蛋白质，并且第二结合结构域不能结合除cd3以外的蛋白质)。设想根据本发明的抗体构建体的特征为与其他hle格式相比具有优异的亲和性特征。这种优异的亲和性结果表明体内半衰期延长。根据本发明的抗体构建体的更长的半衰期可以减少通常有助于改善患者依从性的施用的持续时间和频率。这是特别重要的，因为本发明的抗体构建体对高度虚弱的或甚至多重性癌症患者特别有益。术语“基本上/几乎不结合”或“不能结合”意指本发明的结合结构域不结合除bcma或cd3以外的蛋白质或抗原，即与除bcma或cd3以外的蛋白质或抗原不显示超过30％、优选不超过20％、更优选不超过10％、特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％的反应性，其中与bcma或cd3的结合分别设置为100％。据信特异性结合是通过结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特定基序实现的。因此，由于其一级、二级和/或三级结构以及所述结构的二级修饰的结果，实现了结合。抗原相互作用侧与其特异性抗原的特异性相互作用可导致所述侧与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用侧与其特异性抗原的特异性相互作用可以可选地或另外地导致信号的引发，例如由于诱导抗原构象的改变、抗原的寡聚化等。术语“可变”是指抗体或免疫球蛋白结构域展现其序列可变性并且参与确定特定抗体(即“可变结构域”)的特异性和结合亲和性的部分。可变重链(vh)和可变轻链(vl)的配对一起形成单一抗原结合位点。可变性在整个抗体的可变结构域中并不均匀分布；其集中在每个重链和轻链可变区的子结构域中。这些子结构域称为“超变区”或“互补决定区”(cdr)。可变结构域的更保守的(即非超变)部分称为“框架”区(frm或fr)，并为三维空间中的六个cdr提供支架以形成抗原结合表面。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个frm区(fr1、fr2、fr3和fr4)，其主要采用β-折叠构型，由三个超变区连接，从而形成环连接，并且在一些情形下形成β折叠结构的部分。每条链中的超变区由frm紧密靠近在一起，并与来自另一条链的超变区一起促进抗原结合侧的形成(参见kabat等，上述引文)。术语“cdr”以及其多个“cdr”是指其中三个构成轻链可变区(cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)的结合特征并且三个构成重链可变区(cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)的结合特征的互补决定区。cdr含有大部分负责抗体与抗原特异性相互作用的残基，并且因此有助于抗体分子的功能活性：其是抗原特异性的主要决定因素。准确定义的cdr边界和长度受制于不同的分类和编号系统。因此，cdr可以由kabat、chothia、contact或任何其他边界定义(包括本文所述的编号系统)来引用。尽管有不同的边界，但这些系统中的每一者在构成可变序列内所谓的“超变区”的方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些系统的cdr定义可以在相对于相邻框架区的长度和边界区域中不同。参见例如kabat(一种基于跨物种序列变异性的方法)、chothia(一种基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法)和/或maccallum(kabat等，上述引文；chothia等，j.moi.biol，1987，196：901-917；和maccallum等，j.moi.biol，1996，262：732)。表征抗原结合侧的另一标准是由oxfbrdmolecular的abm抗体建模软件使用的abm定义。参见例如proteinsequenceandstructureanalysisofantibodyvariabledomains.in：antibodyengineeringlabmanual(编辑：duebel，s.和kontermann，r.，springer-verlag，heidelberg)。就两种残基鉴定技术定义重叠区而非相同区而言，其可以组合以定义混合cdr。然而，根据所谓的kabat系统进行编号是优选的。通常，cdr形成可以分类为规范结构的环结构。术语“规范结构”是指由抗原结合(cdr)环所采用的主链构象。从比较结构研究中，已经发现六个抗原结合环中的五个仅具有有限的可用构象库。每个规范结构可以由多肽主链的扭转角来表征。因此，抗体之间的对应环可能具有非常相似的三维结构，尽管环的大多数部分具有高度的氨基酸序列可变性(chothia和lesk，j.moi.biol.，1987，196：901；chothia等，nature，1989，342：877；martin和thornton，j.moi.biol，1996，263：800)。此外，所采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类别的构象由环的长度和位于环内关键位置以及保守框架内(即，环外)的氨基酸残基决定。因此，可以基于这些关键氨基酸残基的存在对特定的规范类别进行分配。术语“规范结构”还可以包括关于抗体的线性序列的考虑因素，例如如由kabat编目(kabat等，上述引文)。kabat编号方案(系统)是以一致方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的广泛采用的标准，并且是本发明应用的优选方案，也如本文其他地方所提及。额外的结构考虑因素也可以用于确定抗体的规范结构。例如，kabat编号未完全反映的那些差异可以用chothia等的编号系统来描述，和/或通过其他技术(例如结晶学和二维或三维计算建模)来揭示。因此，可以将给定的抗体序列置于规范的类别中，所述类别尤其允许鉴定适当的底座序列(例如，基于期望在库中包括各种规范结构)。文献中描述了抗体氨基酸序列的kabat编号和如由chothia等(上述引文)描述的结构考虑因素以及其参与解释抗体结构的规范方面。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型在本领域中是公知的。关于抗体结构的综述，参见antibodies：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，harlow等编辑，1988。轻链的cdr3以及特别是重链的cdr3可构成轻链和重链可变区内抗原结合中最重要的决定簇。在一些抗体构建体中，重链cdr3似乎构成抗原与抗体之间主要的接触区域。其中单独改变cdr3的体外选择方案可用于改变抗体的结合性质或确定哪些残基有助于抗原的结合。因此，cdr3通常是抗体结合侧内分子多样性的最大来源。例如，h3可以短至两个氨基酸残基或多于26个氨基酸。在经典的全长抗体或免疫球蛋白中，每条轻(l)链通过一个共价二硫键与重(h)链连接，而两条h链通过一个或多个二硫键相互连接，此取决于h链同种型。最靠近vh的ch结构域通常命名为ch1。恒定(“c”)结构域不直接参与抗原结合，但呈现各种效应功能，例如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体活化。抗体的fc区包括在重链恒定区内，并且例如能够与位于细胞表面的fc受体相互作用。组装和体细胞突变后的抗体基因的序列高度改变，并且估计这些改变的基因编码10个10种不同抗体分子(immunoglobulingenes，第2版，jonio等编辑，academicpress，sandiego，ca，1995)。因此，免疫系统提供了免疫球蛋白库。术语“库”是指完全或部分衍生自至少一个编码至少一种免疫球蛋白的序列的至少一个核苷酸序列。序列可以通过重链的v、d和j片段以及轻链的v和j片段的体内重排来产生。或者，序列可以响应于发生重排、例如体外刺激而从细胞产生。或者，部分或全部序列可通过dna剪接、核苷酸合成、诱变和其他方法获得，参见例如美国专利5,565,332。库可以仅包括一个序列或可以包括多个序列，包括遗传多样性集合中的序列。术语“fc部分”或“fc单体”关于本发明意指包含至少一个具有ch2结构域功能的结构域和至少一个具有免疫球蛋白分子的ch3结构域功能的结构域的多肽。如从术语“fc单体”显而易见的，包含那些ch结构域的多肽是“多肽单体”。fc单体可以是至少包含排除重链的第一恒定区免疫球蛋白结构域(ch1)的免疫球蛋白恒定区的片段但至少保留一个ch2结构域的功能部分和一个ch3结构域的功能部分的多肽，其中ch2结构域在ch3结构域的氨基末端。在这个定义的优选方面，fc单体可以是包含ig-fc铰链区、ch2区和ch3区的一部分的多肽恒定区，其中铰链区在ch2结构域的氨基末端。设想本发明的铰链区促进二聚化。例如但不限于，所述fc多肽分子可以通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白区(当然产生两个fc多肽的二聚体)获得。在这个定义的另一方面，fc单体可以是包含ch2区和ch3区的一部分的多肽区。例如但不限于，所述fc多肽分子可以通过胃蛋白酶消化免疫球蛋白分子获得。在一个实施方案中，fc单体的多肽序列基本上与下列fc多肽序列相似：igg1fc区、igg2fc区、igg3fc区、igg4fc区、igmfc区、igafc区、igdfc区和igefc区。(参见例如padlan，molecularimmunology，31(3)，169-217(1993))。由于免疫球蛋白之间存在一些变化，并且仅为了清楚起见，fc单体是指iga、igd和igg的最后两个重链恒定区免疫球蛋白结构域和ige和igm的最后三个重链恒定区免疫球蛋白结构域。如上所提及，fc单体还可以包括在这些结构域的n-末端的柔性铰链。对于iga和igm，fc单体可以包括j链。对于igg，fc部分包含免疫球蛋白结构域ch2和ch3以及前两个结构域和ch2之间的铰链。尽管fc部分的边界可以改变，但包含功能铰链、ch2和ch3结构域的人igg重链fc部分的实例可以定义为例如包含残基d231(铰链结构域的残基-对应于下表1中的d234)到ch3结构域的羧基末端的p476，分别l476(对于igg4)，其中编号是根据kabat。通过肽接头彼此融合的两个fc部分或fc单体定义本发明的抗体构建体的第三结构域，其也可以被定义为scfc结构域。在本发明的一个实施方案中，设想如本文所公开的scfc结构域、彼此融合的fc单体分别仅包括在抗体构建体的第三结构域中。与本发明一致，igg铰链区可以通过使用如表1中示出的kabat编号的类比来鉴定。与上述一致，设想本发明的铰链结构域/区包含对应于根据kabat编号d234至p243的igg1序列拉伸物的氨基酸残基。同样设想，本发明的铰链结构域/区包含igg1铰链序列dkthtcppcp(seqidno：99)(对应于如下表1所示的d234至p243的拉伸物-也设想所述序列的变体，前提是铰链区仍然促进二聚化)或由所述igg1铰链序列组成。在本发明的优选实施方案中，通过n314x取代去除抗体构建体的第三结构域中ch2结构域的kabat位置314处的糖基化位点，其中x是除q之外的任何氨基酸。所述取代优选为n314g取代。在更优选的实施方案中，所述ch2结构域另外包含以下取代(根据kabat的位置)：v321c和r309c(这些取代在kabat位置309和321处引入结构域内半胱氨酸二硫桥)。还设想本发明的抗体构建体的第三结构域以氨基至羧基顺序包含以下或由以下组成：dkthtcppcp(seqidno：99)(即铰链)-ch2-ch3-接头-dkthtcppcp(seqidno：99)(即铰链)-ch2-ch3。在优选的实施方案中，上述抗体构建体的肽接头的特征在于氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser，即gly4ser(seqidno：1)；或其聚合物，即(gly4ser)x，其中x是5或更大的整数(例如5、6、7、8等或更大)，优选为6((gly4ser)6)。所述构建体可以进一步包含上述取代n314x、优选n314g和/或其他取代v321c和r309c。在前文定义的本发明抗体构建体的优选实施方案中，设想第二结构域与人和/或猕猴cd3ε链的细胞外表位结合。表1：铰链区的氨基酸残基的kabat编号在本发明其他实施方案中，铰链结构域/区包含igg2亚型铰链序列erkccvecppcp(seqidno：100)、igg3亚型铰链序列elktpldtthtcprcp(seqidno：101)或elktplgdtthtcprcp(seqidno：103)和/或igg4亚型铰链序列eskygppcpscp(seqidno：102)或由这些序列组成。igg1亚型铰链序列可以是以下中的一种：epkscdkthtcppcp(如表1和seqidno：104中所示)。这些核心铰链区因此也在本发明的背景下设想。iggch2和iggcd3结构域的位置和序列可以通过使用表2示出的kabat编号进行类比鉴定：表2：iggch2和ch3区的氨基酸残基的kabat编号在本发明的一个实施方案中，第一或两个fc单体的ch3结构域中粗体强调的氨基酸残基缺失。第三结构域的多肽单体(“fc部分”或“fc单体”)彼此融合的肽接头优选包含至少25个氨基酸残基(25、26、27、28、29、30等)。更优选地，这个肽接头包含至少30个氨基酸残基(30、31、32、33、34、35等)。接头也优选地包含至多40个氨基酸残基，更优选至多35个氨基酸残基，最优选恰好30个氨基酸残基。所述肽接头的优选实施方案的特征在于氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser，即gly4ser(seqidno：1)；或其聚合物，即(gly4ser)x，其中x是5或更大的整数(例如6、7或8)。优选整数为6或7，更优选整数为6。在使用接头来将第一结构域融合至第二结构域或将第一或第二结构域融合至第三结构域的情况下，这个接头优选地具有足以确保第一和第二结构域中的每一者都可以彼此独立地保留其差异结合特异性的长度和序列。对于连接本发明的抗体构建体中的至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽接头，仅包含几个氨基酸残基(例如12个氨基酸残基或更少)的那些肽接头是优选的。因此，12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽接头是优选的。具有少于5个氨基酸的设想的肽接头包含4、3、2或1个氨基酸，其中富含gly的接头是优选的。用于融合第一和第二结构域的肽接头的优选实施方案在seqidno：1中绘示。用于融合第二和第三结构域的肽接头的优选接头实施方案是(gly)4-接头，也称为g4-接头。在上述“肽接头”之一的上下文中特别优选的“单一”氨基酸是gly。因此，所述肽接头可以由单一氨基酸gly组成。在本发明的优选实施方案中，肽接头的特征在于氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser，即gly4ser(seqidno：1)；或其聚合物，即(gly4ser)x，其中x是1或更大的整数(例如2或3)。优选的接头在seqidno：1至12中绘示。所述肽接头的特征包括不存在二级结构的促进，是本领域已知的并且描述于例如dall′acqua等，(biochem.(1998)37，9266-9273)，cheadle等(molimmunol(1992)29，21-30)以及raag和whitlow(faseb(1995)9(1)，73-80)。此外不促进任何二级结构的肽接头是优选的。所述结构域彼此的连接可以例如通过基因工程提供，如实施例中所述。用于制备融合的和可操作连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达其的方法是本领域公知的(例如wo99/54440或sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，newyork，2001)。在本发明的抗体构建体的优选实施方案中，第一和第二结构域以选自(scfv)2、scfv-单一结构域mab、双链抗体和任何这些格式的寡聚物的格式形成抗体构建体。根据特别优选的实施方案，并如所附实施例所记载，本发明抗体构建体的第一和第二结构域是“双特异性单链抗体构建体”，更优选双特异性“单链fv”(scfv)。尽管fv片段的两个结构域vl和vh由单独的基因编码，但其可以使用重组方法通过合成接头接合，如上文所述，所述合成接头使其能够制得为单一蛋白质链，其中vl和vh区配对以形成单价分子；参见例如huston等(1988)proc.natl.acad.sciusa85：5879-5883)。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与整个或全长抗体相同的方式评估片段的功能。因此，单链可变片段(scfv)是免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)可变区的融合蛋白，通常利用约10至约25个氨基酸、优选约15至20个氨基酸的短接头肽酸连接。为了灵活性，接头通常富含甘氨酸，以及为了溶解性通常富含丝氨酸或苏氨酸，并且可以连接vh的n-末端和vl的c-末端，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性。双特异性单链抗体构建体在本领域中是已知的并描述于以下中：wo99/54440，mack，j.immunol.(1997)，158，3965-3970，mack，pnas，(1995)，92，7021-7025，kufer，cancerimmunol.immunother.，(1997)，45，193-197，blood，(2000)，95，6，2098-2103，brühl，immunol.，(2001)，166，2420-2426，kipriyanov，j.mol.biol.，(1999)，293，41-56。描述的用于产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778，kontermann和dübel(2010)，上述引文和little(2009)，上述引文)可以适用于产生特异性识别所选择的靶标单链抗体构建体。二价(bivalent)(也称为二价(divalent))或双特异性单链可变片段(具有格式(scfv)2的联-scfv或二-scfv可以通过连接两个scfv分子(例如利用如上文所述的接头)来工程化。如果这两个scfv分子具有相同的结合特异性，则所得(scfv)2分子将优选称为二价(即，对于相同的靶表位具有两个价)。如果两个scfv分子具有不同的结合特异性，则所得(scfv)2分子将优选称为双特异性。连接可通过产生具有两个vh区和两个vl区的单一肽链从而产生串联scfv来完成(参见例如kuferp.等，(2004)trendsinbiotechnology22(5)：238-244)。另一种可能性是产生具有接头肽的scfv分子，所述接头肽对于两个可变区来说太短以致于不能折叠在一起(例如约五个氨基酸)，从而迫使scfv二聚化。这种类型被称为双链抗体(参见例如hollinger，philipp等，(1993年7月)proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica90(14)：6444-8)。与本发明一致，第一、第二或第一和第二结构域可分别包含单一结构域抗体、可变结构域或单一结构域抗体的至少cdr。单一结构域抗体仅包含一个(单体)抗体可变结构域，其能够独立于其他v区或结构域而选择性结合特定抗原。第一单一结构域抗体是从骆驼中发现的重链抗体工程化而来，并且这些被称为vhh片段。软骨鱼类也具有重链抗体(ignar)，可从中获得称为vnar片段的单一结构域抗体。替代方法是将来自常见免疫球蛋白、例如来自人或啮齿动物的二聚体可变结构域分裂成单体，因此获得作为单一结构域抗体的vh或vl。尽管对单一结构域抗体的大多数研究目前都是基于重链可变结构域，但衍生自轻链的纳米抗体也显示出与靶表位特异性结合。单一结构域抗体的实例是所谓的sdab、纳米抗体或单一可变结构域抗体。因此，(单一结构域mab)2是由(至少)两个单一结构域单克隆抗体构成的单克隆抗体构建体，其单独地选自vh、vl、vhh和vnar。接头优选呈肽接头的形式。类似地，“scfv-单一结构域mab”是由至少一个如上所述的单一结构域抗体和一个如上所述的scfv分子构成的单克隆抗体构建体。此外，接头优选呈肽接头的形式。抗体构建体是否与另一给定抗体构建体竞争结合可以在竞争测定(例如竞争性elisa或基于细胞的竞争测定)中测量。也可以使用抗生物素蛋白偶联的微粒(珠粒)。与抗生物素蛋白涂覆的elisa板类似，当与生物素化蛋白质反应时，这些珠粒中的每一者都可用作可在其上进行测定的底物。将抗原涂覆到珠粒上，并且然后用第一抗体预涂覆。加入第二抗体并确定任何额外的结合。读出的可能手段包括流式细胞术。t细胞或t淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥核心作用的一类淋巴细胞(其本身是一类白细胞)。有几个t细胞亚组，其各自具有不同的功能。t细胞可以通过细胞表面上存在t细胞受体(tcr)而与其他淋巴细胞(例如b细胞和nk细胞)区分开。tcr负责识别与主要组织相容性复合体(mhc)分子结合的抗原，并由两种不同的蛋白质链构成。在95％的t细胞中，tcr由阿尔法(α)和贝塔(β)链组成。当tcr与抗原肽和mhc(肽/mhc复合物)接合时，t淋巴细胞通过一系列由相关酶、共受体、专门适配器分子和活化或释放的转录因子介导的生物化学事件而被活化。cd3受体复合物是一种蛋白质复合物，并且由四条链构成。在哺乳动物中，复合物含有cd3γ(伽马)链、cd3δ(德尔塔)链和两条cd3ε(伊普西龙)链。这些链与t细胞受体(tcr)和所谓的ζ(截塔)链缔合以形成t细胞受体cd3复合物并在t淋巴细胞中生成活化信号。cd3γ(伽马)、cd3δ(德尔塔)和cd3ε(伊普西龙)链是含有单一细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。cd3分子的细胞内尾部含有单一的保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或简称itam，其对于tcr的信号传导能力是必需的。