CD200突变体及其用途的制作方法

本发明总体上涉及突变的cd200蛋白，其与野生型cd200相比，以更大的亲和力结合cd200受体，特别地，本发明涉及突变的cd200蛋白，其包含在氨基酸残基位置130和/或131位的突变。本发明还涉及融合蛋白，其包含通过任选的接头部分与非cd200蛋白编码部分融合的本文定义的蛋白质，涉及包含本文定义的蛋白质的药物组合物及其用途。发明背景自身免疫病是全球慢性病的第二大原因，并且在美国，它们是女性发病的主要原因。根据2008年的一项国际调查，由于成本负担，美国慢性病患者与其他国家相比，更有可能没有得到适当的关注(schoen，c等，(2008)healthaffairswebexclusive,w1-w16)。此外，这些患者更可能经历最高的医疗错误率、协调护理的问题以及高额的医疗保健费用。目前，美国自身免疫相关疾病的协会(aarda)估计有5000万美国人患有自身免疫病。缺乏流行病学数据来确定由于自身免疫病导致的整个医疗保健系统的全部直接和间接费用。然而，在2001年，国家过敏和传染病研究所(niaid)主任anthonyfauci博士估计，每年的自身免疫病治疗费用超过1000亿美元。虽然1000亿美元是一个令人震惊的数字，但它可能是对自身免疫病真实花费的极大低估，因为在100多种已知的自身免疫病中，仅有克罗恩病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化症(ms)、类风湿性关节炎(ra)、牛皮癣和硬皮病这7种自身免疫病的年度费用，它们是通过流行病学研究估计的，每年总计为518亿美元到706亿美元。此外，这些估计忽略了移植期间免疫抑制治疗的花费。自身免疫病是一种无法治愈的慢性疾病，当免疫系统决定健康细胞是外来的并攻击它们时就会出现自身免疫病。根据类型，自身免疫病可以影响一种或许多不同类型的身体组织，并且可以引起器官异常生长和器官功能的改变。免疫系统的正常调节主要是由于受体/配体对，所述受体/配体对包括由参与免疫应答的细胞表达的蛋白质。但是，这些受体/配体对通常包括在信号级联中，这为自身免疫病的治疗提供了障碍。目前对自身免疫病的管理涉及控制疾病过程和减轻症状的尝试，特别是在疾病发作期间。ox-2膜糖蛋白，也称为cd200(分化簇200(clusterofdifferentiation200))，是一种由cd200基因编码的人蛋白质，其在多种细胞类型中表达(barclay,a.n.(1981)immunology44,727)并且与免疫球蛋白基因家族的分子具有高的同源性程度。由该基因编码的蛋白质是1型膜糖蛋白，其含有两个免疫球蛋白结构域并与cd200受体(cd200r)结合。cd200r在髓样细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜酸性粒细胞)和t细胞上表达(wright等，(2000),immunity12,233-242；wright等，(2003),j.immunol,171,3034-3046)。cd200与cd200r的结合向髓样细胞和t细胞发出抑制信号，从而对先天免疫系统和适应性免疫系统产生免疫抑制作用(rahims.a.,(2005)aids,19,1907-1925；shiratori,i.,(2005)j.immunol,175,4441-4449；misstear,k.等，(2012),journalofvirology,86(11),6246-6257)。已经显示cd200r激动剂在多种疾病模型中减少病理学，所述疾病模型例如关节炎(gorczynski等，(2001)clin.immunol.101,328–34；gorczynski等，(2002)clin.immunol.104,256-264)，移植物排斥(gorczynski等，(2002)transplantation73,1948-1953)，妊娠失败(gorczynski等，(2002)am.j.reprod.immunol.,48,18-26)，接触性超敏反应(rosenblum等，(2004)blood103,2691-8)，流感诱导的肺部炎症(snelgrove等，(2008)nat.immunol.,9,1074-1083)和hsv诱导的炎性病变(sarangi等，(2009)clin.immunol.131,31-40)。