cd3ε分子是一种多肽，其在人中由位于染色体11上的cd3e基因编码。cd3ε的最优选的表位包括在人cd3ε细胞外结构域的氨基酸残基1-27内。设想根据本发明的抗体构建体通常并且有利地显示更少的非特异性t细胞活化，其在特异性免疫疗法中是不需要的。这意味着副作用的风险降低。通过多特异性、至少双特异性抗体构建体募集t细胞，对靶细胞的重定向溶解涉及溶细胞突触形成和穿孔素和颗粒酶的递送。接合的t细胞能够连续靶细胞溶解，并且不受干扰肽抗原加工和呈递或克隆t细胞分化免疫逃逸机制的影响；参见例如wo2007/042261。可以以各种方式测量由本发明的抗体构建体介导的细胞毒性。效应细胞可以是例如刺激的富集的(人)cd8阳性t细胞或未刺激的(人)外周血单核细胞(pbmc)。如果靶细胞是猕猴起源的或表达的或被与第一结构域结合的猕猴bcma转染，则效应细胞也应该是猕猴起源的，如猕猴t细胞系，例如4119lnpx。靶细胞应该表达bcma(例如人或猕猴bcma)(至少其细胞外结构域)。靶细胞可以是用bcma(例如人或猕猴bcma)稳定或瞬时转染的细胞系(例如cho)。或者，靶细胞可以是bcma阳性天然表达子细胞系，例如人多发性骨髓瘤细胞系l363或nci-h929。对于在细胞表面表达更高水平的bcma的靶细胞系，预计ec50值通常更低。效应细胞与靶细胞(e∶t)比率通常约为10∶1，但也可改变。bcmaxcd3双特异性抗体构建体的细胞毒活性可以在51cr-释放测定(约18小时的孵育时间)或在基于facs的细胞毒性测定(约48小时的孵育时间)中侧链。也可对测定孵育时间(细胞毒性反应)进行修改。其他测量细胞毒性的方法对技术人员来说是熟知的，并且包括mtt或mts测定、基于atp的测定(包括生物发光测定)、磺基罗丹明b(srb)测定、wst测定、克隆生成测定和ecis技术。优选在基于细胞的细胞毒性测定中测量由本发明的bcmaxcd3双特异性抗体构建体介导的细胞毒活性。其也可以在51cr-释放测定中测量。其由ec50值表示，所述值对应于半数最大有效浓度(诱导在基线和最大值之间的中途的细胞毒性应答的抗体构建体的浓度)。优选地，bcmaxcd3双特异性抗体构建体的ec50值≤5000pm或≤4000pm，更优选≤3000pm或≤2000pm，甚至更优选≤1000pm或≤500pm，甚至更优选≤400pm或≤300pm，甚至更优选≤200pm，甚至更优选≤100pm，甚至更优选≤50pm，甚至更优选≤20pm或≤10pm，并且最优选≤5pm。上述给定的ec50值可以在不同的测定中测量。本领域技术人员知道，当刺激/富集的cd8+t细胞用作效应细胞时，与未刺激的pbmc相比，可以预计ec50值较低。此外可以预计，与低靶表达大鼠相比，当靶细胞表达高数量的bcma时，ec50值较低。例如，当使用刺激/富集的人cd8+t细胞作为效应细胞(并且bcma转染的细胞如cho细胞或bcma阳性人细胞系作为靶细胞)时，bcmaxcd3双特异性抗体构建体的ec50值优选≤1000pm，更优选≤500pm，甚至更优选≤250pm，甚至更优选≤100pm，甚至更优选≤50pm，甚至更优选≤10pm，并且最优选≤5pm。当人pbmc用作效应细胞时，bcmaxcd3双特异性抗体构建体的ec50值优选≤5000pm或≤4000pm(特别是当靶细胞是bcma阳性人细胞系时)，更优选≤2000pm(特别是当靶细胞是bcma转染的细胞如cho细胞时)，更优选≤1000pm或≤500pm，甚至更优选≤200pm，甚至更优选≤150pm，甚至更优选≤100pm，并且最优选≤50pm或更低。当使用猕猴t细胞系如lnpx4119作为效应细胞并且使用猕猴bcma转染的细胞系如cho细胞作为靶细胞系时，bcmaxcd3双特异性抗体构建体的ec50值优选≤2000pm或≤1500pm，更优选≤1000pm或≤500pm，甚至更优选≤300pm或≤250pm，甚至更优选≤100pm，并且最优选≤50pm。优选地，本发明的bcmaxcd3双特异性抗体构建体不诱导/介导溶解或基本上不诱导/介导诸如cho细胞或hl60、mes-sa或snu-16细胞的bcma阴性细胞的溶解。术语“不诱导溶解”、“基本上不诱导溶解”、“不介导溶解”或“基本不介导溶解”是指本发明的抗体构建体不诱导或介导超过30％、优选不超过20％、更优选不超过10％、特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％的bcma阴性细胞的溶解，其中将bcma阳性人细胞系的溶解设置为100％。这通常适用于浓度高达500nm的抗体构建体。本领域技术人员知道如何毫不费力地测量细胞溶解。而且，本说明书教导了如何测量细胞溶解的具体说明。单个bcmaxcd3双特异性抗体构建体的单体和二聚体同种型之间细胞毒性活性的差异称为“功效间隙”。该功效间隙可以例如计算为分子的单体和二聚体形式的ec50值之间的比率。本发明的bcmaxcd3双特异性抗体构建体的功效间隙优选≤5，更优选≤4，甚至更优选≤3，甚至更优选≤2，并且最优选≤1。本发明的抗体构建体的第一和/或第二(或任何其他)结合结构域优选对于灵长类哺乳动物目的成员具有种间特异性。种间特异性cd3结合结构域描述于例如wo2008/119567中。根据一个实施方案，除了分别与人bcma和人cd3结合之外，第一和/或第二结合结构域还将结合灵长类动物的bcma/cd3，灵长类动物包括(但不限于)新世界灵长类动物(例如狨毛猴、绒顶柽柳猴或松鼠猴)、旧世界灵长类动物(如狒狒和猕猴)、长臂猿和非人类人亚科。在本发明抗体构建体的一个实施方案中，第一结构域结合人bcma并进一步结合猕猴bcma(例如食蟹猴的bcma)，并且更优选结合表面猕猴细胞上表达的猕猴bcma。第一结构域对bcma、优选对人bcma的亲和性优选≤100nm或≤50nm，更优选≤25nm或≤20nm，更优选≤15nm或≤10nm，甚至更优选≤5nm，甚至更优选≤2.5nm或≤2nm，甚至更优选≤1nm，甚至更优选≤0.6nm，甚至更优选≤0.5nm，并且最优选≤0.4nm。亲和性可以例如在biacore测定或scatchard测定中测量。测定亲和性的其他方法也是本领域技术人员熟知的。第一结构域对猕猴bcma的亲和性优选≤15nm，更优选≤10nm，甚至更优选≤5nm，甚至更优选≤1nm，甚至更优选≤0.5nm，甚至更优选≤0.1nm，并且最优选≤0.05nm或甚至≤0.01nm。优选地，根据本发明的抗体构建体对结合猕猴bcma对人bcma[mabcma：hubcma]的亲和性间隙(如通过可如biacore或通过scatchard分析测定)＜100，优选＜20，更优选＜15，进一步优选＜10，甚至更优选＜8，更优选＜6，并且最优选＜2。根据本发明的抗体构建体对于结合猕猴bcma对人bcma的亲和性间隙的优选范围在0.1与20之间，更优选在0.2与10之间，甚至更优选在0.3与6之间，甚至更优选在0.5与3之间或在0.5与2.5之间，并且最优选在0.5与2之间或在0.6与2之间。本发明抗体构建体的第二结构域结合人cd3ε和/或猕猴cd3ε。在一个优选实施方案中，第二结构域进一步结合狨毛猴、绒顶柽柳猴或松鼠猴cd3ε。狨毛猴和绒顶柽柳猴都是属于狨亚科的新世界灵长类动物，而松鼠猴是属于悬猴科的新世界灵长类动物。优选的是，对于本发明的抗体构建体，结合人和/或猕猴cd3ε链的细胞外表位的第二结构域包含vl区，所述vl区包含选自以下的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3：(a)如wo2008/119567的seqidno：27所绘示的cdr-l1、如wo2008/119567的seqidno：28所绘示的cdr-l2和如wo2008/119567的seqidno：29所示的cdr-l3；(b)如wo2008/119567的seqidno：117所绘示的cdr-l1、如wo2008/119567的seqidno：118所绘示的cdr-l2和如wo2008/119567的seqidno：119所绘示的cdr-l3；和(c)如wo2008/119567的seqidno：153所绘示的cdr-l1，如wo2008/119567的seqidno：154所绘示的cdr-l2和如wo2008/119567的seqidno：155所绘示的cdr-l3。在本发明抗体构建体的进一步优选实施方案中，结合人和/或猕猴cd3ε链的细胞外表位的第二结构域包含vh区，所述vh区包含选自以下的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3：(a)如wo2008/119567的seqidn0：12所绘示的cdr-h1、如wo2008/119567的seqidno：13所绘示的cdr-h2和如wo2008/119567的seqidno：14所绘示的cdr-h3；(b)如wo2008/119567的seqidno：30所绘示的cdr-h1、如wo2008/119567的seqidno：31所绘示的cdr-h2和如wo2008/119567的seqidno：32所绘示的cdr-h3；(c)如wo2008/119567的seqidno：48所绘示的cdr-h1、如wo2008/119567的seqidno：49所绘示的cdr-h2和如wo2008/119567的seqidno：50所绘示的cdr-h3；(d)如wo2008/119567的seqidno：66所绘示的cdr-h1、如wo2008/119567的seqidno：67所绘示的cdr-h2和如wo2008/119567的seqidno：68所绘示的cdr-h3；(e)如wo2008/119567的seqidno：84所绘示的cdr-h1、如wo2008/119567的seqidno：85所绘示的cdr-h2和如wo2008/119567的seqidno：86所绘示的cdr-h3；(f)如wo2008/119567的seqidno：102所绘示的cdr-h1、如wo2008/119567的seqidno：103所绘示的cdr-h2和如wo2008/119567的seqidno：104所绘示的cdr-h3；(g)如wo2008/119567的seqidno：120所绘示的cdr-h1、如wo2008/119567的seqidno：121所绘示的cdr-h2和如wo2008/119567的seqidno：122所绘示的cdr-h3；(h)如wo2008/119567的seqidno：138所绘示的cdr-h1、如wo2008/119567的seqidno：139所绘示的cdr-h2和如wo2008/119567的seqidno：140所绘示的cdr-h3；(i)如wo2008/119567的seqidno：156所绘示的cdr-h1、如wo2008/119567的seqidno：157所绘示的cdr-h2和如wo2008/119567的seqidno：158所绘示的cdr-h3；和(j)如wo2008/119567的seqidno：174所绘示的cdr-h1、如wo2008/119567的seqidno：175所绘示的cdr-h2和如wo2008/119567的seqidno：176所绘示的cdr-h3。在本发明抗体构建体的一个优选实施方案中，将上述三组vlcdr与第二结合结构域内的上述十组vhcdr组合形成(30)组，每组包含1-3个cdr-l和1-3个cdr-h。优选的是，对于本发明的抗体构建体，结合cd3的第二结构域包含选自由wo2008/119567的seqidno：17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179或183中所绘示的那些或如seqidno：13中所绘示组成的组的vl区。还优选的是，结合cd3的第二结构域包含选自由wo2008/119567的seqidno：15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181所绘示的那些或如seqidno：14所绘示组成的组的vh区。更优选地，本发明的抗体构建体的特征在于结合cd3的第二结构域包含选自由以下组成的组的vl区和vh区：(a)如wo2008/119567的seqidno：17或21所绘示的vl区和如wo2008/119567的seqidno：15或19所绘示的vh区；(b)如wo2008/119567的seqidno：35或39所绘示的vl区和如wo2008/119567的seqidno：33或37所绘示的vh区；(c)如wo2008/119567的seqidno：53或57所绘示的vl区和如wo2008/119567的seqidno：51或55所绘示的vh区；(d)如wo2008/119567的seqidno：71或75所绘示的vl区和如wo2008/119567的seqidno：69或73所绘示的vh区；(e)如wo2008/119567的seqidno：89或93所绘示的vl区和如wo2008/119567的seqidno：87或91所绘示的vh区；(f)如wo2008/119567的seqidno：107或111所绘示的vl区和如wo2008/119567的seqidno：105或109所绘示的vh区；(g)如wo2008/119567的seqidno：125或129所绘示的vl区和如wo2008/119567的seqidno：123或127所绘示的vh区；(h)如wo2008/119567的seqidno：143或147所绘示的vl区和如wo2008/119567的seqidno：141或145所绘示的vh区；(i)如wo2008/119567的seqidno：161或165所绘示的vl区和如wo2008/119567的seqidno：159或163所绘示的vh区；和(j)如wo2008/119567的seqidno：179或183所绘示的vl区和如wo2008/119567的seqidno：177或181所绘示的vh区。与本发明的抗体构建体相关的还优选的是结合cd3的第二结构域，所述第二结构域包含如seqidno：13所绘示的vl区和如seqidno：14所绘示的vh区。根据本发明的抗体构建体的优选实施方案，第一和/或第二结构域具有以下格式：vh区和vl区对呈单链抗体(scfv)的格式。vh和vl区以vh-vl或vl-vh的顺序排列。优选的是，vh区位于接头序列的n-末端，并且vl区位于接头序列的c-末端。上述本发明抗体构建体的优选实施方案的特征在于结合cd3的第二结构域包含选自由wo2008/119567的seqidno：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187或如seqidno：15所绘示组成的组的氨基酸序列。还设想本发明的抗体构建体的第一结合结构域包括包含cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的vl区和包含cdr-h1、cdr-h2和cdr-3的vh区，其选自由以下组成的组：(a)如seqidno：48所绘示的cdr-l1、如seqidno：49所绘示的cdr-l2、如seqidno：50所绘示的cdr-l3、如seqidno：45所绘示的cdr-h1、如seqidno：46所绘示的cdr-h2和如seqidno：47所绘示的cdr-h3；(b)如seqidno：66所绘示的cdr-l1、如seqidno：67所绘示的cdr-l2、如seqidno：68所绘示的cdr-l3、如seqidno：63所绘示的cdr-h1、如seqidno：64所绘示的cdr-h2和如seqidno：65所绘示的cdr-h3；和(c)如seqidno：84所绘示的cdr-l1、如seqidno：85所绘示的cdr-l2、如seqidno：86所绘示的cdr-l3、如seqidno：81所绘示的cdr-h1、如seqidno：82所绘示的cdr-h2和如seqidno：83所绘示的cdr-h3。此外设想本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自以下组成的组的vh区和vl区：(a)如seqidno：51所绘示的vh区和如seqidno：52所绘示的vl区；(b)如seqidno：57所绘示的vh区和如seqidno：58所绘示的vl区；(c)如seqidno：69所绘示的vh区和如seqidno：70所绘示的vl区；(d)如seqidno：75所绘示的vh区和如seqidno：76所绘示的vl区；(e)如seqidno：87所绘示的vh区和如seqidno：88所绘示的vl区；和(f)如seqidno：93所绘示的vh区和如seqidno：94所绘示的vl区。此外设想，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自由seqidno：53、59、71、77、89或95所绘示的那些组成的组的氨基酸序列。抗体构建体的共价修饰也包括在本发明的范围内，并且通常但不总是在转译后进行。例如，通过使抗体构建体的特定氨基酸残基与能够与选择的侧链或n或c-末端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体构建体的几种类型的共价修饰引入分子中。最常见的半胱氨酰残基与α-卤代乙酸酯(和相应的胺，例如氯乙酸或氯乙酰胺)反应，以得到羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基还可通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙酰酯、n-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑。组氨酰残基是通过在ph5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应衍生出，因为这种物质对组氨酰侧链相对具有特异性。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；所述反应优选在ph6.0的0.1m二甲胂酸钠中进行。赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。用这些物质衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的效应。用于衍生含α-氨基的残基的其他合适试剂包括亚氨酸酯，例如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；硼氢化氯；三硝基苯磺酸；o-甲基异脲；2，4-戊二酮；以及转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。精氨酰残基通过与一种或多种常规试剂(其中苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮)反应而被修饰。由于胍官能团的高pka，精氨酸残基的衍生化要求反应在碱性条件下进行。此外，这些物质可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基基团反应。可以进行酪氨酰残基的特定修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰残基中。最通常地，n-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成o-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。使用125i或131i碘化酪氨酰残基以制备用于放射免疫测定的标记蛋白质，上述氯胺t法是合适的。羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(r′-n＝c＝n--r′)反应而选择性地修饰，其中r和r′任选为不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。用双功能试剂衍生化可用于将本发明的抗体构建体交联到水不溶性载体基质或表面以用于多种方法。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、n-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮基水杨酸的酯)、同双功能亚氨酸酯(包括二琥珀酰亚胺酯，例如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺，例如双-n-马来酰亚胺-1，8-辛烷)。衍生剂如3-[(对叠氮基苯基)二硫代]丙酰亚胺酸甲基酯产生能够在光存在下形成交联的可光活化中间体。或者，如美国专利号3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中所述的反应性水不溶性基质如溴化氰活化的碳水化合物和反应性底物用于蛋白质固定。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基通常分别脱酰胺成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。这些残基的任何形式都属于本发明的范围。其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(t.e.creighton，proteins：structureandmolecularproperties，w.h.freeman&co.，sanfrancisco，1983，第79-86页)、n-末端胺的乙酰化和任何c-末端羧基的酰胺化。包括在本发明范围内的抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域已知的，糖基化模式可以取决于蛋白质的序列(例如，下文讨论的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)或其中产生蛋白质的宿主细胞或生物体。下面讨论特定的表达系统。多肽的糖基化通常是n-连接的或o-连接的。n-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一者的存在产生潜在的糖基化位点。o-连接的糖基化是指将糖n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列以使其含有上述三肽序列中的一者或多者而方便地完成向抗体构建体添加糖基化位点(用于n-连接的糖基化位点)。