此外，与野生型对照相比，用流感病毒攻击的cd200-/-小鼠发展出更严重的疾病，其与增加的肺浸润和肺内皮损伤有关(rygiel.t.p.等，(2009)j.immunol.183(3),1990-1996)。cd200-/-小鼠确实产生了可以控制病毒载量的免疫反应，这表明所述严重的疾病是由夸张的免疫反应引起的。在病毒攻击之前通过消耗t细胞可以预防所述疾病，但是显著增加的病毒载量引起所述疾病。rygiel.t.p.等，(2009)得出结论，t细胞对于流感感染期间疾病症状的显现是必不可少的，并且缺乏下调cd200-cd200r信号而不是病毒载量增加了免疫病理学。分析研究表明在多种患者群体中hcd200表达是下调的，例如患有多发性硬化症(koning等，(2007)ann.neurol.62,504-514)，哮喘急性发作(aoki等，(2009)clin.exp.allergy39,213-221)，阿尔茨海默病(walker等，(2009)exp.neurol.215,5-19)，原发性肥厚性骨关节病(ren等，(2013)rheumatol.int.33(10),2509–2512)，怀孕失败(clark(2009)am.j.reprod.immunol.61,75-84)和扁平苔藓(lichenplanopilaris)(脱发)(harries等，(2013)j.pathol.231(2),236-247)的患者。激动剂cd200蛋白公开在例如wo2000/061171和wo2008/089022中。所述文献描述了野生型cd200分子用于调节免疫细胞功能的用途。本发明涉及突变的cd200蛋白，其与野生型cd200相比，以更大的亲和力结合cd200受体。因此需要在较低剂量下提供改善的临床功效，这将克服与目前可用的自身免疫病治疗相关的问题。发明概述根据本发明的第一方面，提供了突变的cd200蛋白，其包含在氨基酸残基位置130和/或131处的突变。根据本发明的第二方面，提供了融合蛋白，其包含通过任选的接头部分与非cd200蛋白编码部分融合的如本文定义的蛋白质。根据本发明的第三方面，提供了编码如本文定义的蛋白质的多核苷酸。根据本发明的另一方面，提供了包含如本文定义的蛋白质的药物组合物。根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的蛋白质或如本文所定义的组合物，其用于治疗自身免疫病。附图简述图1：wt-cd200-fc、k130y和i131y的sds凝胶。图2：a:k130y的大小排阻层析。b:i131y的大小排阻层析。图3：在传感器芯片表面上固定抗人fc抗体。图4：赫赛汀捕获和hcd200r缔合/解离。图5：a：显示cd200r与捕获的野生型cd200结合的缔合和解离阶段的传感图。b：显示cd200r与捕获的k130y结合的缔合和解离阶段的传感图。图6：比较野生型cd200-fc和k130y对分离的人嗜中性粒细胞中pma刺激的氧化爆发的抑制的剂量反应结果发明详述根据本发明的第一方面，提供了突变的cd200蛋白，其包含在氨基酸残基位置130和/或131处的突变。本发明人发现在cd200的细胞外结构域中这些特定氨基酸残基处的突变产生突变cd200，其对cd200受体(cd200r)的结合亲和力增加。另外，如本文所述的突变的cd200蛋白具有显著的益处，特别是在提供具有更高临床功效和更低剂量的治疗方面。如本文所用的术语“cd200蛋白”是指野生型cd200蛋白。如本文所用的术语“野生型”是指天然存在的蛋白质、肽、氨基酸和核苷酸序列。例如，如本文所用的术语“野生型cd200蛋白”是指cd200(uniprotp41217ox2g_human；seqidno:1)的任何全长同种型或其任何部分，其结合cd200受体。cd200蛋白也称为ox-2膜糖蛋白。野生型cd200是细胞表面蛋白，具有n-末端细胞外结构域和短的跨膜和细胞质结构域。细胞外结构域与靶受体如cd200受体结合。在一个实施方案中，cd200蛋白是cd200的细胞外结构域，或其任何部分，其结合cd200受体。在另一个实施方案中，cd200蛋白是野生型cd200的细胞外结构域(seqidno:2)，其在包括信号序列的全长蛋白质(seqidno:1)中，始于+31位置处的谷氨酰胺和止于+231位置处的赖氨酸。