还可以通过向起始序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或由一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来作出改变(用于o-连接的糖基化位点)。为了方便起见，抗体构建体的氨基酸序列优选通过dna水平的变化来改变，特别是通过在预选碱基处突变编码多肽的dna，从而产生将转译成所需氨基酸的密码子。增加抗体构建体上碳水化合物部分的数量的另一种手段是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。这些程序的有利之处在于其不需要在具有用于n-和o-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。根据所使用的偶联方式，糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，例如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯胺酸的那些，(e)芳族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于wo87/05330和aplin和wriston，1981，crccrit.rev.biochem.，第259-306页中。存在于起始抗体构建体上的碳水化合物部分的去除可以化学或酶促完成。化学去糖基化需要蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。该处理导致除连接糖(n-乙酰葡糖胺或n-乙酰半乳糖胺)以外的大部分或全部糖裂解，同时使多肽保持完整。化学去糖基化由hakimuddin等，1987，arch.biochem.biophys.259：52以及edge等，1981，anal.biochem.118：131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶实现，如thotakura等，1987，meth.enzymol.138：350所述。可以通过使用化合物衣霉素预防潜在糖基化位点的糖基化，如duskin等，1982，j.biol.chem.257：3105所述。衣霉素阻断蛋白质-n-糖苷键的形成。本文还涵盖抗体构建体的其他修饰。例如，抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括以美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所示出的方式将抗体构建体连接至各种非蛋白质聚合物，包括但不限于各种多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。另外，如本领域已知的，可以在抗体构建体内的不同位置进行氨基酸取代，例如以有利于添加聚合物(例如peg)。在一些实施方案中，本发明抗体构建体的共价修饰包括添加一个或多个标记。标记基团可以通过各种长度的间隔臂与抗体构建体偶联以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的并且可以用于进行本发明。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标签。一般来说，标记属于多种类别，此取决于将被检测的测定-以下实例包括但不限于：a)同位素标记，其可以是放射性同位素或重同位素，例如放射性同位素或放射性核素(例如3h、14c、15n、35s、89zr、90y、99tc、111in、125i、131i)b)磁性标记(例如磁性粒子)c)氧化还原活性部分d)光学染料(包括但不限于，生色团、磷光体和荧光团)，例如荧光基团(例如fitc、罗丹明、镧系元素磷光体)、化学发光基团和荧光团，其可以是“小分子”荧光或蛋白质荧光e)酶促基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)f)生物素化基团g)由第二报道基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合侧、金属结合结构域、表位标签等)“荧光标记”意指可以通过其固有的荧光性质检测到的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光黄、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤鲜红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿、二苯乙烯、荧虾黄、瀑布蓝j、德克萨斯红、iaedans、edans、bodipyfl、lc红640、cy5、cy5.5、lc红705、俄勒冈绿、alexa-fluor染料(alexafluor350、alexafluor430、alexafluor488、alexafluor546、alexafluor568、alexafluor594、alexafluor633、alexafluor660、alexafluor680)、瀑布蓝、瀑布磺和r-藻红素(pe)(molecularprobes，eugene，or)、fitc、罗丹明和德克萨斯红(pierce，rockford，il)、cy5、cy5.5、cy7(amershamlifescience，pittsburgh，pa)。合适的光学染料(包括荧光团)描述于richardp.haugland的molecularprobeshandbook中。合适的蛋白质荧光标记还包括但不限于绿色荧光蛋白，包括gfp的renilla、ptilosarcus或aequorea物质(chalfie等，1994，science263：802-805)；egfp(clontechlaboratories公司，genbank登录号u55762)、蓝色荧光蛋白(bfp，quantumbiotechnologies公司，1801demaisonneuveblvd.west，8thfloor，montreal，quebec，canadah3h1j9；stauber，1998，biotechniques24：462-471；heim等，1996，curr.biol.6：178-182)、增强型黄色荧光蛋白(eyfp，clontechlaboratories公司)、萤光素酶(ichiki等，1993，j.immunol.150：5408-5417)、β-半乳糖苷酶(nolan等，1988，proc.natl.acad.sci.u.s.a.85：2603-2607)和renilla(wo92/15673、wo95/07463、wo98/14605、wo98/26277、wo99/49019、美国专利号5,292,658、5,418,155、5,683,888、5,741,668、5,777,079、5,804,387、5,874,304、5,876,995、5,925,558)。本发明的抗体构建体还可以包含额外的结构域，其例如有助于分离分子或涉及分子的适应性药代动力学特性。有助于分离抗体构建体的结构域可以选自肽部分或次要引入的部分，其可以在分离方法(例如分离柱)中捕获。所述额外的结构域的非限制性实施方案包括称为myc-标签、hat-标签、ha-标签、tap-标签、gst-标签、几丁质结合结构域(cbd-标签)、麦芽糖结合蛋白(mbp-标签)、flag-标签、strep-标签以及其变体(例如strepii-标签)和his标签的肽部分。本文公开的所有抗体构建体都可包含his-标签结构域，其通常称为分子的氨基酸序列中优选5个、更优选6个his残基(六-组氨酸)的连续his残基的重复序列。his-标签可以位于例如抗体构建体的n-或c-末端，优选其位于c-末端。最优选地，六-组氨酸标签(hhhhhh)(seqidno：16)通过肽键连接至根据本发明的抗体构建体的c-末端。此外，plga-peg-plga的缀合系统可以与聚组氨酸标签组合用于缓释应用和改善的药代动力学特性。也涵盖本文所述的抗体构建体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体构建体的结合亲和性和/或其他生物性质。通过将适当核苷酸变化引入抗体构建体核酸或通过肽合成来制备抗体构建体的氨基酸序列变体。所有下面描述的氨基酸序列修饰都应产生仍然保留未修饰的亲本分子的所需生物活性(与bcma和cd3结合)的抗体构建体。术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有其本领域公认的定义的氨基酸，例如选自由以下组成的组的氨基酸：丙氨酸(ala或a)；精氨酸(arg或r)；天冬酰胺(asn或n)；天冬氨酸(asp或d)；半胱氨酸(cys或c)；谷氨酰胺(gln或q)；谷氨酸(glu或e)；甘氨酸(gly或g)；组氨酸(his或h)；异亮氨酸(he或i)：亮氨酸(leu或l)；赖氨酸(lys或k)；甲硫氨酸(met或m)；苯丙氨酸(phe或f)；脯氨酸(pro或p)；丝氨酸(ser或s)；苏氨酸(thr或t)；色氨酸(trp或w)；酪氨酸(tyr或y)；以及缬氨酸(val或v)，但可以根据需要使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸。通常，氨基酸可以分组为具有非极性侧链(例如ala、cys、he、leu、met、phe、pro、val)；具有带负电的侧链(例如asp、glu)；具有带正电的侧链(例如arg、his、lys)；或具有不带电的极性侧链(例如asn、cys、gln、gly、his、met、phe、ser、thr、trp和tyr)。氨基酸修饰包括例如抗体构建体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。只要最终构建体具有所需的特征，就可以进行缺失、插入和取代的任何组合，以获得最终构建体。氨基酸改变还可以改变抗体构建体的转译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。例如，可以在每个cdr中插入、取代或缺失1、2、3、4、5或6个氨基酸(当然，取决于其长度)，而可以在每个fr中插入、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸残基。优选地，氨基酸序列插入到抗体构建体中包括长度介于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基范围的氨基和/或羧基端融合物插入到含有100个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。也可以在本发明的抗体构建体的第三结构域内进行相应的修饰。本发明的抗体构建体的插入变体包括与酶的抗体构建体的n-末端或c-末端的融合或与多肽的融合。取代诱变最感兴趣的位点包括(但不限于)重链和/或轻链的cdr，特别是超变区，但也涵盖重链和/或轻链的fr改变。取代优选地是如本文所述的保守取代。优选地，可以在cdr中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，而可以在cdr中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25氨基酸，这取决于cdr或fr的长度。例如，如果cdr序列包含6个氨基酸，则设想这些氨基酸中的1个、2个或3个被取代。类似地，如果cdr序列包含15个氨基酸，则设想这些氨基酸中的1个、2个、3个、4个、5个或6个被取代。如cunningham和wellsinscience，244：1081-1085(1989)所述，用于鉴定作为优选诱变位置的抗体构建体的某些残基或区的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此，鉴定抗体构建体内的残基或靶标残基组(例如带电残基，例如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)置换以影响氨基酸与表位的相互作用。然后通过在取代位点处或为取代位点引入进一步的或其他变体来精炼那些展示对取代的功能敏感性的氨基酸位置。因此，尽管用于引入氨基酸序列变化的位点或区是预定的，但突变本身的性质无需预定。例如，为了分析或优化给定位点处突变的性能，可以在靶密码子或区进行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的抗体构建体变体以获得所需活性的最优组合。用于在具有已知序列的dna中的预定位点进行取代突变的技术是众所周知的，例如，m13引物诱变和pcr诱变。使用抗原结合活性(例如bcma或cd3结合)的测定来筛选突变体。一般来说，如果氨基酸在重链和/或轻链的一个或多个或所有cdr中被取代，则优选地，当时获得的“取代的”序列与“初始”cdr序列至少60％或65％、更优选70％或75％、甚至更优选80％或85％并且特别优选90％或95％相同。这意味着其取决于cdr与“取代”序列的相同程度的长度。例如，具有5个氨基酸的cdr优选与其取代序列80％相同，以便取代至少一个氨基酸。因此，抗体构建体的cdr可以与其取代的序列具有不同程度的同一性，例如cdrl1可以具有80％同一性，而cdrl3可以具有90％同一性。优选的取代(或置换)是保守取代。然而，只要抗体构建体保留其通过第一结构域结合bcma并通过第二结构域结合cd3ε的能力或其cdr与当时取代的序列具有同一性(与“初始”cdr序列至少60％或65％、更优选70％或75％、甚至更优选80％或85％并且特别优选90％或95％相同)，则设想出任何取代(包括非保守取代或来自下表3中列出的“示例性取代”中的一个或多个)。表3中以“优选取代”为标题显示保守取代。如果这种取代导致生物活性改变，则可以引入表3中命名为“示例性取代”的更多实质性改变，或者如下文参照氨基酸类别所进一步描述的，并且筛选产物以获得所需特征。表3：氨基酸取代本发明的抗体构建体的生物性质的实质性修饰是通过选择在维持以下的效应方面显著不同的取代来完成：(a)取代区域中的多肽主链的结构，例如呈片或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的大部分。基于常见的侧链性质将天然的残基分成几组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳香族：trp、tyr、phe。非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员换成另一类别。任何不参与维持抗体构建体的适当构象的半胱氨酸残基通常可以用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可向抗体添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是在抗体为抗体片段如fv片段的情况下)。对于氨基酸序列，序列同一性和/或相似性是通过使用本领域中已知的标准技术来确定，包括但不限于smith和waterman，1981，adv.appl..math.2：482的局部序列同一性算法；needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.48：443的序列同一性算法；pearson和lipman，1988，proc.nat.acad.sci.u.s.a.85：2444的的相似性搜索方法；这些算法的计算机化执行(gap、bestfit、fasta和tfasta，wisconsingenetics软件包中，geneticscomputergroup，575sciencedrive，madison，wis.)；由devereux等，1984，nucl.acidres.12：387-395描述的最佳拟合序列程序，优选使用默认设置，或通过检查。优选地，通过fastdb基于以下参数计算同一性百分比：失配罚分为1；空位罚分为1；空位大小罚分为0.33；以及连接罚分为30，“currentmethodsinsequencecomparisonandanalysis”，macromoleculesequencingandsynthesis，selectedmethodsandapplications，第127-149页(1988)，alanr.liss公司。有用的算法的实例是pileup。pileup使用渐进式成对比对从一组相关序列中创建多序列比对。其还可以绘制显示用于创建比对的聚类关系的树形图。pileup使用feng和doolittle，1987，j.mol.evol.35：351-360的渐进式比对方法的简单化；所述方法类似于higgins和sharp，1989，cabios5：151-153所述的方法。有用的pileup参数包括3.00的默认空位权重、0.10的默认空位长度权重和加权末端空位。有用的算法的另一实例是blast算法，其描述于如下中：altschul等，1990，j.mol.biol.215：403-410；altschul等，1997，nucleicacidsres.25：3389-3402；以及karin等，1993，proc.natl.acad.sci.u.s.a.90：5873-5787。特别有用的blast程序是从altschul等1996，methodsinenzymology266：460-480获得的wu-blast-2程序。wu-blast-2使用多个搜索参数，其中大部分都设置为默认值。可调参数设置为以下值：重叠间隔＝1，重叠分数＝0.125，字码阈值(t)＝ii。hsps和hsps2参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和特定数据库的组成来确立，根据所述特定数据库来搜索感兴趣的序列；但是，可以调整这些值以提高灵敏度。额外有用的算法是由altschul等，1993，nucl.acidsres.25：3389-3402报道的空位blast。空位blast使用blosum-62取代评分；阈值t参数设置为9；触发非空位扩展的双击方法，收取k的空位长度10+k的成本；xu设置为16，并且xg设置为40(用于数据库搜索阶段)以及67(用于算法的输出阶段)。空位比对由对应于约22位的评分触发。通常，各个变体cdr或vh/vl序列之间的氨基酸同源性、相似性或同一性与本文绘示的序列是至少60％，并且更通常至少65％或70％、更优选至少75％或80％、甚至更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的优选增加的同源性或同一性。以相似似的方式，相对于本文中鉴定的结合蛋白的核酸序列的“百分比(％)核酸序列同一性”被定义为候选序列中与抗体构建体的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。具体方法是利用设置为默认参数的wu-blast-2的blastn模块，重叠间隔和重叠分数分别设置为1和0.125。通常，编码各个变体cdr或vh/vl序列的核苷酸序列与本文绘示的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性是至少60％，并且更通常至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％和几乎100％的优选增加的同源性或同一性。因此，“变体cdr”或“变体vh/vl区”是与本发明的亲本cdr/vh/vl具有特定的同源性、相似性或同一性，并且共享生物功能，包括但不限于亲本cdr或vh/vl的特异性和/或活性的至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，根据本发明的抗体构建体对人种系的同一性百分比≥70％或≥75％，更优选≥80％或≥85％，甚至更优选≥90％，并且最优选≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％或甚至≥96％。与人抗体种系基因产物的同一性被认为是降低治疗期间治疗性蛋白引发患者中针对药物的免疫应答的风险的重要特征。hwang和foote(“immunogenicityofengineeredantibodies”；methods36(2005)3-10)证实了药物抗体构建体的非人部分的减少导致在治疗期间患者中诱导抗药物抗体的风险降低。通过比较无数临床评估的抗体药物和相应的免疫原性数据，显示以下趋势：抗体的v区的人源化使得蛋白质免疫原性(平均5.1％的患者)比携带未改变的非人v区的抗体(平均23.59％的患者)更低。因此，呈抗体构建体形式的基于v区的蛋白质治疗剂需要与人序列具有较高程度的同一性。出于确定种系同一性的目的，可使用vectornti软件将vl的v区与人种系v区段和j区段(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)的氨基酸序列进行比对并通过将相同的氨基酸残基除以vl的氨基酸残基总数(以百分数表示)计算氨基酸序列。对于vh区段(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)同样适用的，只是由于vhcdr3的高度多样性和缺少现有人种系vhcdr3比对配体，可以排除vhcdr3。然后可以使用重组技术来增加与人抗体种系基因的序列同一性。此外设想，本发明的bcmaxcd3双特异性抗体构建体与人baff-r和/或人taci(基本上)不结合或不交叉反应。此外，设想本发明的bcmaxcd3双特异性抗体构建体与猕猴/食蟹猴baff-r和/或猕猴/食蟹猴taci(基本上)不结合或不交叉反应。在又一实施方案中，本发明的双特异性抗体构建体在标准研究规模条件下、例如在标准的两步纯化过程中呈现出高单体产率。优选地，根据本发明的抗体构建体的单体产率为≥0.25mg/l上清液，更优选≥0.5mg/l、甚至更优选≥1mg/l并且最优选≥3mg/l上清液。同样地，可以确定抗体构建体的二聚体抗体构建体同种型的产率，并由此确定单体百分比(即，单体：(单体+二聚体))。单体和二聚体抗体构建体的生产力和计算的单体百分比可以例如在滚瓶中标准化研究规模生产的培养物上清液的sec纯化步骤中获得。在一个实施方案中，抗体构建体的单体百分比≥80％，更优选≥85％，甚至更优选≥90％，并且最优选≥95％。在一个实施方案中，抗体构建体的优选血浆稳定性(具有血浆的ec50与无血浆的ec50的比率)≤5或≤4，更优选≤3.5或≤3，甚至更优选≤2.5或≤2，并且最优选≤1.5或≤1。抗体构建体的血浆稳定性可以通过将构建体在37℃下在人血浆中孵育24小时、然后在51铬释放细胞毒性测定中测定ec50来测试。细胞毒性测定中的效应细胞可为刺激的富集的人cd8阳性t细胞。靶细胞可以是例如用人bcma转染的cho细胞。效应细胞与靶细胞(e∶t)比率可以选择为10∶1。用于此目的的人血浆库来源于由edta涂覆的注射器收集的健康供体的血液。通过离心去除细胞组分，并收集上层血浆相并随后汇集。作为对照，在rpmi-1640培养基中的细胞毒性测定之前立即稀释抗体构建体。血浆稳定性计算为ec50(血浆孵育后)与ec50(对照)的比率。此外优选地，本发明抗体构建体的单体到二聚体的转化较低。可以在不同条件下测量转化，并通过高性能尺寸排阻色谱进行分析。例如，抗体构建体的单体同种型的孵育可以在37℃以及例如100μg/ml或250μg/ml的浓度下在孵育箱中进行7天。在这些条件下，优选地，本发明抗体构建体显示出≤5％、更优选≤4％、甚至更优选≤3％、甚至更优选≤2.5％、甚至更优选≤2％、甚至更优选≤1.5％并且最优选≤1％或≤0.5％或甚至0％的二聚体百分比。还优选的是，本发明的双特异性抗体构建体在多个冷冻/解冻循环后以非常低的二聚体转化存在。例如，将抗体构建体单体在例如通用制剂缓冲液中调整至浓度为250μg/ml，并进行三个冷冻/解冻循环(在-80℃下冷冻30min，随后在室温下解冻30min)，然后进行高性能sec以确定已经转化成二聚体抗体构建体的最初单体抗体构建体的百分比。例如在三个冷冻/解冻循环之后，双特异性抗体构建体的二聚体百分比优选≤5％，更优选≤4％，甚至更优选≤3％，甚至更优选≤2.5％，甚至更优选≤2％，甚至更优选≤1.5％，并且最优选≤1％或甚至≤0.5％。本发明的双特异性抗体构建体优选显示出聚集温度≥45℃或≥50℃、更优选≥52℃或≥54℃、甚至更优选≥56℃或≥57℃并且最优选≥58℃或≥59℃的有利热稳定性。热稳定性参数可根据抗体聚集温度如下确定：将浓度为250μg/ml的抗体溶液转移到单次使用的比色杯中并置于动态光散射(dls)装置中。将样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热至70℃，恒定获取测量的半径。使用指示蛋白质和聚集物熔融的半径增加来计算抗体的聚集温度。或者，可通过差示扫描量热法(dsc)确定温度熔融曲线以确定抗体构建体的固有生物物理学蛋白质稳定性。这些实验使用microcalllc(northampton，ma，u.s.a)vp-dsc装置进行。从20℃至90℃记录与仅含有制剂缓冲液的样品相比含有抗体构建体的样品的能量摄取。例如在sec运行缓冲液中将抗体构建体调整至终浓度为250μg/ml。为了记录相应的熔融曲线，逐步升高整个样品温度。在每个温度t下记录样品和制剂缓冲液参考的能量吸收。将样品的能量吸收cp(千卡/摩尔/℃)减去参考的差针对相应的温度作图。熔融温度被定义为第一次最大能量吸收时的温度。还设想本发明的bcmaxcd3双特异性抗体构建体具有≤0.2、优选≤0.15、更优选≤0.12、甚至更优选≤0.1并且最优选≤0.08的浊度(在将纯化的单体抗体构建体浓缩至2.5mg/ml并过夜孵育后通过od340测量)。在又一实施方案中，根据本发明的抗体构建体在生理的或稍低的ph值、即约ph7.4至6.0下是稳定的。抗体构建体在非生理ph值(例如约ph6.0)下表现出的耐受性越大，从离子交换柱洗脱的抗体构建物相对于加载蛋白质的总量的回收率就越高。从约ph6.0的离子(例如阳离子)交换柱的抗体构建体的回收率优选≥30％，更优选≥40％，更优选≥50％，甚至更优选≥60％，甚至更优选≥70％，甚至更优选≥80％，甚至更优选≥90％，甚至更优选≥95％并且最优选≥99％。此外设想，本发明的双特异性抗体构建体呈现治疗功效或抗肿瘤活性。这可以例如在以下晚期人肿瘤异种移植模型实例中公开的研究中评估：在研究的第1天，将5×106个人靶细胞抗原(此处为bcma)阳性癌细胞系皮下注射到雌性nod/scid小鼠的右侧背侧。当平均肿瘤体积达到约100mm3时，通过将约2×107个细胞注射到动物的腹腔中将体外扩增的人cd3阳性t细胞移植到小鼠中。媒剂对照组1的小鼠不接受效应细胞，并用作与载体对照组2(接受效应细胞)比较的未移植对照，以监测单独的t细胞对肿瘤生长的影响。当平均肿瘤体积达到约200mm3时开始抗体治疗。治疗开始当天每个治疗组的平均肿瘤大小与任何其他组别均不应有统计学差异(方差分析)。用0.5mg/kg/天的bcmaxcd3双特异性抗体构建体通过静脉内浓注约15至20天对小鼠进行治疗。在研究期间通过卡尺测量肿瘤并通过肿瘤体积(tv)的组间比较评估进展。通过将tv计算为t/c％＝100×(分析组的中值tv)/(对照组2的中值tv)来确定肿瘤生长抑制t/c[％]。技术人员知道如何修改或调整该研究的某些参数，例如注射的肿瘤细胞的数量、注射部位、移植的人t细胞的数量、待施用的双特异性抗体构建体的量以及时间线，同时仍然获得有意义且可重现的结果。优选地，肿瘤生长抑制t/c[％]≤70或≤60，更优选≤50或≤40，甚至更优选≤30或≤20并且最优选≤10或≤5或甚至≤2.5。在本发明抗体构建体的优选实施方案中，抗体构建体是单链抗体构建体。同样在本发明抗体构建体的优选实施方案中，所述第三结构域以氨基至羧基的顺序包含：铰链-ch2-ch3-接头-铰链-ch2-ch3。在本发明的一个实施方案中，第三结构域的每个所述多肽单体具有与选自由以下组成的序列至少90％相同的氨基酸序列：seqidno：17-24。在优选实施方案或本发明中，每个所述多肽单体具有选自seqidno：17-24的氨基酸序列。同样在本发明的一个实施方案中，第三结构域的一个或优选每个(两个)多肽单体的ch2结构域包含结构域内半胱氨酸二硫桥。如本领域已知的，术语“半胱氨酸二硫桥”是指具有一般结构r-s-s-r的官能团。该键也称为ss键或二硫桥，并且通过半胱氨酸残基的两个硫醇基团的偶联来衍生。本发明的抗体构建体特别优选地将成熟抗体构建体中形成半胱氨酸二硫桥的半胱氨酸引入对应于309和321(kabat编号)的ch2结构域的氨基酸序列中。在本发明的一个实施方案中，去除ch2结构域的kabat位置314中的糖基化位点。优选地，通过n314x取代实现糖基化位点的去除，其中x是除q之外的任何氨基酸。所述取代优选为n314g取代。在更优选的实施方案中，所述ch2结构域另外包含以下取代(根据kabat的位置)v321c和r309c(这些取代在kabat位置309和321处引入结构域内半胱氨酸二硫桥)。假定本发明抗体构建体的优选特征例如与本领域已知的双特异性异源fc抗体构建体相比(图1b)可以特别涉及在ch2结构域中引入上述修饰。因此，对于本发明构建体优选地，本发明抗体构建体的第三结构域中的ch2结构域包含kabat位置309和321处的结构域内半胱氨酸二硫桥和/或kabat位置314处的糖基化位点是通过如上所述的n314x取代、优选通过n314g取代去除。在本发明的又一优选实施方案中，本发明抗体构建体的第三结构域中的ch2结构域包含kabat位置309和321处的结构域内半胱氨酸二硫桥，并且kabat位置314处的糖基化位点是通过n314g取代去除。最优选地，本发明抗体构建体的第三结构域的多肽单体具有选自由seqidno：17和18组成的组的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了抗体构建体，其中：(i)第一结构域包含两个抗体可变结构域，并且第二结构域包含两个抗体可变结构域；(ii)第一结构域包含一个抗体可变结构域，并且第二结构域包含两个抗体可变结构域；(iii)第一结构域包含两个抗体可变结构域，并且第二结构域包含一个抗体可变结构域；或(iv)第一结构域包含一个抗体可变结构域，并且第二结构域包含一个抗体可变结构域。因此，第一和第二结构域可以是各自包含两个抗体可变结构域(例如vh和vl结构域)的结合结构域。包含上文所述的两个抗体可变结构域的所述结合结构域的实例包含例如上文所述的fv片段、scfv片段或fab片段。或者，这些结合结构域中的一个或两个可以仅包含单一可变结构域。如上文所述的这种单一结构域结合结构域的实例包括例如仅包含一个可变结构域(其可以是独立于其他v区或结构域特异性结合抗原或表位的vhh、vh或vl)的纳米抗体或单一可变结构域抗体。在本发明抗体构建体的优选实施方案中，第一和第二结构域通过肽接头与第三结构域融合。上文已经描述了优选的肽接头，其特征在于氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser，即gly4ser(seqidno：1)；或其聚合物，即(gly4ser)x，其中x是1或更大的整数(例如2或3)。用于第一和第二结构域与第三结构域融合的特别优选的接头绘示于seqidno：1中。在优选实施方案中，本发明抗体构建体的特征在于以氨基至羧基的顺序包含：(a)第一结构域；(b)具有选自由seqidno：1-3组成的组的氨基酸序列的肽接头；(c)第二结构域；(d)具有选自由seqidno：1、2、3、9、10、11和12组成的组的氨基酸序列的肽接头；(e)第三结构域的第一多肽单体；(f)具有选自由seqidno：5、6、7和8组成的组的氨基酸序列的肽接头；以及(g)第三结构域的第二多肽单体。本发明抗体构建体包含结合到bcma、优选结合到bcma的细胞外结构域(ecd)的第一结构域。应理解，在本发明的上下文中，术语“结合到bcma的细胞外结构域”意味着结合结构域结合到在靶细胞表面上表达的bcma。因此，当根据本发明的第一结构域由天然表达细胞或细胞系和/或由用bcma转化或(稳定/瞬时)转染的细胞或细胞系表达时，所述第一结构域结合到bcma。在优选实施方案中，当bcma在体外结合测定(例如biacore或scatchard)中用作“靶”或“配体”分子时，第一结合结构域也结合到bcma。“靶细胞”可以是在其表面上表达bcma的任何原核或真核细胞；优选地靶细胞是作为人体或动物体的一部分的细胞，例如表达特定bcma的癌症或肿瘤细胞。优选地，第一结构域结合到人bcma/bcmaecd。优选的人bcma序列绘示于seqidno：41中，并且优选的人bcmaecd序列绘示于seqidno：42中。在又一优选实施方案中，其结合到猕猴bcma/bcmaecd。优选的猕猴bcma序列绘示于seqidno：43中，并且优选的猕猴bcmaecd序列绘示于seqidno：44中。根据最优选的实施方案，第一结构域结合到人和猕猴bcma/bcmaecd。“bcma细胞外结构域”或“bcmaecd”是指基本上不含bcma的跨膜和细胞质结构域的bcma区或序列。本领域技术人员应理解，根据本领域常规使用的用于鉴定疏水结构域的类型的标准鉴定本发明的bcma多肽鉴定的跨膜结构域。跨膜结构域的确切边界可以改变，但最有可能的是在本文具体提及的结构域的任一末端改变不超过约5个氨基酸。优选的全长bcma氨基酸序列绘示于seqidno：41中。优选的bcmaecd示于seqidno：42中。结合到bcma的优选结合结构域在wo2013/072406、wo2013/072415和wo2014/140248中公开。这些申请中描述的用于bcma的任何结合结构域可用于本发明的上下文中。在本发明的一个方面，抗体构建体以氨基至羧基的顺序包含：(a)具有选自由seqidno：53、59、71、77、89或95组成的组的氨基酸序列的第一结构域；(b)具有选自由seqidno：1-3组成的组的氨基酸序列的肽接头；(c)具有选自由wo2008/119567的seqidno：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187或seqidno：15组成的组的氨基酸序列的第二结构域；(d)具有选自由seqidno：1、2、3、9、10、11和12组成的组的氨基酸序列的肽接头；(e)具有选自由seqidno：17-24组成的组的多肽序列的第三结构域的第一多肽单体；(f)具有选自由seqidno：5、6、7和8组成的组的氨基酸序列的肽接头；以及(g)具有选自由seqidno：17-24组成的组的多肽序列的第三结构域的第二多肽单体。根据该优选实施方案，通过肽接头融合至第三结构域的第一和第二结构域包含选自由seqidno：53、59、71、77、89或95组成的组的序列。在一个方面，本发明抗体构建体的特征在于具有选自由seqidno：55、56、61、62、73、74、79、80、91、92、97和98组成的组的氨基酸序列。本发明进一步提供了编码本发明抗体构建体的多核苷酸/核酸分子。多核苷酸是由共价键合在链中的13个或更多个核苷酸单体构成的生物聚合物。dna(例如cdna)和rna(例如mrna)是具有不同生物功能的多核苷酸的实例。核苷酸是用作核酸分子如dna或rna的单体或亚单位的有机分子。核酸分子或多核苷酸可以为双链和单链的、线性的和圆形的。其优选包括在优选包括在宿主细胞中的载体中。所述宿主细胞例如在用本发明的载体或多核苷酸转化或转染后能够表达抗体构建体。为此目的，多核苷酸或核酸分子与控制序列可操作地连接。遗传密码是将遗传物质(核酸)内编码的信息转译成蛋白质的一组规则。在活细胞中的生物解码是通过以由mrna指定的顺序连接氨基酸的核糖体、使用trna分子携带氨基酸并一次读出mrna三个核苷酸来完成。该密码定义了这些核苷酸三联体的序列(称为密码子)如何指定在蛋白质合成期间接下来将添加哪种氨基酸。除了一些例外，核酸序列中的三核苷酸密码子指定单一氨基酸。由于绝大多数基因都使用完全相同的密码进行编码，因此此特定密码通常称为规范或标准遗传密码。虽然遗传密码决定给定编码区的蛋白质序列，但其他基因组区可能会影响这些蛋白质产生的时间和地点。此外，本发明提供了包含本发明的多核苷酸/核酸分子的载体。载体是用作将(外来)遗传物质转移到细胞中的媒剂的核酸分子。术语“载体”涵盖但不限于质粒、病毒、粘粒和人造染色体。通常，工程化载体包含复制起点、多克隆位点和可选标记物。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)和用作载体的“主链”的更大序列的dna序列。现代载体除转基因插入物和主链外还可涵盖额外的特征：启动子、遗传标记物、抗生素抗性、报道基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体尤其用于在靶细胞中表达转基因，并且通常具有控制序列。术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的dna序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合侧。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。当核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸是“可操作地连接的”。例如，如果将前序列或分泌前导序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的dna可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果定位核糖体结合侧以便于转译，则其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指所连接的dna序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读阶段。但是，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行接合来完成。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适配器或接头。“转染”是有意将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。转导通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。转染动物细胞通常涉及打开细胞膜中的瞬时孔或“洞”，以允许摄取材料。转染可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生脂质体来进行，所述脂质体与细胞膜融合并将其货物存放在其内部。术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌的非病毒转移，以及向非动物真核细胞(包括植物细胞)的转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，所述基因改变是因通过细胞膜从其周围直接摄取并随后纳入外源遗传物质(核酸分子)而产生。转化可以通过人为手段来实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态，这可能作为对诸如饥饿等环境条件和细胞密度的时间限制响应而发生。此外，本发明提供了用本发明的多核苷酸/核酸分子或载体转化或转染的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”或“受体细胞”旨在包括可以是或已经是载体、外源核酸分子和编码本发明抗体构建体的多核苷酸的受体和/或抗体构建体本身的受体的任何单个细胞或细胞培养物。通过转化、转染等将相应的材料引入细胞中。术语“宿主细胞”还旨在包括单细胞的后代或潜在后代。由于某些修饰可能由于天然的、意外的或故意的突变或由于环境影响而在后代中发生，所以所述后代事实上可能不会与亲本细胞完全相同(在形态或基因组或全部dna补体中)，但仍包括在本文所用术语的范围内。合适的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，并且还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，例如昆虫细胞和哺乳动物细胞，例如鼠类、大鼠、猕猴或人。本发明抗体构建体可以在细菌中产生。表达后，将本发明抗体构建体从大肠杆菌细胞糊中以可溶级分分离，并且可以通过例如亲和色谱和/或尺寸排除来纯化。最终纯化可以类似于纯化例如在cho细胞中表达的抗体的方法进行。除了原核生物以外，真核微生物(例如丝状真菌或酵母)是本发明抗体构建体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、物种和菌株在本文中通常可用且有用，例如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属宿主，例如乳酸克鲁维酵母(k.lactis)、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)(atcc12424)、保加利亚克鲁维酵母(k.bulgaricus)(atcc16045)、威客海姆克鲁维酵母(k.wickeramii)(atcc24178)、瓦替克鲁维酵母(k.waltii)(atcc56500)、果蝇克鲁维酵母(k.drosophilarum)(atcc36906)、耐热克鲁维酵母(k.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(k.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(ep402226)；巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)(ep183070)；念珠菌属(candida)；里氏木霉菌(trichodermareesia)(ep244234)；红面包霉菌(neurosporacrassa)；许旺酵母属(schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如链孢霉属(neurospora)、青霉属(penicillium)、弯颈霉属(tolypocladium)和曲霉属(aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(a.nidulans)和黑曲霉(a.niger)。用于表达本发明的糖基化抗体构建体的合适的宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了来自诸如草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃和斑蚊(aedesaegypti)(蚊子)、白线斑蚊(aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(bombyxmori)的宿主的许多杆状病毒株和变体以及相应的允许的昆虫宿主细胞。用于转染的各种病毒株是公众可获得的，例如加州苜蓿夜蛾(autographacalifornica)npv的l-1变体和家蚕npv的bm-5株，并且根据本发明，这些病毒可以用作本文的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。可用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见例如hiatt等，nature(1989)342：76-78，owen等(1992)bio/technology10：790-794，artsaenko等(1995)theplantj8：745-750，和fecker等(1996)plantmolbiol32：979-986。