如本文所用的术语“位置”是指氨基酸序列中的残基编号，其中1是第一个翻译的氨基酸。本文所用的术语“突变的”或“突变”是指蛋白质、肽、氨基酸和核苷酸序列以它们的形式从野生型等同物发生变化，变成突变体。例如，当与相应的野生型序列比较时，突变的蛋白或突变蛋白可能已经经历了氨基酸和/或核苷酸序列的变化，这种变化也可以称为突变。常见的突变包括替代，缺失，添加，截短，易位和倒位。因此，在一个实施方案中，突变是替代，易位或倒位。在进一步的实施方案中，突变是替代突变。在进一步的实施方案中，所述替代突变是k130y和/或i131y。本领域技术人员将理解，核苷酸序列中不改变氨基酸序列的突变仍将被认为是突变的。因此，核苷酸序列中不改变蛋白质的突变仍然认为是突变的。本文所用的术语“突变的cd200蛋白”是指全长cd200蛋白或其任何部分，其与cd200受体结合，包含氨基酸序列中的一个突变的氨基酸残基或多个突变的氨基酸残基，从而它与野生型cd200蛋白相似但不再相同。在一个实施方案中，突变的cd200蛋白可以合成或重组制备。在一个进一步的实施方案中，突变的cd200蛋白可以合成制备。在一个备选的实施方案中，突变的cd200蛋白可以重组制备。在一个实施方案中，突变的cd200蛋白以比野生型cd200更大的亲和力结合cd200受体。在一个实施方案中，突变的cd200蛋白可在其中包含生物学或化学活性的非cd200组分或包含与所述突变的cd200蛋白连接的生物学或化学活性的非cd200组分。在一个实施方案中，突变的cd200蛋白可以是可溶的(即，循环的)或结合到表面上。在一个进一步的实施方案中，突变的cd200蛋白是可溶的。在一个备选的实施方案中，突变的cd200蛋白与表面结合。在一个实施方案中，突变的cd200蛋白可包括cd200的整个细胞外结构域或其部分。如本文当谈及蛋白质、肽和氨基酸和核苷酸序列时所用的术语“部分”是指功能性的、即与它们的靶标结合的片段和衍生物。如本文所用的术语“片段”是指识别并结合其靶标例如受体的蛋白质、肽、氨基酸或核苷酸序列的一部分。本文所用的术语“…的衍生物”和“突变体”是指这样的蛋白质、肽、氨基酸或核苷酸序列，其与野生型等同物共有至少70％(例如75％，80％，85％，90％，95％或99％)的序列相似性和如野生型等同物那样发挥作用。因此，突变体可以是野生型等同物的衍生物。在又一个实施方案中，突变的cd200蛋白是野生型cd200的细胞外结构域的一部分，其始于+31位置处的谷氨酰胺和止于+231位置处的赖氨酸。本文所用的术语“氨基酸残基”是指聚合链中的单体单元，即蛋白质中的单个氨基酸。在一个实施方案中，蛋白质额外地包含氨基酸序列中存在的一个或多个突变，例如1-15个突变。在进一步的实施方案中，所述突变的蛋白包含一个或多个额外的的突变，例如选自g129i，f128r和/或n81k的突变。在一个实施方案中，如本文所定义的蛋白质包含所述蛋白质的细胞外结构域(ecd)。在一个进一步的实施方案中，如本文所定义的蛋白质包含seqidno:3或seqidno:4的序列。在一个实施方案中，如本文所定义的蛋白质包含全长cd200序列。在一个进一步的实施方案中，如本文所定义的蛋白质包含seqidno:12或seqidno:13的序列。如图5和表2中所示，本文公开的突变cd200蛋白与cd200受体结合更紧密并且在受体上表现出比野生型cd200蛋白更长的停留时间。融合蛋白根据本发明的第二方面，提供了融合蛋白，其包含通过任选的接头部分与非cd200蛋白编码部分融合的如本文定义的蛋白质。如本文所用的术语“融合蛋白”是指使用本领域熟知的方法连接在一起的一个或多个氨基酸序列、肽和/或蛋白质，如例如美国专利号5,434,131和5,637,481中所述。因此，连接的氨基酸序列、肽或蛋白质形成一种融合蛋白。在一个实施方案中，本文的蛋白质通过任选的接头部分在n-或c-末端与非cd200蛋白编码部分融合。在一个进一步的实施方案中，本文的蛋白质通过任选的接头部分在n端融合至非cd200蛋白编码部分。在一个备选的实施方案中，本文中的蛋白质通过任选的接头部分在c-末端与非cd200蛋白编码部分融合。在一个实施方案中，所述接头部分是包含1至15个氨基酸的肽。在一个进一步的实施方案中，接头是以甘氨酸开始并以丝氨酸结束的10个氨基酸的接头。在又一个实施方案中，接头是包含ggggsggggs(seqidno:11)的序列的肽。