然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，并且培养物(组织培养物)中脊椎动物细胞的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由sv40(cos-7，atcccrl1651)转化的猴肾cv1系；人胚胎肾系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，graham等，j.genvirol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(bhk，atccccl10)；中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr(cho，urlaub等，proc.natl.acad.sci.usa77：4216(1980))；小鼠sertoli细胞(tm4，mather，biol.reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(cviatccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcccrl1587)；人宫颈癌细胞(hela，atccccl2)；犬肾细胞(mdck，atccccl34)；水牛鼠肝细胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺细胞(w138，atccccl75)；人肝细胞(hepg2，14138065)；小鼠乳房肿瘤(mmt060562，atccccl51)；tri细胞(mather等，annalsn.yacad.sci.(1982)383：44-68)；mrc5细胞；fs4细胞；和人肝癌细胞系(hepg2)。在又一实施方案中，本发明提供了用于产生本发明抗体构建体的方法，所述方法包括在允许表达本发明抗体构建体的条件下培养本发明的宿主细胞，并从培养物中回收所产生的抗体构建体。如本文所用，术语“培养”是指细胞在合适的条件下在培养基中的体外维持、分化、生长、增殖和/或繁殖。术语“表达”包括涉及产生本发明的抗体构建体的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、转译、转译后修饰和分泌。当使用重组技术时，抗体构建体可以在细胞内、在周质空间中产生，或者直接分泌到培养基中。如果抗体构建体在细胞内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤去除微粒碎片(宿主细胞或溶解的片段)。carter等bio/technology10：163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的程序。简而言之，在约30分钟内，在乙酸钠(ph3.5)、edta和苯甲基磺酰氟化物(pmsf)存在下使细胞糊解冻。细胞碎片可以通过离心去除。在抗体分泌到培养基中的情况下，通常首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器(例如amicon或milliporepellicon超滤单元)浓缩来自所述表达系统的上清液。任何前述步骤中可包括蛋白酶抑制剂(例如pmsf)以抑制蛋白水解，并可包括抗生素以防止外来污染物的生长。可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱回收或纯化从宿主细胞制备的本发明的抗体构建体。根据待回收的抗体，用于蛋白质纯化的其他技术(例如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相hplc、硅胶上的色谱、肝素sepharosetm上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上的色谱、色谱法聚焦、sds-page和硫酸铵沉淀)也可用。在本发明的抗体构建体包含ch3结构域的情况下，bakerbondabx树脂(j.t.baker，phillipsburg，nj)可用于纯化。亲和色谱是一种优选的纯化技术。亲和配体所连接的基质最通常是琼脂糖，但其他基质是可用的。机械稳定的基质(例如控制多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允许比琼脂糖所达成更快的流速和更短的处理时间。此外，本发明提供了包含本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体的药物组合物。对于本发明的药物组合物优选的是，抗体构建体的均质性≥80％，更优选≥81％、≥82％、≥83％、≥84％或≥85％，进一步优选≥86％、≥87％、≥88％、≥89％或≥90％，还更优选≥91％、≥92％、≥93％、≥94％或≥95％，最优选≥96％、≥97％、≥98％或≥99％。如本文所用，术语“药物组合物”涉及适合施用于患者、优选人患者的组合物。本发明特别优选的药物组合物包含优选治疗有效量的一种或多种本发明的抗体构建体。优选地，药物组合物还包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。本发明组合物可以包含药学上可接受的载剂。通常，如本文所用，“药学上可接受的载剂”意指任何和所有的水性和非水性溶液、无菌溶液、溶剂、缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液)、水、悬浮液、乳液(例如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、脂质体、分散介质和包衣，其与药物施用、特别是肠胃外施用相容。所述介质和物质在药物组合物中的使用在本领域中是公知的，并且包含所述载剂的组合物可以通过公知的常规方法配制。某些实施方案提供了药物组合物，其包含本发明的抗体构建体和另外一种或多种赋形剂，例如在本部分和本文其他地方说明性描述的那些赋形剂。就此而言，赋形剂可用于多种目的，例如调节制剂的物理、化学或生物性质，例如调节粘度和/或本发明的方法以提高有效性和/或稳定所述制剂和方法，防止由于例如在制造、运输、存储、使用前准备、施用和之后发生的压力而导致的降解和腐坏。在某些实施方案中，药物组合物可以含有用于修饰、维持或保存目的(例如组合物的ph、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透)的配制材料(参见remington′spharmaceuticalsciences，第18版(a.r.genrmo编辑)，1990，mackpublishing公司)。在所述实施方案中，合适的配制材料可以包括但不限于：·氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、2-苯丙氨酸，包括带电荷的氨基酸，优选赖氨酸、乙酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸盐和/或组氨酸·抗微生物剂，例如抗细菌剂和抗真菌剂·抗氧化剂，例如抗坏血酸、甲硫氨酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠；·缓冲液、缓冲液系统和缓冲剂，其用于将组合物保持在生理ph值或稍低的ph值下；缓冲液的实例是硼酸盐、碳酸氢盐、tris-hcl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸、琥珀酸盐、磷酸盐和组氨酸；例如约ph7.0-8.5的tris缓冲液；·非水性溶剂，例如丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)；·水性载剂，包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质；·生物可降解聚合物，例如聚酯；·增积剂，例如甘露醇或甘氨酸；·螯合剂，例如乙二胺四乙酸(edta)；·等渗和吸收延迟剂；·络合剂，例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)·填充剂；·单糖；双糖；和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可以是非还原糖，优选海藻糖，蔗糖、八硫酸盐、山梨醇或木糖醇；·(低分子量)蛋白质、多肽或蛋白质载剂，例如人或牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，优选是人来源的；·着色和调味剂；·含硫还原剂，例如谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油，[α]-单硫代甘油和硫代硫酸钠·稀释剂；·乳化剂；·亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮·成盐抗衡离子，例如钠；·防腐剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等；实例是：苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；·金属络合物，例如zn-蛋白质络合物；·溶剂和共溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；·糖和糖醇，例如海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、甘露醇、山梨醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如肌醇)、聚乙二醇；和多元糖醇；·悬浮剂；·表面活性剂或湿润剂，例如普朗尼克(pluronics)、peg、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲拉通(triton)、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙班；表面活性剂可以是洗涤剂，优选分子量＞1.2kd，和/或聚醚，优选分子量＞3kd；优选洗涤剂的非限制性实例是吐温20、吐温40、吐温60、吐温80和吐温85；优选聚醚的非限制性实例是peg3000、peg3350、peg4000和peg5000；·稳定增强剂，例如蔗糖或山梨醇；·张力增强剂，例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨醇；·肠胃外递送媒剂，包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油；·静脉内递送媒剂，包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)。对于本领域技术人员来说显而易见的是，例如，药物组合物的不同成分(例如，上面列出的那些)可以具有不同的效应，并且氨基酸可以用作缓冲液、稳定剂和/或抗氧化剂；甘露醇可以用作增积剂和/或张力增强剂；氯化钠可以用作递送媒剂和/或张力增强剂；等等。设想除了本文定义的本发明的多肽之外，本发明的组合物可以包含其他生物活性剂，这取决于组合物的预期用途。这些药剂可以是作用于胃肠系统的药物、用作细胞抑制剂的药物、预防高尿酸血症的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎症反应的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域中已知诸如细胞因子的物质。还设想将本发明的抗体构建体应用于共疗法中，即与另一种抗癌药物组合。在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期施用途径、递送格式和所需剂量来确定。参见例如remington′spharmaceuticalsciences，上述引文。在某些实施方案中，所述组合物可影响本发明抗体构建体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒剂或载剂本质上可以是水性的或非水性的。例如，合适的媒剂或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊液，其可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其他示例性媒剂。在某些实施方案中，本发明组合物的抗体构建体可以通过将具有所需纯度的选定组合物与任选制剂(remington′spharmaceuticalsciences，同上)以冻干饼或水溶液的形式混合来制备用于存储。此外，在某些实施方案中，可以使用合适的赋形剂(例如蔗糖)将本发明的抗体构建体配制成冻干物。当涵盖胃肠外施用时，用于本发明的治疗组合物可以以无热原的肠胃外可接受的水溶液的形式提供，所述水溶液包含药学上可接受的媒剂中的本发明的所需抗体构建体。用于肠胃外注射的特别合适的媒剂是无菌蒸馏水，其中将本发明的抗体构建体配制成无菌等渗溶液，适当保存。在某些实施方案中，制备可以涉及用可以提供产物(其可以通过储库注射来递送)的受控或持续释放的物质(例如可注射微球体、生物可侵蚀粒子、聚合物化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)配制所需分子。在某些实施方案中，也可以使用透明质酸，其具有促进循环持续时间的作用。在某些实施方案中，可植入药物递送装置可用于引入所需抗体构建体。额外的药物组合物对于本领域技术人员将是显而易见的，包括涉及持续或控制递送/释放制剂中的本发明抗体构建体的制剂。用于配制各种其他持续或控制递送方式的技术(例如脂质体载剂、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和储库注射)也是本领域技术人员已知的。参见例如国际专利申请号pct/us93/00829，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制剂可以包括成型制品(例如膜或微胶囊)形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(如美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公开号ep058481中所公开)、l-谷氨酸和γ-l-谷氨酸乙酯的共聚物(sidman等，1983，biopolymers2：547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(langer等，1981，j.biomed.mater.res.15：167-277和langer，1982，chem.tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(langer等，1981，上述引文)或聚-d(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开号ep133,988)。持续释放组合物还可以包括可以通过本领域已知的几种方法中的任一种制备的脂质体。参见例如eppstein等，1985，proc.natl.acad.sci.u.s.a.82：3688-3692；欧洲专利申请公开号ep036,676、ep088,046和ep143,949。也可以将抗体构建体包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，包埋在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或包埋在粗滴乳状液中。这些技术在remington′spharmaceuticalsciences，第16版，oslo，a.编辑，(1980)中公开。用于体内施用的药物组合物通常作为无菌制剂提供。灭菌可以通过无菌滤膜过滤完成。当组合物冻干时，可以在冻干和重构之前或之后进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或于溶液中存储。通常将肠胃外组合物置入具有无菌输液埠的容器(例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)中。本发明的另一方面包括本发明制剂的自缓冲抗体构建体，其可用作药物组合物，如国际专利申请wo06138181a2(pct/us2006/022599)中所描述。关于这方面有用的蛋白质稳定和配制材料和方法，可以获得各种各样的论述，例如arakawa等，“solventinteractionsinpharmaceuticalformulations，”pharmres.8(3)：285-91(1991)；kendrick等，“physicalstabilizationofproteinsinaqueoussolution”，rationaldesignofstableproteinformulations：theoryandpractice，carpenter和manning编辑，pharmaceuticalbiotechnology.13：61-84(2002)，和randolph等，“surfactant-proteininteractions”，pharmbiotechnol.13：159-75(2002)，特别参见关于根据本发明的自缓冲蛋白质制剂的相关赋形剂和方法的相关部分，尤其是关于用于兽医和/或人医学用途的蛋白质药物产品和方法。根据本发明的某些实施方案，可以使用盐以例如调节制剂的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的蛋白质或其他成分的溶解度和/或物理稳定性。众所周知，离子可以通过与蛋白质表面上的带电荷的残基结合并通过屏蔽蛋白质中的带电荷和极性基团并降低其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通过特别与蛋白质的变性肽键(--conh)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中的带电荷基团和极性基团的离子相互作用还可以减少分子间静电相互作用，从而防止或减少蛋白质聚集和不溶解。离子物种对蛋白质的作用显著不同。已经开发了许多可用于配制根据本发明的药物组合物的离子的分类排序及其对蛋白质的作用。一个实例是hofmeister系列，其通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的作用来对离子和极性非离子溶质进行排序。稳定溶质称为“亲液的”。不稳定溶质称为“离液的”。通常使用高浓度的亲液剂(例如，＞1摩尔硫酸铵)以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。离液剂通常用于使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性界定了其在hofmeister系列中的位置。根据本发明的各种实施方式，游离氨基酸可用于本发明制剂的抗体构建体中作为增积剂、稳定剂和抗氧化剂以及其他标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定制剂中的蛋白质。甘氨酸可用于冻干以确保正确的饼结构和性质。在液体和冻干制剂中，精氨酸可用于抑制蛋白质聚集。蛋氨酸可用作抗氧化剂。多元醇包括糖，例如甘露醇、蔗糖和山梨醇以及多元醇，例如甘油和丙二醇，并且为了本文讨论的目的，包括聚乙二醇(peg)和相关物质。多元醇是亲液的。其是液体和冻干制剂中有用的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的影响。多元醇也可用于调节制剂的张力。在本发明的选择实施方案中有用的多元醇是甘露醇，其通常用于确保在冻干制剂中饼的结构稳定性。其确保了饼的结构稳定性。其通常与冻干保护剂(例如蔗糖)一起使用。山梨醇和蔗糖是用于调节张力的优选物质和作为稳定剂以防止在运输期间的冷冻-解冻应力或防止在制造过程中制备团块。还原糖(其含有游离醛或酮基)，例如葡萄糖和乳糖，可以使表面赖氨酸和精氨酸残基糖基化。因此，其通常不是根据本发明使用的优选的多元醇。另外，在这方面，形成这种反应性物质并且在酸性条件下水解为果糖和葡萄糖并因此产生糖基化的糖(例如蔗糖)也不是本发明优选的多元醇。peg可用于稳定蛋白质并用作冷冻保护剂，并且可以在这方面用于本发明。本发明制剂的抗体构建体的实施方案还包含表面活性剂。蛋白质分子可易于吸附在表面上，并变性以及随后在空气-液体、固体-液体和液体-液体界面处聚集。这些效应通常与蛋白质浓度成反比。这些有害的相互作用通常与蛋白质浓度成反比，并且通常因物理振荡(例如在产品运输和处理过程中产生的物理振荡)而加剧。常规使用表面活性剂来防止、最小化或减少表面吸附。在这方面，本发明中有用的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯和泊洛沙姆188。表面活性剂也常用于控制蛋白质构象稳定性。在这方面使用表面活性剂是蛋白质特异性的，因为任何给定的表面活性剂通常会稳定一些蛋白质并使其他蛋白质不稳定。聚山梨醇酯易于氧化降解，并且通常在供应时含有足够量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链、尤其是甲硫氨酸的氧化。因此，应谨慎使用聚山梨醇酯，并且在使用时应以最低有效浓度使用。在这方面，聚山梨醇酯例示了赋形剂应以其最低有效浓度使用的一般规则。本发明的抗体构建体的实施方案还包含一种或多种抗氧化剂。通过维持适当水平的环境氧气和温度并避免暴露于光下，可以在药物制剂中在某种程度上防止蛋白质的有害氧化。也可以使用抗氧化赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。在这方面，有用的抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质制剂中的抗氧化剂优选是水溶性的并且在整个产品的储放寿命内保持其活性。在这方面，edta是根据本发明的优选的抗氧化剂。抗氧化剂可以破坏蛋白质。例如，还原剂、例如特别是谷胱甘肽，可以破坏分子内二硫键。因此，用于本发明的抗氧化剂尤其被选择用于消除或足够降低其本身破坏制剂中的蛋白质的可能性。根据本发明的制剂可以包括金属离子，所述金属离子是蛋白质辅助因子并且是形成蛋白质配位络合物所必需的，例如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子也可以抑制一些降解蛋白质的过程。然而，金属离子也催化降解蛋白质的物理和化学过程。镁离子(10-120mm)可用于抑制天冬氨酸异构化为异天冬氨酸。ca+2离子(高达100mm)可以增加人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，mg+2、mn+2和zn+2会使rhdnase不稳定。