如本文所用的术语“非cd200蛋白编码部分”是指不与cd200受体结合且不干扰cd200与其靶标结合的任何肽或蛋白质。实例包括但不限于免疫球蛋白(ig)恒定区或其部分。在一个进一步的实施方案中，所述非cd200蛋白编码部分是抗体或其片段。在一个进一步的实施方案中，所述非cd200蛋白编码部分是fc片段。因此，如本文所述的突变的cd200融合蛋白也可称为突变cd200-fc。在一个进一步的实施方案中，所述fc片段是哺乳动物衍生的，例如衍生自人或猴，例如人c(γ)1，其包括铰链区、ch2和ch3区。认为fc片段提供了增加本发明突变的cd200蛋白的半寿期(即，受体占据)的优点。本领域技术人员将理解，可以突变fc区以降低其效应子功能(参见例如us5,637,481和us6,132,992)。由于突变的cd200蛋白与野生型或非突变的cd200蛋白相比对cd200受体具有更高的亲和力，如图5和表2中所示，任何融合的非cd200蛋白编码部分也将受益于该特征。如本文所述，这为药物组合物和疗法提供了实质性益处。在一个实施方案中，如本文所定义的融合蛋白包含seqidno:6或seqidno:7的序列。本发明的蛋白质优选通过重组dna方法，通过将编码突变的cd200蛋白或其任何部分的核酸序列插入重组表达载体中，并在促进表达的条件下在重组表达系统中表达核酸序列来生产。因此，在一个实施方案中，编码融合蛋白的多核苷酸额外地包含载体，例如pcdna3.4。在一个实施方案中，融合蛋白的侧翼是一个或多个限制性酶位点，例如hindiii和/或xhoi。在一个进一步的实施方案中，编码融合蛋白的多核苷酸的侧翼为hindiii和xhoi限制性站点。在一个实施方案中，融合蛋白包含一个或多个限制性酶位点，例如bamhi。根据本发明的第三方面，提供了编码如本文定义的蛋白质的多核苷酸。编码本发明提供的蛋白质的核酸序列可以组装自cdna片段和短寡核苷酸接头或组装自一系列寡核苷酸，以提供合成的基因，其能够插入重组表达载体并以重组转录单元表达。重组表达载体包括合成的或cdna衍生的编码突变cd200的核酸片段，其有效连接至衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调节元件。此类调节元件包括转录启动子，控制转录的任选操纵子序列，编码合适的mrna核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。可以额外地掺入在宿主中复制的能力，通常由复制起点赋予，和掺入选择基因以促进转化体的识别。治疗用途本发明在治疗中具有特别的应用，因为cd200蛋白和cd200受体之间的相互作用的特征在于快速“缔合”速率和快速解离(“脱离”)速率，这接下来降低了cd200对cd200受体的亲和力。因此，如本文所示，增加突变的cd200蛋白对cd200受体的亲和力可用于制备具有更强效性质的药物组合物。此外，重组蛋白的制造成本高且具有更高亲和力的突变的cd200蛋白可以以显著低于野生型或非突变cd200蛋白的剂量用于药物组合物中以实现治疗效果。因此，除了更具临床效果之外，使用突变的cd200蛋白还可以更具成本效益。根据本发明的另一方面，提供了包含如本文定义的蛋白质的药物组合物。在一个实施方案中，如本文所定义的突变cd200蛋白是cd200受体的调节物(modulator)。如本文所用的术语“调节物”是指导致动力学变化的物质，例如蛋白质的调节物可导致所述蛋白质的活性增加或降低。鉴于本发明的突变cd200蛋白的性质，认为它们是cd200受体的激动剂，因此可用于治疗自身免疫病。因此，在一个进一步的实施方案中，如本文所定义的突变的cd200蛋白是cd200受体的激动剂。因此，根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的蛋白质或如本文所定义的组合物，其用于治疗自身免疫病。包含本文定义的突变的cd200蛋白的融合蛋白可以比包含野生型或非突变的cd200蛋白的融合蛋白更高效地使活化的免疫细胞失活。在一个实施方案中，自身免疫病选自影响神经肌肉系统，血管系统，眼睛，消化道，肺，肾，肝，外周或中枢神经系统，骨，软骨或关节的自身免疫病。