类似地，ca+2和sr+2可以稳定因子viii，其可以被mg+2、mn+2和zn+2、cu+2和fe+2去稳定，并且其聚集可以由al+3离子增加。本发明的抗体构建体的实施方案还包含一种或多种防腐剂。当开发涉及从同一容器提取超过一次的多剂量肠胃外制剂时，防腐剂是必需的。其主要功能是抑制微生物生长并确保在药物产品的整个储放寿命或使用期限内的产品无菌性。常用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂在小分子肠胃外使用方面有着悠久的历史，但包括防腐剂的蛋白质制剂的开发可能具有挑战性。防腐剂几乎总是对蛋白质具有不稳定效应(聚集)，并且这已成为限制其在多剂量蛋白质制剂中使用的主要因素。迄今为止，大部分蛋白质药物仅配制为一次性使用。但是，当多剂量制剂可行时，其具有赋予患者便利性和增加适销性的增加优点。一个良好的实例是人生长激素(hgh)，其中防腐制剂的开发已经导致更方便、多次使用的注射笔呈递的商业化。目前市场上至少有四种含有hgh的防腐制剂的所述笔装置。norditropin(液体，novonordisk)、nutropinaq(液体，genentech)和genotropin(冻干-双室药筒，pharmacia&upjohn)含有苯酚，而somatrope(elililly)与间甲酚配制在一起。在防腐剂型的配制和开发期间需要考虑几个方面。必须优化药物产品中有效的防腐剂浓度。这需要测试剂型中给定的防腐剂，其浓度范围赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性。正如所预期的那样，含有防腐剂的液体制剂的开发比冻干制剂更具挑战性。冷冻干燥的产品可以在没有防腐剂的情况下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，从而显著最小化相关的稳定性风险。利用液体制剂，应在整个产品储放寿命(约18至24个月)内保持防腐剂有效性和稳定性。应注意的重要的一点是，防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中得到证实。本文公开的抗体构建体也可以配制成免疫脂质体。“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的小囊泡，其可用于将药物递送至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。含有抗体构建体的脂质体是通过本领域已知的方法制备，如epstein等，proc.natl.acad.sci.usa，82：3688(1985)；hwang等，proc.natlacad.sci.usa，77：4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；以及wo97/38731中所描述。具有延长的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556中。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂质组合物产生。将脂质体挤出通过界定孔径的过滤器以产生具有所需直径的脂质体。本发明的抗体构建体的fab′片段可以与脂质体通过二硫键交换反应缀合，如martin等j.biol.chem.257：286-288(1982)所描述。化学治疗剂任选地包含在脂质体内。参见gabizon等j.nationalcancerinst.81(19)1484(1989)。一旦配制了药物组合物，其可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末存储在无菌小瓶中。这些制剂可以以即用形式或以在施用前重构的形式(例如冻干)存储。本文定义的药物组合物的生物活性可以例如通过细胞毒性测定来确定，如以下实例中描述，在wo99/54440中或由schlereth等(cancerimmunol.immunother.20(2005)，1-12)。如本文所用，“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化nci应答标准对本发明药物组合物治疗的应答。使用本发明的药物组合物的疗法的成功或体内功效是指组合物对于其预期目的的有效性，即组合物引起其所需效应的能力，即耗尽病理细胞(例如肿瘤细胞)。体内功效可通过已建立的相应疾病实体的标准方法进行监测，所述方法包括但不限于白细胞计数、差异、荧光活化细胞分选、骨髓抽吸。另外，可以使用各种疾病特异性临床化学参数和其他建立的标准方法。此外，可以使用计算机辅助断层摄影术、x射线、核磁共振断层摄影术(例如，用于基于国家癌症研究所标准的应答评估[chesonbd、horningsj、coiffierb、shippma、fisherri、connorsjm、listerta、vosej、grillo-lopeza、hagenbeeka、cabanillasf、klippenstend、hiddemannw、castellinor、harrisnl、armitagejo、carterw、hopper、canellosgp.reportofaninternationalworkshoptostandardizeresponsecriteriafornon-hodgkin′slymphomas.ncisponsoredinternationalworkinggroup.jclinoncol.1999年4月；17(4)：1244])、正电子发射断层摄影术扫描、白细胞计数、差异、荧光活化细胞分选、骨髓抽吸、淋巴结活组织检查/组织学和各种淋巴瘤特异性临床化学参数(例如乳酸盐脱氢酶)和其他已建立的标准方法。开发药物(例如本发明的药物组合物)的另一主要挑战是药代动力学性质的可预测调节。为此，可以建立候选药物的药代动力学曲线，即影响特定药物治疗给定病况的能力的药代动力学参数的曲线。影响药物治疗某一疾病实体的能力的药物的动力学参数包括但不限于：半衰期、分布体积、肝脏首过代谢和血清结合的程度。给定药物剂的功效可以受到上文提及的每个参数的影响。本发明的抗体构建体的设想特征具有其所需的特定fc模式，例如药代动力学行为的差异。与所述抗体构建体的“规范的”非hle型式相比，根据本发明的半衰期延长的靶向抗体构建体优选显示体内滞留时间惊人地增加。“半衰期”意指通过生物过程(例如代谢、排泄等)消除50％的施用药物的时间。“肝脏首过代谢”意指药物在首次与肝脏接触时，即在首次通过肝脏期间代谢的倾向。“分布体积”意指药物在身体各个隔室(例如细胞内和细胞外空间、组织和器官等)中的滞留程度，以及药物在这些隔室内的分布。“血清结合程度”意指药物与血清蛋白(例如白蛋白)相互作用并结合的倾向，从而导致药物生物活性的降低或丧失。药代动力学参数还包括对于给定量的药物，生物利用度、滞后时间(t滞后)、tmax、吸收率、更高的起效和/或cmax。“生物利用度”意指血液隔室中药物的量。“滞后时间”意指药物施用与其在血液或血浆中的检测和可测量性之间的时间延迟。“tmax”是药物达到最大血液浓度之后的时间，并且“cmax”是用给定药物最大获得的血液浓度。达到其生物效应所需的药物的血液或组织浓度的时间受到所有参数的影响。呈现跨物种特异性的双特异性抗体构建体的药代动力学参数(其可以在如上所概述的非黑猩猩灵长类的临床前动物测试中确定)也示于例如schlereth等的出版物(cancerimmunol.immunother.20(2005)，1-12)中。在本发明的优选方面，药物组合物在约-20℃下稳定至少四周。从附加实施例中显而易见的是，本发明的抗体构建体的质量相对于相应现有技术抗体构建体的质量可以使用不同的系统进行测试。这些测试被理解为符合“ichharmonisedtripartiteguideline：stabilitytestingofbiotechnological/biologicalproductsq5candspecifications：testproceduresandacceptancecriteriaforbiotechbiotechnological/biologicalproductsq6b”，并且因此被选择以提供稳定性指示曲线，以确定检测到产品的属性、纯度和效力的变化。人们普遍接受术语纯度是相对术语。由于糖基化、脱酰胺或其他异质性的效应，生物技术/生物产品的绝对纯度通常应通过一种以上方法进行评估，并且所得纯度值取决于方法。为了稳定性测试的目的，纯度测试应该集中在确定降解产物的方法上。为了评估包含本发明的抗体构建体的药物组合物的质量，可以例如通过分析溶液中可溶性聚集物的含量(根据尺寸排除的hmws)来分析。优选在约-20℃下稳定至少四周的特征在于小于1.5％hmws、优选小于1％hmws的含量。作为药物组合物的抗体构建体的优选制剂可以例如包含如下所述制剂的组分：·制剂a：磷酸钾、l-精氨酸盐酸盐、海藻糖二水合物、聚山梨醇酯80，ph6.0在所附实施例4-12中提供了用于评估药物组合物形式的本发明抗体构建体的稳定性的其他实例。在那些实例中，关于不同药物制剂中的不同应力条件测试本发明的抗体构建体的实施方案，并将结果与本领域已知的双特异性t细胞接合抗体构建体的其他半衰期延长(hle)格式进行比较。通常，设想与提供有不同hle格式而无任何hle格式的抗体构建体(即“规范的”抗体构建体)相比，提供有根据本发明的特定fc模式的抗体构建体在宽范围的应力条件(例如温度和光应力)下通常更稳定。所述温度稳定性可涉及降低的温度(低于室温，包括冷冻)和升高的温度(高于室温，包括高达或高于体温的温度)。正如本领域技术人员将会认识到，在临床实践中难以避免的这种关于应力的改善的稳定性使得抗体构建体更安全，这是因为在临床实践中会出现较少的降解产物。结果，所述增加的稳定性意味着安全性增加。一个实施方案提供了本发明的抗体构建体或根据本发明方法产生的抗体构建体，其用于预防、治疗或改善与bcma表达或bcma过表达相关的b细胞病症、浆细胞病症和自体免疫性疾病。本文所述的制剂可用作药物组合物，用于在有需要的患者中治疗、改善和/或预防如本文所述的病理医学状况。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施。治疗包括将制剂施加或施用至患有疾病/病症，疾病/病症的症状或对疾病/病症、疾病/病症的症状或疾病/病症的倾向的患者的身体、分离的组织或细胞，其目的为治愈、痊愈、缓和、减轻、改变、补救、改善、改良或影响疾病、疾病症状或疾病倾向。如本文所用的术语“改善”是指通过将根据本发明的抗体构建体施用于有需要的受试者而对具有如下所述的疾病的患者的疾病状态的任何改善。这种改善也可以看作是患者疾病进展的减慢或停止。如本文所用的术语“预防”意指通过将本发明的抗体构建体施用于有需要的受试者来避免患有如下文所指示的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者发生或复发。术语“疾病”是指将受益于用本文所述的抗体构建体或药物组合物治疗的任何病况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患所述疾病的病理状况。“赘生物”是组织的异常生长，通常但不总是形成肿块。当也形成肿块时，其通常称为“肿瘤”。赘生物或肿瘤或可以是良性的，可能是恶性的(癌前)或恶性的。恶性赘生物通常称为癌症。其通常侵入并破坏周围组织，并可能形成转移，即其扩散到身体的其他部位、组织或器官。因此，术语“转移性癌症”涵盖转移到原始肿瘤之一除外的其他组织或器官。淋巴瘤和白血病是淋巴赘生物。为了本发明的目的，其也被术语“肿瘤”或“癌症”涵盖。术语“病毒性疾病”描述作为受试者病毒感染的结果的疾病。如本文使用的术语“免疫学病症”描述了符合这个术语的常见定义的免疫学病症，例如自体免疫性疾病、超敏反应、免疫缺陷。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或改善与bcma表达或bcma过表达相关的b细胞病症、浆细胞病症或自体免疫性疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体。在浆细胞病症中，浆细胞的一个克隆无法控制地繁殖。结果，该克隆产生大量称为m蛋白的单一(单克隆)抗体。在某些情形下，例如在单克隆丙种球蛋白病情况下，产生的抗体是不完全的，仅由轻链或重链组成。这些异常的浆细胞和其产生的抗体通常限于一种类型。优选地、浆细胞病症是选自由以下组成的组：多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、浆细胞白血病、巨球蛋白血症、淀粉样变性病、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病以及阴燃多发性骨髓瘤。b细胞病症还可以选自由以下组成的组：b细胞非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病和霍奇金淋巴瘤。自体免疫性疾病是例如全身性红斑狼疮(sle)或类风湿性关节炎(ra)。术语“有需要的受试者”或“需要治疗的”那些包括那些已经患有病症者以及那些待预防该病症者。有需要的受试者或“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。本发明的抗体构建体通常将针对特定施用途径和方法、特定施用剂量和频率、特定疾病的特定治疗、生物利用度和持久性范围等来设计。组合物的材料优选以对于施用部位可接受的浓度配制。因此可以根据本发明设计制剂和组合物以通过任何合适的施用途径递送。在本发明的上下文中，施用途径包括但不限于·局部途径(例如表皮、吸入、鼻、眼、耳(auricular/aural)、阴道、粘膜)；·肠内途径(例如口服、胃肠道、舌下、唇下部、经颊、直肠)；和·肠胃外途径(例如静脉内、动脉内、骨内、肌内、脑内、脑室内、硬膜外、鞘内、皮下、腹膜内、羊膜外、关节内、心内、真皮内、病灶内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、经皮、鼻内、透粘膜、滑膜内、管腔内)。本发明的药物组合物和抗体构建体特别可用于肠胃外施用，例如皮下或静脉内递送，例如通过注射如浓注，或通过输注如连续输注。药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于施用药物组合物的医疗装置的实例描述于美国专利号4,475,196、4,439,196、4,447,224、4,447,233、4,486,194、4,487,603、4,596,556、4,790,824、4,941,880、5,064,413、5,312,335、5,312,335、5,383,851和5,399,163中。特别地，本发明提供了合适的组合物的不间断施用。作为非限制性实例，可通过患者佩戴的用于计量治疗剂进入患者体内的流入的小型泵系统来实现不间断或基本不间断(即连续)施用。包含本发明的抗体构建体的药物组合物可以通过使用所述泵系统施用。这种泵系统在本领域中通常是已知的，并且通常依赖于含有待输注的治疗剂的药筒的定期更换。当更换这种泵系统中的药筒时，可能导致暂时中断治疗剂以其他方式不间断地流入患者体内。在这种情形下，药筒替换之前的施用阶段和药筒替换之后的施用阶段仍将被认为在药物手段的含义内，并且本发明的方法一起构成这种治疗剂的一次“不间断施用”。本发明的抗体构建体的连续或不间断施用可以通过流体输送装置或小型泵系统进行静脉内或皮下施用，所述流体输送装置或小型泵系统包括用于将流体驱出容器的流体驱动机构和用于致动驱动机构的致动机构。用于皮下施用的泵系统可以包括用于穿透患者皮肤并将合适的组合物递送到患者体内的针或套管。所述泵系统可以独立于静脉、动脉或血管而直接固定或连接到患者皮肤，由此允许泵系统与患者皮肤直接接触。泵系统可以连接到患者皮肤上24小时至几天。泵系统可能尺寸较小，具有小体积的容器。作为非限制性实例，待施用的合适的药物组合物的容器容积可以介于0.1ml与50ml之间。连续施用也可以通过佩戴在皮肤上的贴片经皮使用，并且间隔地进行更换。本领域技术人员知道适用于该目的的用于药物递送的贴片系统。值得注意的是，经皮施用尤其适合于不间断施用，因为第一用尽的贴片的更换可以有利地与在将新的第二贴片放置在例如紧邻第一用尽的贴片的皮肤表面上的同时并在即将移除第一耗尽的贴片之前来完成。不会出现流动中断或电池故障的问题。如果药物组合物已被冻干，则在施用之前首先将冻干物质在适当液体中重构。可以将冻干物质在例如抑菌注射用水(bwfi)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)或与冷冻干燥前蛋白质相同的制剂中重构。本发明的组合物可以合适的剂量施用给受试者，所述剂量可以例如通过向非黑猩猩灵长类动物(例如猕猴)施用增加剂量的呈现本文所述的种间特异性的本发明的抗体构建体通过剂量递增研究来测定。如上所述，呈现本文所述的种间特异性的本发明的抗体构建体可以有利地以相同的形式用于非黑猩猩灵长类动物的临床前测试和在人中用作药物。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如在医学领域中众所周知的，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。术语“有效剂量(effectivedose或effectivedosage)定义为足以达到或至少部分达到所需效应的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病及其并发症的量。对此用途有效的量或剂量将取决于待治疗的病况(适应症)、递送的抗体构建体、治疗背景和目标、疾病的严重程度、先前的疗法、患者的临床病史和对治疗剂的响应、施用途径、患者的体型(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)以及患者自体免疫系统的一般状态。可以根据主治医生的判断调整适当的剂量，以便其可以一次施用于患者或以一系列施用施用于患者，并且以获得最佳治疗效应。根据上文提及的因素，典型的剂量范围可为约0.1μg/kg至高达约30mg/kg或更高。在具体的实施方案中，剂量范围可为1.0μg/kg至约20mg/kg，任选地10μg/kg至约10mg/kg或100μg/kg至约5mg/kg。本发明的抗体构建体的治疗有效量优选导致疾病症状严重程度降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加或预防由于疾病折磨而产生的损害或残疾。为了治疗如上所述的与bcma表达相关的疾病，治疗有效量的本发明的抗体构建体(此处为抗bcma/抗cd3抗体构建体)相对于未治疗的患者优选抑制细胞生长或肿瘤生长达至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可以在预测功效的动物模型中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。药物组合物可以作为单独的治疗剂或与额外的疗法(例如视需要抗癌疗法，例如其他蛋白质和非蛋白质药物)组合施用。这些药物可以与包含本文定义的本发明的抗体构建体的组合物同时施用，或者在施用所述抗体构建体之前或之后以确定的时间间隔和剂量分开施用。如本文所用的术语“有效且无毒的剂量”是指本发明的抗体构建体的可耐受剂量，其足够高以引起病理性细胞消耗、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定，而没有或基本没有主要毒性效应。这种有效且无毒的剂量可以例如通过本领域中描述的剂量递增研究来测定，并且应低于诱导严重不利副作用的剂量(剂量限制毒性，dlt)。如本文使用的术语“毒性”是指在不良事件或严重不良事件中表现的药物的毒性效应。这些副事件可能是指一般药物缺乏耐受性和/或施用后缺乏局部耐受性。毒性还可能包括由药物引起的致畸或致癌效应。如本文使用的术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义了药物的施用而不会在施用后立即诱导严重不良事件(局部耐受)以及在药物的较长施用时段期间诱导严重不良事件。例如，可以在治疗和随访期期间以有规律的间隔评估“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”。测量包括临床评估，例如器官表现，以及实验室异常的筛选。可以进行临床评估，并根据nci-ctc和/或meddra标准记录/编码与正常发现的偏差。器官表现可以包括诸如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝血等的标准，如例如commonterminologycriteriaforadverseeventsv3.0(ctcae)中所述。可以测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血曲线和尿液分析以及其他体液(例如血清、血浆、淋巴或脊髓液、液体等)的检查。因此安全性可以通过例如身体检查、成像技术(即超声波、x射线、ct扫描、磁共振成像(mri)、其他技术装置的措施(即心电图))、生命体征、通过测量实验室参数和记录不良反应事件来评估。例如，根据本发明的用途和方法中非黑猩猩灵长类动物的不良事件可以通过组织病理学和/或组织化学方法进行检查。上述术语也在以下中提及：例如生物技术衍生药物s6的临床前安全性评估；ichharmonisedtripartiteguideline；1997年7月16日的ichsteeringcommitteemeeting。最后，本发明提供了包含本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体、本发明的药物组合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞的试剂盒。在本发明的上下文中，术语“试剂盒”意指两种或更多种组分(其中一种对应于本发明的抗体构建体、药物组合物、载体或宿主细胞)一起包装在容器、接受器或其他中。因此，试剂盒可以被描述为足以达成特定目标的一组产品和/或器具，其可以作为单个单元销售。试剂盒可以包含任何适当形状、大小和材料(优选防水的，例如塑料或玻璃)的一个或多个接受器(例如小瓶、安瓿、容器、注射器、小瓶、袋)，其含有适于施用的剂量的本发明的抗体构建体或药物组合物(参见上文)。