在一个进一步的实施方案中，自身免疫病是一种或多种选自以下的自身免疫病：急性播散性脑脊髓炎(adem)；急性坏死性出血性脑白质炎；艾迪生病；丙种球蛋白血症；斑秃；淀粉样变性；强直性脊柱炎；抗gbm/抗tbm肾炎；抗磷脂综合征(aps)；自身免疫性血管神经性水肿；自身免疫性再生障碍性贫血；自身免疫性自主神经异常；自身免疫性肝炎；自身免疫性高脂血症；自身免疫性免疫缺陷；自身免疫性内耳疾病(aied)；自身免疫性心肌炎；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性视网膜病变；自身免疫性血小板减少性紫癜(atp)；自身免疫性甲状腺疾病；自身免疫性荨麻疹；轴突和神经元神经病；巴洛病(balodisease)；白塞病；大疱性类天疱疮；心肌病；卡斯曼病；乳糜泻(celiacdisease)；查格斯氏病(chagasdisease)；慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)；慢性复发性多灶性骨髓炎(crmo)；churg-strauss综合征；瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮；克罗恩病；cogans综合征；冷凝集素病；先天性心脏传导阻滞；柯萨奇心肌炎；crest疾病；原发性混合型冷球蛋白血症(essentialmixedcryoglobulinemia)；脱髓鞘神经病；疱疹样皮炎；皮肌炎；devic病(视神经脊髓炎)；盘状狼疮；dressler综合征；子宫内膜异位症；嗜酸性粒细胞性食管炎；嗜酸性筋膜炎；结节性红斑；实验性过敏性脑脊髓炎；埃文斯综合征；纤维化肺泡炎；巨细胞动脉炎(颞动脉炎)；巨细胞心肌炎；肾小球肾炎；goodpasture综合征；肉芽肿伴多血管炎(gpa)(以前称为韦格纳肉芽肿病)；格雷夫斯病；格林-巴利综合征；桥本氏脑炎；桥本氏甲状腺炎；溶血性贫血；henoch-schonlein紫癜；妊娠疱疹(herpesgestationis)；低丙种球蛋白血症；特发性血小板减少性紫癜(itp)；iga肾病；igg4相关的硬化病；免疫调节脂蛋白；包涵体肌炎；间质性膀胱炎；青少年关节炎；青少年糖尿病(1型糖尿病)；青少年肌炎；川崎综合征；兰伯特-伊顿综合征；白细胞碎裂性血管炎；扁平苔藓；硬化性苔藓；结膜炎；线性iga病(lad)；狼疮(sle)；慢性莱姆病；梅尼埃病；显微镜下多血管炎；混合性结缔组织病(mctd)；穆伦氏溃疡；摩哈-哈伯曼病；多发性硬化症；重症肌无力；肌炎；发作性睡病；视神经脊髓炎(devic病)；中性粒细胞减少；眼瘢痕性类天疱疮；视神经炎；回文性风湿病；pandas(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病)；副肿瘤性小脑变性；阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh)；帕里罗姆伯格综合征；parsonnage-turner综合征；睾丸炎(外周葡萄膜炎)；天疱疮；周围神经病；静脉周脑脊髓炎；恶性贫血；poems综合征；结节性多动脉炎；i型，ii型和iii型自身免疫性多腺体综合征；风湿性多肌痛；多发性肌炎；心肌梗死后综合征；心包切开术后综合征；黄体酮皮炎；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；银屑病；银屑病关节炎；特发性肺纤维化；坏疽性脓皮病；纯红细胞再生障碍；雷诺现象；反应性关节炎；反射性交感神经营养不良；瑞特综合征；复发性多软骨炎；不安腿综合征；腹膜后纤维化；风湿热；类风湿关节炎；结节病；施密特综合征；巩膜炎；硬皮病；干燥综合征；精子和睾丸自身免疫；僵硬综合征；亚急性细菌性心内膜炎(sbe)；苏萨克综合征；交感性眼炎；高安动脉炎；颞动脉炎/巨细胞动脉炎；血小板减少性紫癜(ttp)；tolosa-hunt综合征；横贯性脊髓炎；1型糖尿病；溃疡性结肠炎；未分化结缔组织病(uctd)；葡萄膜炎；血管炎；膀胱皮肤病；白癜风；和韦格纳肉芽肿病(现称为肉芽肿伴多血管炎(gpa))。根据本发明的另一方面，提供了治疗受试者的自身免疫病的方法，包括将本发明的蛋白质施与患有至少一种自身免疫病的受试者。应当理解，本发明的蛋白质可以作为唯一的治疗剂施用，或者可以与一种或多种其他化合物(或疗法)联合施用，用于治疗自身免疫病。因此，根据本发明的另一方面，提供了药物组合物，其包含本文定义的蛋白质与一种或多种额外的治疗剂的组合。对于自身免疫病的治疗，本发明的蛋白质可以有利地与一种或多种其他医药剂组合使用，更具体地，与免疫抑制剂治疗中的一种或多种免疫抑制剂或佐剂组合使用。可与本发明的化合物一起(无论是同时或以不同时间间隔)一起施用的其他治疗剂或治疗的实例包括但不限于：硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；环孢菌素；单克隆抗体(巴利昔单抗、达珠单抗和莫罗单抗(muromonab))和皮质类固醇。存在于本发明组合中的每种治疗剂可以以单独变化的剂量方案和通过不同途径给予。另外，两种或更多种药剂中的每一种的剂量学可以不同：每种药剂可以在相同时间或在不同时间施用。本领域技术人员将通过他或她的常规公知常识知道要使用的给药方案和组合疗法。例如，本发明的蛋白质可以与一种或多种其他药剂组合使用，所述药剂根据其现有的组合方案给药。通常，本文公开的蛋白质将以纯化形式与药理学上合适的赋形剂或载体一起使用。通常，这些赋形剂或载体包括水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液、包括盐水和/或缓冲介质。肠胃外溶媒(vehicles)包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、右旋糖和氯化钠以及乳酸化林格氏液。根据需要，使用合适的生理上可接受的辅助剂将多肽复合物保持在悬浮液中，所述合适的生理上可接受的辅助剂可以选自增稠剂，例如羧甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，明胶和藻酸盐。根据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员公知的任何一种。对于治疗，包括但不限于免疫治疗，可以根据标准技术将本发明的蛋白质施与任何患者。给药可以通过任何适当的方式进行，包括肠胃外，静脉内，肌内，腹膜内，经皮，通过肺部途径，或者适当地，用导管直接输注。给药的剂量和频率将取决于患者的年龄，性别和状况，其他药物的同时给药，禁忌症和临床医生应考虑的其他参数。本发明的蛋白质可以是冻干的，用于储存，并且在使用前于合适的载体中重构。已经显示该技术是有效的，并且可以采用本领域已知的冷冻干燥法和重构技术。本领域技术人员将理解，冷冻干燥和重构可导致不同程度的活性损失，并且可能必须向上调整水平以补偿。以下研究和方案阐述了本文所述方法的实施方案。实施例1：突变和野生型cd200-fc分子的制备基因合成将编码包括n端信号序列的uniprotp412178(ox2g_人)的突变体或野生型人cd200残基1-231的dna序列在c端与igg1fc融合，所述igg1fc是p01857(ihg1_人)的残基99-330，在这2个蛋白结构域之间具有接头序列ggggsggggs(seqidno:11)。在geneart对野生型和突变体的构建体进行基因合成。使用哺乳动物表达载体pcdna3.4，用5'hindiii和3'xho制备表达构建体。引入内部bamhi以促进fc结构域交换。midiprep收到cd200-fc靶蛋白的冻干dna构建体(野生型和突变体cd200-fc蛋白)后，将其悬浮于50μl的mq，并转化dh5α细胞。选择每种靶蛋白的单个菌落并接种到5.0ml含有氨苄青霉素的lb中。接下来，分离来自2.0ml培养物的dna用于确认，并通过琼脂糖凝胶电泳解析。通过用hindiii和xhoi消化dna来确认构建体。将每一突变体或野生型构建体在100mllb中培养，用于中等规模(midiscale)的dna制备。使用purelinkhipure质粒midiprep试剂盒分离dna。蛋白质表达对于25ml培养物体积，根据制造商的说明书，使用thermofishergibcotmexpichotm表达系统制备cd200-fc靶蛋白。收集含有表达的cd200-fc的培养基上清液并储存在-80℃直至使用。蛋白质纯化使用填充有53mlsephadexg25的hiprep脱盐柱(xk26/10)进行缓冲液交换以调节培养基用于亲和柱纯化。在akta开拓者平台上用缓冲液a(含有20mm磷酸钠ph7.4的150mmnacl)平衡脱盐柱。将30ml澄清的培养基以1ml/分钟的速率加载到两个串联连接的脱盐柱上。