试剂盒可另外含有使用说明(例如以小册子或说明手册的形式)、用于施用本发明的抗体构建体的部件(例如注射器、泵、输注器等)、用于重构本发明的抗体构建体的部件和/或用于稀释本发明的抗体构建体的部件。本发明还提供了用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可以含有包含干燥/冻干抗体构建体的第一接受器和包含水性制剂的第二接受器。在本发明的某些实施方案中，提供了含有单室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。*****必须注意的是，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a、an)”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，对“试剂”的提及包括所述不同试剂中的一种或多种，并且对“所述方法”的提及包括提及本领域普通技术人员已知的可以修改或取代本文描述的方法的等效步骤和方法。除非另外指明，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个要素。本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等效物。所述等效物意欲被本发明所涵盖。术语“和/或”在本文使用时包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其他组合”的含义。如本文所用的术语“约”或“近似”意指在给定值或范围的20％内，优选在10％内，并且更优选在5％内。然而，其也包括明确数字，例如约20包括20。术语“小于”或“大于”包括明确数字。例如，小于20意指小于或等于。类似地，多于或大于分别意指多于或等于，或大于或等于。在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变化将被理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”来取代，或者有时在本文中使用时用术语“具有”取代。当在本文中使用时，“由...组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”不排除不会实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一者都可以用另外两个术语中的任一者来代替。应理解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案、材料、试剂和物质等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不打算限制仅由权利要求界定的本发明的范围。本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于先前的发明而无权早于所述公开。如果通过引用并入的材料与本说明书相矛盾或不一致，则说明书将取代任何所述材料。将从以下实施例中获得对本发明及其优点的更好理解，这些实施例仅用于说明目的。这些实施例并不打算以任何方式限制本发明的范围。如下所述的实施例可以按照与根据本发明的其他双特异性抗体构建体相同的方案类似地实施。实施例1：在不存在靶细胞下诱导的t细胞上的cd69表达将来自健康人供体的分离的pbmc与增加的靶标b/cd3或靶标a/cd3hle双特异性抗体构建体一起培养48h。通过免疫染色和流式细胞术以及抗原特异性缀合物mab确定t细胞上的活化标记物cd69的表达。对于所有抗cdh19构建体，观察到在cd69上调方面的靶标非依赖性t细胞活化，但是对于异源fc和杂交体分子最为显著。与其他两种基于fc的构建体相比，抗靶标b-scfc对cd69的上调在较高浓度下发生，并且幅度部分较低。对于抗靶标a，几乎未观察到含有scfc的分子的靶标非依赖性t细胞活化，而异源fc构建体在不存在靶细胞下在细胞表面t细胞上诱导强烈的cd69上调。针对以下构建体评估由在c-末端含有单链fc或异源fc融合物的构建体诱导的靶标非依赖性t细胞活化：构建体(系列稀释：0.1pm-2μm)a.靶标a-i2cscfc；1.14mg/ml；b.靶标a异源fc；1.02mg/人pbmc效应细胞(3个供体；编号065、编号823、编号836(scfc)；编号401、编号415、编号433(异源fc)；编号590、编号595,598、编号605(x-体))。48h孵育时间。利用流式细胞仪和抗原特异性缀合物mab确定cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达。结果参见图2。针对以下构建体评估由在c-末端含有单链fc、异源fc或杂交体融合物的抗体构建体诱导的靶标非依赖性t细胞活化：构建体(系列稀释：0.1pm-2μm)c.靶标bxi2c-scfc；245.3μg/ml(d.靶标b异源fc；1mg/mle.靶标b杂交体；6.3mg/ml人pbmc效应细胞(3至4个供体；编号386、编号392、编号401(scfc)；编号282、编号284、编号287(异源fc))。48h孵育时间。利用流式细胞仪和抗原特异性缀合物mab确定cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达。结果参见图3。针对这些测定中测试的几种双特异性构建体观察到在cd69上调方面的靶标非依赖性t细胞活化。与相应scfc构建体相比，规范的抗体构建体、异源fc和杂交体分子的cd69上调通常更显著。与其他两种基于fc的构建体相比，scfc构建体对cd69的上调通常在略高浓度下发生，并且幅度部分较低。对于抗靶标bscfc构建体，未观察到含靶标非依赖性t细胞活化，而异源fc和x体构建体在不存在靶细胞下在细胞表面t细胞上诱导强烈的cd69上调。此外，在使用抗靶标c和抗靶标g构建体的测定中未观察到靶细胞非依赖性的cd69上调。由于骨髓谱系细胞上靶标的表达，这些细胞在测定设置之前已被去除。这些数据表明双特异性构建体的fc区与表达fcγr的细胞的相互作用可能是造成t细胞上cd69靶标非依赖性诱导的原因。在不存在肿瘤细胞下，抗靶标h-scfc构建体对t细胞上cd69的强烈上调是由于在t细胞上靶标h的表达。材料和方法1.靶标i针对以下构建体由含有单链fc的分子诱导的靶标非依赖性t细胞活化：1.抗体构建(系列稀释：1.3pm-20nm)1.靶标i-scfc2.人pbmc效应细胞(3个供体)3.48h孵育时间4.使用对cd69具有特异性的pe-cy7缀合的mab对cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达进行流式细胞术分析。2.靶标d针对以下构建体评估由在c-末端含有单链fc、异源fc或杂交体融合物的分子诱导的靶标非依赖性t细胞活化：1.抗体构建(系列稀释：1.3pm-20nm)1.靶标d-hetfc(异源fc)2.靶标d-scfc3.靶标d-x体(靶标d杂交体)2.人pbmc效应细胞(3个供体)3.48h孵育时间4.使用对cd69具有特异性的pe-cy7缀合的mab对cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达进行流式细胞术分析。3.靶标c针对以下构建体评估由在c-末端含有单链fc、异源fc或杂交体融合物的分子诱导的靶标非依赖性t细胞活化：1.抗体构建(系列稀释：1.3pm-20nm)1.靶标c-规范的2.靶标c-scfc3.靶标c-hetfc4.靶标c-x体2.人pbmc效应细胞(3个供体)3.48h孵育时间4.使用对cd69具有特异性的pe-cy7缀合的mab对cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达进行流式细胞术分析。4.靶标b针对以下构建体评估由在c-末端含有单链fc、异源fc或杂交体融合物的分子诱导的靶标非依赖性t细胞活化：1.抗体构建(系列稀释：1.3pm-20nm)1.靶标b-scfc2.靶标b-hetfc3.靶标b-x体2.人pbmc效应细胞(3个供体)3.48h孵育时间4.使用对cd69具有特异性的pe-cy7缀合的mab对cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达进行流式细胞术分析。5.靶标a针对以下构建体评估由在c-末端含有单链fc、异源fc或杂交体融合物的分子诱导的靶标非依赖性t细胞活化：1.抗体构建(系列稀释：1.3pm-20nm)1.靶标a-scfc2.靶标a-hetfc3.靶标a-x体2.人pbmc效应细胞(3个供体)3.48h孵育时间4.使用对cd69具有特异性的pe-cy7缀合的mab对cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达进行流式细胞术分析。6.靶标f针对以下构建体评估由含有单链fc或异源fc的分子诱导的靶标非依赖性t细胞活化：1.抗体构建(系列稀释：1.3pm-20nm)1.靶标f-规范的2.靶标f-scfc3.靶标f-hetfc2.人pbmc效应细胞(3个供体)3.48h孵育时间4.使用对cd69具有特异性的pe-cy7缀合的mab对cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达进行流式细胞术分析。7.靶标e针对以下构建体评估由含有单链fc或异源fc的分子诱导的靶标非依赖性t细胞活化：1.抗体构建(系列稀释：1.3pm-20nm)1.靶标e-规范的2.靶标e-scfc3.靶标e-hetfc2.人pbmc效应细胞(3个供体)3.48h孵育时间4.使用对cd69具有特异性的pe-cy7缀合的mab对cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达进行流式细胞术分析。8.靶标h针对以下构建体评估由含有单链fc的分子诱导的靶标非依赖性t细胞活化：1.抗体构建(系列稀释：1.3pm-20nm)1.靶标h-scfc2.人pbmc效应细胞(3个供体)3.48h孵育时间4.使用对cd69具有特异性的pe-cy7缀合的mab对cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达进行流式细胞术分析。9.靶标g针对以下构建体评估由含有单链fc的分子诱导的靶标非依赖性t细胞活化：1.抗体构建(系列稀释：1.3pm-20nm)1.靶标g-scfc2.人pbmc效应细胞(3个供体；cd14+/cd33+细胞耗尽)3.48h孵育时间4.使用对cd69具有特异性的pe-cy7缀合的mab对cd4+和cd8+t细胞上的cd69表达进行流式细胞术分析。实施例2：将纯化的抗体构建体涂覆在递减浓度(100nm，1∶4稀释)的maxisorb板上。用pbs-t洗涤3次并用pbs/3％(w/v)bsa封阻(60分钟，37℃)后，将汇集的人血浆在室温下孵育60分钟，80rpm。在3次洗涤之后，添加对人c1q亚单位a(cc1q)具有特异性的小鼠单克隆抗体(thermoma1-83963，1∶500)达60分钟，80rpm，室温，在描述的洗涤步骤后，将山羊抗小鼠fc-poxmab(1∶5,000)孵育60分钟，80rpm，室温。额外洗涤后，孵育tmb底物并通过添加h2so4在比色反应后停止。测定450nm下的吸收。结果：如图4中所示，在高浓度下，与单链fc构建体(三角形)相比，异源fc构建体(正方形)对人cc1q显示出更高的结合信号。作为阴性对照，使用规范的(圆形)，其显示无显著cc1q结合。实施例3：融合到半衰期延长模式的抗体构建体的药代动力学将各种靶标结合的抗体构建体融合到四个不同的半衰期延长部分。在药代动力学(pk)研究的背景下，在食蟹猴中测试每个抗体可用的所有不同的hle-变体。根据连接到靶标粘合剂的半衰期延长模式，其随后被命名为体。非分子被命名为“规范的”这些分子的相应命名在下表4中简要概述。表4单剂量的分子的化合物命名分子以静脉内浓注(化合物1b、2a-d、3a/b、4a/b、5a-5c、7-9)和静脉内输注(化合物1a、1c、3c/d、6a/b，各自作为30min输注)形式施用。分子分别以3μg/kg至6μg/kg、12μg/kg和15μg/kg的剂量线性药效学相关范围施用。化合物10a以短暂静脉内浓注形式施用，规范的构建体(化合物10b)以连续静脉内输注形式施用。为了比较化合物10a和10b的药代动力学参数，在图5中仅示出了规范的输注结束后直接开始的末期。分子以15μg/kg的剂量线性药代动力学相关范围施用。出于可比性的原因，图5中所示的血清浓度是剂量标准化的和分子量标准化的(以nmol描述)。对于上述命名的化合物中的每一者，使用了一组至少两到三只动物。收集血样并制备血清以测定血清浓度。使用免疫测定法测量血清抗体水平。使用免疫测定法测定血清水平，所述免疫测定法使用一对抗cd3独特型抗体以涂覆和检测分子。使用血清浓度-时间曲线确定pk参数。根据分子的特性调整适当的研究设置：1周或2周持续时间。血液采样时间点可能略有不同，并列于下表5中的两个设置中。表5pk研究期间的血液采样时间点.单个研究的时间点可能会有所不同.标有星号的时间点对于所有研究是强制性的和常见的分子的药代动力学在表6中示例性示出。每个化合物组代表融合到scfc-、hetfc-、hsa-(人血清白蛋白，halb)或杂交体-fc-格式的相同蛋白，或保留为规范的分子。对于所有的蛋白质，-分子施用后，所有动物中的血清水平对于所有时间点都是可定量的。pk曲线描述了每个单一测试项目施用后的双相指数下降。使用标准非隔室室分析(nca)方法测定药代动力学参数。使用非隔室室分析，估计以下pk参数：aucinf(血清浓度-时间曲线下面积)，vss(稳态分布体积)，cl(全身清除率)和终末t1/2(终末半衰期)。每种测试化合物的pk参数在下表6中分别概述为n＝2和n＝3的平均值。表6食蟹猴中来自不同的-靶标粘合剂的各种hle变体的药代动力学参数.通常，规范的分子的pk曲线描述了与这些规范蛋白质的清除机制有关的非常急剧下降的血清浓度曲线。半衰期延长的bcma靶向显示在食蟹猴中单次测试项目施用后的双相指数下降。总之，与scfchle-模式融合的分子(化合物10a)显示出平均aucinf为18772h*ng/ml，全身清除率值为0.8ml/h/kg，以及相应的分布体积为110ml/kg。化合物10b(规范的、非半衰期延长的bcma靶向)显示62.6ml/h/kg的高清除率，从而导致1677h*ng/ml的低血清暴露。所测试的两种不同模式的药代动力学行为的差异全面描述了半衰期延长的bcma靶向相对于相应规范形式、特别是在物质在体内的滞留时间方面的优势。总之，根据靶标上下文，融合到-scfc、-hetfc、has或杂交体hle模式的不同靶标粘合剂的aucinf分别介于1971h*ng/ml与77271h*ng/ml之间的范围内。所有分析的hle融合物达成0.4至7.6ml/h/kg的全身清除率值。相应的分布体积介于68与540ml/kg之间的范围内。包括化合物3d(规范的非半衰期延长的合物3靶标结合剂)作为参考。非半衰期延长的分子显示高清除率、低血清暴露，并因此显示短的终末半衰期。通过模式的终末半衰期比较概述于表7中。表7在食蟹猴中研究的通过模式的终末半衰期比较.每个靶向研究多达四个不同的半衰期延长(hle)部分，可明了，在6、10、12和15μg/kg的单个低剂量施用后，与相应的其他半衰期延长部分相比，-scfc部分显示增加的t1/2(参见图6)。实施例4：分别含有纯化的靶标a-halb、靶标a-hfc和靶标a-scfc的预配制的药物物质通过使用分子量截止值(mwco)为10kda的膜通过超滤/渗滤进行缓冲液更换。通过添加浓缩的储备溶液达到最终制剂。表8中列出了每种构建体的所得制剂。靶标蛋白质浓度为1.0mg/ml。将配制的靶标a构建体在i型玻璃小瓶中填充至1ml，所述小瓶用丁基橡胶塞塞住并用铝密封件束缚。将填充的小瓶在-20、5、25和37℃下孵育。每个形式的一个小瓶进行五个冷冻和解冻(f/t)循环。目标冷冻温度是-29℃。目标解冻温度为2℃。变温速率约为0.3k/min。根据pheur2.9.20所描述的方法，由训练有素的操作员评估可视粒子。表8中绘示了每个小瓶的可视粒子计数。如果与靶标a-halb和靶标a-scfc相比，靶标a-hfc的可视(大于125μm)蛋白质粒子的数目更高。表8：用于含有不同半衰期延长的抗靶标构建体的受应力和未受应力(t0)样品的每个小瓶的可视蛋白质粒子的数目.也通过尺寸排除超高效色谱法(se-uplc)分析上述样品以量化高分子量物质(hmws)的百分含量。使用acquityuplcbeh200sec150mm柱(waters)在acquityh-classuplc系统(waters)上进行se-uplc。柱温设置为25℃。通过应用流速为0.4ml/min的等度方法实现尺寸变体的分离。流动相由100mm磷酸钠、250mmnacl(ph6.8)构成。运行时间总计6.0分钟。将样品在自动取样器内保持在8℃直到分析。注射总量为3μg的蛋白质。为避免携带中间体，在每个样品后进行40％乙腈注射。检测是基于荧光发射(280nm下的激发、325nm下的发射)。使用软件进行峰值积分。报告了hmws曲线下的相对面积(表9)。基于fc的构建体在制剂变体g40msut中表现出比独立于应力条件的k60rtrt更低的hmws含量。很明显，在g40msut以及k60rtrt制剂中，靶标a-scfc含有比靶标a-hfc更少的hmws。其优选制剂(g40msut)中的靶标a-scfc比k60rtrt中配制的靶标a-halb更不易于形成hmws。在前述实验中，该缓冲液显示出对于基于halb的构建体的改善的稳定潜力。表9：通过se-uplc测定的受应力和未受应力(t0)靶标a-halb、-hfc和-scfc制剂中hmws含量的概述n.t.＝未测试通过肽定位监测热应力(在37℃下孵育)时的化学修饰的丰度。酶促消化蛋白质样品，并使用反相色谱法分离所得肽。将柱洗脱液直接注射到质谱仪的离子源中以鉴定和量化肽。为了达到最大覆盖率，进行了两次单独的酶消化：一次用胰蛋白酶以及一次用胰凝乳蛋白酶。在每种情形下，蛋白质用氯化胍变性，并且然后用二硫苏糖醇(dtt)还原。在dtt中孵育后，通过添加碘乙酸使游离的半胱氨酸残基烷基化。然后将样品缓冲液更换为50mmtrisph7.8用于消化。将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶各自以1∶10(样品：酶)的比率添加到分开的反应管中。将样品在37℃下消化30min，并通过添加三氟乙酸淬灭反应。将5μg负荷的各消化物分开注射到在0.1％(v/v)甲酸(fa)中平衡的zorbaxsb-c18(agilent编号859700-902)反相柱上。使用含有0.1％fa的高达90％乙腈的156分钟梯度直接将肽洗脱到q-exactiveplus质谱仪(thermoscientific)的电喷雾离子源中。使用顶12方法以数据依赖性模式收集数据，其中全部扫描(分辨率70000；扫描范围200-2000m/z)后接着12种最丰富离子的高能碰撞解离(hcd)(分辨率17500)。使用内部软件基于精确质量和串联质谱鉴定肽。手动验证鉴别。使用pinpoint软件(thermoscientific)基于离子丰度计算修饰肽和未修饰肽的相对量。表10给出了在靶标a-halb、-hfc和-scfc制剂中检测到的补体决定区(cdr)和半衰期延长部分(halb或fc)的化学修饰百分比。当比较相似的制剂条件时，显而易见的是，总之，化学修饰在scfc构建体中是最不丰富的。表10：通过肽定位确定的受应力和未受应力(t0)靶标a-halb、-hfc和-scfc制剂的化学修饰概述n.a.＝不适用；n.t.＝未测试实施例5：使如实施例4下所描述配制的靶标a-halb、-hfc、-scfc进行ph跳跃实验。起始材料的浓度是1.0mg/ml。将0.38ml体积的每种起始材料填充于玻璃小瓶中。在37℃下预处理后，向溶液中加入由0.090m磷酸钾、0.480m磷酸钠(二碱性)、0.052m氯化钾和2.76mnacl构成的20倍磷酸盐缓冲盐水(pbs)。将加标样品在37℃下孵育两周。孵育后，使用实施例4下所描述的方法通过se-uplc对其进行分析，并报告了hmws的百分含量(表11)。当比较在k60rtrt中配制的所有构建体时，hmws含量按以下顺序增加：halb＜scfc＜hfc。当在g40msut中配制时，靶标a-scfc也显示出比靶标a-hfc更低的hmws含量。表11：通过se-uplc测定的应力(ph跳跃+2w37℃)靶标a-halb、-hfc和-scfc制剂中hmws含量的概述实施例6：使如实施例4下所描述配制的靶标a-halb、-hfc和-scfc受到振荡应力。起始材料的浓度是1.0mg/ml。将0.5ml体积的每种溶液通过适当0.22μm过滤器过滤并填充到3cc玻璃小瓶中。将小瓶置于塑料盒中，确保在振荡期间小瓶不会在盒内移动。将盒放在定轨振荡器上。将样品以500rpm振荡65小时。根据pheur2.9.20所述的方法评估可视粒子。该方法由训练有素的操作员进行。表12中绘示了每个小瓶的可视粒子计数。仅在靶标a-hfc制剂中观察到可见的蛋白质粒子。表12：振荡样品中每个小瓶的可视蛋白质粒子数目也通过尺寸排除超高效色谱法(se-uplc)分析上述样品以量化高分子量物质(hmws)的百分含量。应用与实施例4中所描述相同的方法。振荡样品的hmws含量如表13所概述。在比较k60rtrt制剂时，hmws的形成在靶标a-hfc中最为显著。hmws在靶标a-hfc中比在靶标a-scfc中更丰富。表13：通过se-uplc测定的应力(ph跳跃+2w37℃)靶标a-halb、-hfc和-scfc制剂中hmws含量的概述实施例7：使如实施例4下所描述配制的靶标a-halb、-hfc和-scfc暴露于可见光和uva光(光应力)。所有制剂中的蛋白质浓度总计为1mg/ml。将蛋白质溶液通过0.22μm孔径的过滤器过滤并且在i型玻璃小瓶中填充至0.5ml。使靶标a-halb和-scfc经受两种不同的测试，所述测试分别包括0.2mlux可见光/25w*h/m2uva光和1.2mlux可见光/173w*h/m2。使靶标a-hfc进行两种不同的测试，所述测试分别包括无uva光的0.2mlux可见光和1.2mlux可见光/30w*h/m2uva光。室温调节至25℃。曝光后，通过目视检查(表14)、se-uplc(表15)和肽图(表16)分析样品。根据实施例4下中所描述的程序进行前文提及的方法。尽管靶标a-halb和-scfc暴露于较高剂量的uva光，但没有观察到可见的蛋白质粒子，而靶标a-hfc样品在两种测试中每个小瓶显示一个可见的蛋白质粒子，而与制剂无关。表14：曝光后测定的靶标a-halb、-hfc和-scfc制剂中每个小瓶的可见蛋白质粒子数目的概述1)0.2mlux可见光/25w*h/m2uva光，2)0.2mlux可见光，无uva光，3)1.2mlux可见光/173w*h/m2，4)1.2mlux可见光/30w*h/m2当蛋白质在k60rtrt中配制时，hmws按以下顺序增加：靶标a-halb＜-scfc＜-hfc。当在g40msut中配制时，基于fc的构建体的hmws可以降低。然而，hmws对于靶标a-scfc再次不太显著。靶标a-hfc揭示对uva曝光尤其敏感。表15：曝光后通过se-uplc测定的靶标a-halb、-hfc和-scfc制剂中hmws含量的概述1)0.2mlux可见光/25w*h/m2uva光，2)0.2mlux可见光，无uva光，3)1.2mlux可见光/173w*h/m2，4)1.2mlux可见光/30w*h/m2表16给出了在靶标a-halb、-hfc和-scfc制剂中检测到的补体决定区(cdr)和半衰期延长部分(halb或fc)的化学修饰百分比。当比较相似的制剂条件时，显而易见的是，总之，化学修饰在scfc构建体中是最不丰富的。表16：曝光后通过肽定位测定的靶标a-halb、-hfc和-scfc制剂中化学修饰的概述n.a.＝不适用；n.t.＝未测试实施例8：根据实施例4中所描述的程序将靶标a-halb配制在k60rtrt中，并将靶标a-scfc配制在g40msut中。蛋白质浓度总计为0.05mg/ml。向玻璃(硼硅酸盐，i型，13mm3cc小瓶，来自west，货号68000375)和聚丙烯测试容器(2ml，具有o形环，例如来自sarstedt，货号72.694.005)中填充500μl测试溶液。将测试溶液在第一个测试容器中放置5分钟。然后取150μl等分试样用于分析。将剩余的测试溶液(350μl)从一个测试容器依序转移到下一容器(总共五个容器)。在每个小瓶中，溶液在下一次转移之前放置5分钟。每个转移步骤使用相同的吸管端。使用30ml聚碳酸酯瓶(nalgene，具有封闭件的pcs-000295，pp/20-415/ztpe)进行相同的测试。对于这种容器类型，第一容器填充5ml。在取样150μl等分试样后，将残留体积从一个测试容器转移到下一容器(根据上述程序)。通过se-uplc(如实施例4下所描述的方法)分析从容器编号1和编号5拉出的样品。此外，用pda检测器(280nm)进行蛋白质检测以确定蛋白质浓度。表17给出了从每个测试容器的百分比蛋白质回收率。显示无论容器类型如何，靶标a-scfc的蛋白质回收率都比靶标a-halb更显著。表17：通过se-uplc测定的靶标a-halb和-scfc从不同容器类型的蛋白质回收率实施例9：根据实施例4中描述的程序将靶标a-halb配制在k60rtrt中，并将靶标a-scfc配制在k60rtrt和g40msut中。蛋白质浓度总计为1.0mg/ml。向1950μl的每个测试溶液中加入50μl1000ppm硅标准溶液(来自alfaaesar的specpure，货号38717)，从而产生25ppm的峰值。未加标的测试溶液用作对照样品。将加标的测试溶液以及对照样品填充到3cci型玻璃小瓶中，并在37℃下孵育24小时。根据实施例4中描述的方法通过se-uplc分析所有样品以量化hmws的量(表18)。当配制在k60rtrt中时，靶标a-halb和-scfc在硅加入时显示hmws类似的增加。表18：加入25ppm硅后通过se-uplc测定的靶标a-halb和-scfc制剂中hmws含量的概述实施例10：分别含有纯化的靶标c(cc)-halb、靶标c(cc)-hfc和靶标c(cc)-scfc的预配制的药物物质通过使用分子量截止值(mwco)为10kda的膜通过超滤/渗滤进行缓冲液更换。通过添加浓缩的储备溶液达到最终制剂。表19中列出了每种构建体的所得制剂。靶标蛋白质浓度为1.0mg/ml。将配制的靶标c(cc)-构建体在i型玻璃小瓶中填充至1ml，所述小瓶用丁基橡胶塞塞住并用铝密封件束缚。将填充的小瓶在-20、5、25和37℃下孵育。每个形式的一个小瓶进行五个冷冻和解冻(f/t)循环。目标冷冻温度是-29℃。目标解冻温度为2℃。变温速率约为0.3k/min。也通过尺寸排除超高效色谱法(se-uplc)分析上述样品以量化高分子量物质(hmws)的百分比含量。根据实施例4下所描述的方法进行se-uplc。当配制于k60rtrt中时，hmws在无应力样品中以下列顺序增加：scfc＜halb＜hfc。对于scfc-构建体观察到冷冻解冻应力后hmws的最不明显的增加。hfc-构建体揭示在-20℃下最易于形成hmws。在5℃下存储4周后，hmws含量增加。在这些条件下的hmws形成对于基于fc的构建体比对于基于白蛋白的构建体更明显。在升高的存储温度(25和37℃)下，在k60rtrt中未观察到hmws的显著增加。当配制于g40msut中时，所有构建体在未受应力样品中揭示类似的hmws含量。与基于白蛋白的构建体相比，基于fc的构建体在冷冻解冻期间的增加更明显。在g40msut中，hcc-构建体在-20℃存储过程中最不稳定。仅在halb构建体中观察到液体存储期间hmws的显著增加。表19：通过se-uplc测定的受应力和未受应力(t0)靶标c(cc)-halb、-hfc和-scfc制剂中hmws含量的概述n.t.＝未测试根据实施例4中描述的方法通过肽定位监测热应力(在37℃下孵育)时的化学修饰的丰度。表20给出了在靶标c(cc)-halb、-hfc和-scfc制剂中检测到的补体决定区(cdr)的化学修饰百分比。总之，靶标c(cc)-scfc呈现最低量的cdr化学修饰。很明显，对于scfc构建体来说cdr的脱酰胺化尤其不明显。表20：通过肽定位确定的受应力和未受应力(t0)靶标c(cc)-halb、-hfc和-scfc制剂的化学修饰概述n.a.＝不适用；n.t.＝未测试实施例11：使如实施例4下所描述配制的靶标c(cc)-halb、-hfc和-scfc进行ph跳跃实验。起始材料的浓度是1.0mg/ml。将0.38ml体积的每种起始材料填充于玻璃小瓶中。在37℃下预处理后，向溶液中加入由0.090m磷酸钾、0.480m磷酸钠(二碱性)、0.052m氯化钾和2.76mnacl构成的20倍磷酸盐缓冲盐水(pbs)。将加标样品在37℃下孵育两周。孵育后，使用实施例4下所描述的方法通过se-uplc对其进行分析，并报告了hmws的百分含量(表21)。与靶标c(cc)-halb和-hfc相比，靶标c(cc)-scfc构建体在ph跳跃后显示出最低的hmws含量，与制剂无关。表21：通过se-uplc测定的应力(ph跳跃+2w37℃)靶标c(cc)-halb、-hfc和-scfc制剂中hmws含量的概述实施例12：使如实施例4下所描述配制的靶标c(cc)-halb、-hfc和-scfc受到振荡应力。起始材料的浓度是1.0mg/ml。将0.5ml体积的每种溶液通过适当0.22μm过滤器过滤并填充到3cci型玻璃小瓶中。将小瓶置于塑料盒中，确保在振荡期间小瓶不会在盒内移动。将盒放在定轨振荡器上。将样品以500rpm振荡65小时。通过se-uplc分析样品以量化高分子量物质(hmws)的百分含量。应用与实施例4中所描述相同的方法。振荡样品的hmws含量如表22所概述。hmws的形成对任一制剂中的靶标c(cc)-scfc最不明显。表22：通过se-uplc测定的应力(ph跳跃+2w37℃)靶标c(cc)-halb、-hfc和-scfc制剂中hmws含量的概述实施例13：使如实施例4下所描述配制的靶标c(cc)-halb、-hfc和-scfc暴露于可见光和uva光(光应力)。所有制剂中的蛋白质浓度总计为1mg/ml。将蛋白质溶液通过0.22μm孔径的过滤器过滤并且在i型玻璃小瓶中填充至0.5ml。使靶标c(cc)-halb和-scfc经受两种不同的测试，所述测试分别包括0.2mlux可见光/25w*h/m2uva光和1.2mlux可见光/173w*h/m2。使靶标c(cc)-hfc进行两种不同的测试，所述测试分别包括无uva光的0.2mlux可见光和1.2mlux可见光/30w*h/m2uva光。室温调节至25℃。曝光后，通过se-uplc(表23)和肽图(表24)分析样品。根据实施例4的程序进行上文提及的方法。尽管应用于靶标c(cc)-scfc的uva光强度较高，但该构建体针对hmws形成是稳定的。相反，在测试2条件下，靶标c(cc)-hfc和靶标c(cc)-halb显示hmws增加。表23：曝光后通过se-uplc测定的靶标c(cc)-halb、-hfc和-scfc制剂中hmws含量的概述1)0.2mlux可见光/25w*h/m2uva光，2)0.2mlux可见光，无uva光，3)1.2mlux可见光/173w*h/m2，4)1.2mlux可见光/30w*h/m2靶标c(cc)-scfc在曝光时的总体化学修饰最不明显。尤其在靶标c(cc)-halb和靶标c(cc)-hfc中cdr的脱酰胺形成程度更高。当比较基于fc的构建体时，揭示了尽管scfc构建体暴露于比hfc构建体更高的uva光剂量，但靶标c(cc)-scfc不易于fc部分的化学修饰。表24还列出靶标c(cc)-halb中白蛋白部分的最丰富化学修饰，证实该构建体的半衰期延长部分比靶标c(cc)-hfc和-scfc的fc部分化学降解更多。表24：曝光后通过肽定位测定的靶标c(cc)-halb、-hfc和-scfc制剂中化学修饰的概述1)0.2mlux可见光/25w*h/m2uva光，2)0.2mlux可见光，无uva光，3)1.2mlux可见光/173w*h/m2，4)1.2mlux可见光/30w*h/m2实施例14：检查了设计用于靶向靶标f(包括非半衰期延长的靶标f(非hle，规范的)、靶标f-halb和靶标f-scfc的不同抗体构建体。halb和scfc的靶标蛋白质浓度为1.0mg/ml，非hle型式的靶标蛋白质浓度为0.4mg/ml。将配制的抗体构建体在i型玻璃小瓶中填充至1ml，所述小瓶用丁基橡胶塞塞住并用铝密封件束缚。将填充的小瓶在-20℃和37℃(没有和具有25ppm硅，已知硅具有诱导蛋白质聚集的潜力)孵育4周。也曝光(1.2mlux可见光/173w*h/m2uva光)上述构建体。对于光应力，室温设置为25℃。存储在-70℃的样品用作对照(t0)。通过尺寸排除超高效色谱法(se-uplc)一式两份地分析上述样品以量化高分子量物质(hmws)的百分含量。使用acquityuplcbeh200sec150mm柱(waters)在aquityh-classuplc系统(waters)上进行se-uplc。柱温设置为25℃。通过应用流速为0.4ml/min的等度方法实现尺寸变体的分离。流动相由100mm磷酸钠、250mmnacl(ph6.8)构成。运行时间总计6.0分钟。将样品在自动取样器内保持在8℃直到分析。注射总量为3μg的蛋白质。为避免携带中间体，在每个样品后进行40％acn注射。检测是基于荧光(280nm下的激发、325nm下的发射)。使用软件进行峰值积分。报告了hmws曲线下的相对面积(表25)。利用未受应力样品，scfc-构建体的hmws最不明显。在-20℃存储4周期间仅观察到hmws形成。在这些条件下hmws的含量按以下顺序增加：scfc＜halb＜非hle。表25：通过se-uplc测定的受应力和未受应力(t0)靶标f-非hle、-halb和-scfc制剂中hmws含量的概述另外，使用来自fluidimagingtechnologies公司的flowcam，通过微流体成像(mfi)针对亚可见粒子的丰度评估在不存在和存在硅的情况下由热应力产生的样品。该仪器配备有fc80fv流动池。应用十倍光学放大。利用无粒子水验证系统适用性。应用每秒20帧的自动图像速率。暗和亮阈值分别设置为25和20个像素。单次测量的样品体积总计为0.25ml。一式三份测量样品。在每个三份之前，将系统用0.5ml相应的样品溶液冲洗。在开始时和每次三份之间用1.0ml无粒子水进行洗涤。用visualspreadsheet软件进行数据评估。一式三份测量样品。结果概述于表26中。热应力导致含有非hle和halb构建体的制剂中的亚可见粒子形成。相反，scfc构建体保持稳定。不依赖于抗体构建体的性质，通过添加硅不会促进亚可见粒子形成。表26：在不存在和存在硅情况下的热应力后，通过mfi评估靶标f-非hle(规范的)、-halb和-scfc制剂中的亚可见粒子.还通过弱阳离子交换(wcx)色谱分析来自热应力的样品以便使用来自waters的uplcaquityh类别量化电荷变体的百分含量。应用protein-pakhirescm7im4.6x100mm柱(waters，目录号186004929)。柱温调节至30℃。流速设置为0.65ml/min。应用的梯度设计如下(表27)。自动取样器的温度保持在2-8℃。表27：应用于wcx色谱的梯度注射总量为3μg的蛋白质。检测是基于荧光(280nm下的激发、325nm下的发射)。使用软件进行峰值积分。报告了主峰曲线下的相对面积以及酸性和碱性电荷变体的相对面积(表28)。热应力导致主峰百分比降低，这必须归因于主要形成酸性电荷变体。主峰百分比的损失对于scfc构建体最不明显(7.5％)。两种构建体中都形成在曝光时具有延长的半衰期的碱性电荷变体。在halb和scfc构建体中，碱性电荷变体的增加介于5％与6％之间。表28：在热和光诱导的应力之后，通过wcx色谱评估靶标f-非hle(规范的)、-halb和-scfc制剂中的电荷变体.此外，使用基于labchipgxii系统(perkinelmer)的微流体毛细管电泳十二烷基硫酸钠(ce-sds)测定法在热和光应力样品中量化样品纯度。样品变性溶液由补充有34mm二硫苏糖醇的ht蛋白质表达样品缓冲液(由perkinelmer提供)构成。将每个样品用变性溶液1∶8稀释，并与蛋白质表达梯一起加热至70℃达10分钟。向40μl变性样品中添加35μl注射用水(wfi)。向12μl梯中添加120μlwfi。将样品、梯、蛋白质表达洗涤缓冲液、凝胶染料和脱色溶液转移至相应的容器。将样品从微量滴定板电动加载到芯片上，所述芯片整合蛋白质及其大小变体的分离、染色、脱色和检测。评估所得电泳图并报告纯度变化。表29给出了应力后检测的纯度百分比的概况，并与未受应力样品(t0)进行了比较。与所有条件下的非hle构建体相比，观察到halb和scfc构建体具有更高的纯度。与t0相比，在热和光应力时，halb和scfc构建体检测到纯度轻微下降。对于halb构建体，在37℃存储4周后的纯度损失总计为8.4％，并且对于scfc构建体总计为6.6％。halb与scfc之间的曝光时损失相当。表29：通过labchipgxii(caliper)测定的受应力和未受应力(t0)靶标f-非hle、-halb和-scfc制剂中纯度百分比的概述.实施例15：分别配制设计用于靶向靶标e(包括靶标e-halb和靶标e-scfc)的不同抗体构建体。两种构建体的靶标蛋白质浓度为1.0mg/ml。将配制的抗体构建体在i型玻璃小瓶中填充至1ml，所述小瓶用丁基橡胶塞塞住并用铝密封件束缚。将填充的小瓶在37℃(靶标e-halb)和40℃(靶标e-scfc)下孵育4周。将存储在-70℃的样品用作对照(t0)。根据实施例13下所描述的方法通过se-uplc分析样品。结果概述于表30中。与halb构建体(4.0％)相比，scfc构建体在热应力时呈现降低的单体损失(2.3％)，尽管孵育温度略高。表30：通过se-uplc测定的受应力和未受应力(t0)靶标e-halb和-scfc制剂中单体峰百分比的概述.构建体halbscfct097.6％99.8％4w93.6％97.5％实施例16检查了设计用于靶向靶标i(包括靶标i-x体和靶标i-scfc)的不同抗体构建体。靶标蛋白质浓度为1.0mg/ml。将配制的抗体构建体在i型玻璃小瓶中填充至1ml，所述小瓶用丁基橡胶塞塞住并用铝密封件束缚。将填充的小瓶在-20℃和37℃下孵育4周。另外，将所有样品暴露于1.2mlux可见光和173w*h/m2uva光。室温调节至25℃。存储在-70℃的样品用作对照(t0)。根据实施例13下所描述的方法，通过se-uplc分析存储在-20和-37℃下的样品。结果概述于表31。与x体相比，scfc构建体在分别-20和37℃下存储4周时保存了更高的单体含量。表31：通过se-uplc测定的受应力和未受应力(t0)靶标i-x体和-scfc制剂中单体含量的概述.构建体x体scfct0100.098.84w-20℃97.197.94w37℃94.595.7此外，使用实施例13下所描述的方法通过微流体成像(mfi)针对亚可见粒子的丰度评估未受应力样品。结果概述于表32中。与靶标i-x体制剂相比，靶标i-scfc制剂呈现显著更低量的亚可见粒子。这适用于所有包括的大小分数。表32：通过mfi评估未受应力的靶标i-x体和-scfc中的亚可见粒子还通过弱阳离子交换(wcx)色谱分析光应力样品，以根据实施例13下所描述的方法使用来自waters的uplcaquityh类别量化电荷变体的百分含量。报告了主峰曲线下的相对面积以及酸性和碱性电荷变体的相对面积(表33)。与x体相比，scfc构建体显示增强的针对曝光的稳定性，由总计1.4％的较不显著的主峰损失表示，与之相比，x体构建体则为5.5％。表33：在热和光诱导的应力之后，通过wcx色谱评估靶标i-x体和-scfc制剂中的电荷变体.实施例17：双特异性scfc变体的尺寸排除色谱法根据标准程序，通过尺寸排除色谱法测试构建体d9f、t2g、d3l、t7i和k6c(参见图7)各自的运行行为。具体而言，于室温下在superdex200增加10/300gl柱上、在柠檬酸溶解素缓冲液(10mm和75mm，ph7)中运行25μg界定量的每种构建体(750μl/min)，并记录od280nm。随后，通过滞留时间比较构建体。结果，与t2g、d3l、t7i和k6c相比，构建体d9f显示显著延迟的洗脱(表34)，这表明fc结构域的结构/排列的差异。滞留时间的这种差异在铰链区具有未配对的半胱氨酸以及具有ch2和ch2ch3与ch3的连接的构建体t7i中最显著(18.98min对18.62min，0.36min的差异)。然而，考虑到bsa对照的相应滞留时间，d9f与t2g之间的0.16min的滞留时间差也是显著的。bsa对照对于单体显示19.07min的滞留时间，并且对于二聚体显示16.82min的滞留时间，其展示双重分子量的滞留时间差为2.25min。因此，由于构建体仅在fc部分具有结构差异，所以0.16min的滞留时间差是显著的。总之，构建体d9f显示最长的滞留时间，表明最强的结合。这一结论导致预计d9f也具有最长的体内半衰期。表34实施例18：基于表面等离子体共振测定与人fcrn(fcgrt/b2m)的结合在spr(biacore)实验中根据标准程序测试构建体d9f、t2g、d3l、t7i和k6c(图7)各自结合人fcrn的能力。具体来说，通过使用乙酸钠缓冲液(ph4.5)和由200mmhepes、150mmnacl、3mmedtaph6.0组成的运行缓冲液，用450-500ru的fcgrt/b2m(acrobiosystems)固定cm5传感器芯片(gehealthcare)。随后将构建体以稀释于200mmhepes、150mmnacl、3mmedta(ph6.0)中的250nm和125nm的两个浓度和36℃下在后续运行中注射。以30μl/min流速进行90秒结合，接着在36℃下在200mmhepes、150mmnacl、3mmedta(ph6.0)中以30μl/min流速进行90秒解离期。随后用10mmhepes、150mmnacl、3mmedta(ph7.4)以30μl/min进行再生10秒。测量所有构建体在注射阶段期间的最大结合作为相应的应答单位(ru)，其等同于由于结合构建体而在fcrn涂覆的cm5芯片上的分子量增加。所有构建体都一式两份测量。图8a和8b分别绘示了一式两份测定的平均值。结果，与t2g、d3l、t7i和k6c相比，构建体d9f在fcrn涂覆的cm5芯片上显示出显著更高的质量增加，这表明d9f对人fcrn的结合亲和性更强。对于两种浓度的相应构建体都观察到了这种观察结果。通过构建体内的fc部分介导针对fcrn的结合。如文献中所述的针对人fcrn的更强结合是体内较长半衰期的指示，这是由于相应蛋白质的细胞内挽救较高并因此降低了降解速率。由于这个原因，与其他构建体相比，d9f与人fcrn的更强结合使得该分子作为治疗分子的基础明显优异以允许潜在药物在患者中更长时间暴露并且药物施用频率更低。实施例19：基于表面等离子体共振测定与人fcrn(fcgrt/b2m)的结合根据标准程序，在spr(biacore)实验中测试构建体d9f、t2g、d3l、t7i和k6c和人iggl-к抗体mt201各自结合人fcrn的能力。具体来说，通过使用乙酸钠缓冲液(ph4.5)和由200mmhepes、150mmnacl、3mmedtaph6.0组成的运行缓冲液，用约350ru的fcgrt/b2m(acrobiosystems)固定cm5传感器芯片(gehealthcare)。随后将构建体和人iggl-к对照(mt201)以稀释于200mmhepes、150mmnacl、3mmedta(ph6.0)中的125nm的浓度和36℃下注射。以30μl/min流速进行90秒结合，接着在36℃下在200mmhepes、150mmnacl、3mmedta(ph6.0)中以30μl/min流速进行90秒解离期。随后用10mmhepes、150mmnacl、3mmedta(ph7.4)以30μl/min进行再生10秒。测量所有构建体在注射阶段期间的最大结合作为相应的应答单位(ru)，其等同于由于结合构建体而在fcrn涂覆的cm5芯片上的分子量增加。所有构建体都一式两份测量。图9绘示了重复测定的平均值，包括标准偏差误差杠。结果，与t2g、d3l、t7i和k6c相比，构建体d9f在fcrn涂覆的cm5芯片上显示出显著更高的质量增加，这表明d9f对人fcrn的结合亲和性更强。d9f的fcrn涂覆的cm5芯片上的质量增加与人igg1-к对照抗体mt201的质量增加充分相当，表明构建体d9f与人fcrn的结合相当。通过构建体内的人igg1fc部分介导针对fcrn的结合。如本领域中所述的针对人fcrn的更强结合是体内较长半衰期的指示，这是由于相应蛋白质的细胞内挽救较高并因此降低了降解速率。由于这个原因，与其他构建体相比，d9f与人igg1-к抗体(mt201)范围内人fcrn的更强结合使得该分子作为治疗分子的基础明显优异以允许潜在药物在患者中更长时间暴露并且药物施用频率更低。当前第1页12当前第1页12