以2ml/分钟的速率洗脱蛋白质并分级收集。合并显示最大吸光度和ph7.4-7.2的级分。拒绝显示为较低ph的级分。脱盐后，将样品稀释以制备约45ml野生型或突变型cd200-fc上清液。所有纯化操作均在冰上于4℃进行。用10倍柱体积的缓冲液a(10ml20mm磷酸钠ph7.4,150mmnacl)洗涤柱子。使用20mm磷酸钠ph7.4，150mmnacl和100mm柠檬酸盐缓冲液ph3.5以线性梯度，用10倍柱体积的ph7.4-3.5梯度洗脱cd200-fc蛋白。基于sdspage数据，分离包含蛋白质的140kda二聚体形式的cd200-fc级分。使用具有10kda截留值的amiconultracentricon交换蛋白质缓冲液，并将蛋白质浓缩至约1mg/ml。图1显示野生型cd200-fc、k130y和i131y的sgs凝胶。大小排阻层析用于显示制备的cd200-fc蛋白在进行结合分析之前不在溶液中形成聚集体(图2)。实施例2：野生型和突变体cd200-fc分子的结合分析biacore实验由syngeneinternationalltd.(印度，bioconpark，plotno2&3，bommasandra工业区，bommasadra-jiganilinkroad，班加罗尔(bangalore)-560099)进行。测定法原理biacore仪器使用光学方法－表面等离子体共振(spr)来测量两个相互作用分子的结合特征；在本案中，野生型cd200-fc或cd200-fc突变体与cd200受体(cd200r)结合。该技术测量当第二分子在捕获的配偶体上方的溶液中流动时，在芯片(传感器)上捕获的两个相互作用分子之一的折射率的变化。在这些实验中，cd200-fc固定在芯片(传感器)表面上，并且cd200r在连续流动的条件下于水性缓冲液中注射到捕获的cd200-fc上。实时测量cd200r结合后cd200-fc折射率的变化，并将结果绘制为响应单位(ru)对时间作图，以生成传感图(图5a和5b)。仪器和试剂实验在gehealthcarebiacoret200上进行。表1详述了用于开发和实施测定法的试剂。表1:在biacore实验过程中使用的试剂sl.no.产品描述出售方目录号1人抗体捕获试剂盒gehealthcarebr1008-392重组人cd200r，his标签化的creativebiomartcd200r1-320h3重组人cd200，fc标签化的creativebiomartcd200-165h4重组小鼠cd200蛋白，fc嵌合体creativebiomartcd200-982m5曲妥珠单抗rochen/acd200-fc固定化使用gehealthcare试剂盒，按照制造商的说明通过胺偶联将抗人fc共价固定到biacorecm5传感器芯片上。最大固定靶设定在10000-15000ru之间。图3显示了芯片表面上的抗人fc抗体的捕获。流动池1用作参考，其中具有没有固定的配体，以允许推导与芯片表面的非特异性结合。在biacore运行缓冲液(hbs-ep+:含有2mmedta和0.05％表面活性剂p-20的10mmhepes缓冲盐水)中将fc配体稀释至0.5μg/ml。在最终的固定步骤中，将野生型cd200-fc、突变体cd200-fc和非相关对照蛋白(赫赛汀/曲妥珠单抗)以产生最小250响应单位(ru)的浓度通过芯片(分别使用流动池2、3和4)120秒，然后在运行缓冲液中稳定表面120秒。对于每个cd200r浓度重复cd200-fc捕获操作。图4显示了，如所预期的那样，cd200受体不与固定在芯片表面上的赫赛汀结合。cd200r在cd200-fc结合的芯片表面上经过在捕获fc-标签化的蛋白质后，将cd200r(以不同的浓度)流过捕获的cd200-fc和对照蛋白质120秒(以观察缔合)，然后运行120秒的运行缓冲液(以观察解离)。然后使用10mm甘氨酸-hcl(ph2)使芯片表面再生30秒(30μl/分钟流速)，然后在下一循环之前用biacore运行缓冲液将表面稳定60秒。所有cd200r浓度以下列浓度一式两份进行：1μm，500nm，250nm，125nm，62.5nm，31.25nm，15.6和0nm。数据分析结果以传感图表示，绘制为响应或共振单位(ru)与时间的关系。在bia评估软件1.0版(gehealthcare)中分析实验传感图。使用1：1朗缪尔结合模型进行曲线拟合。使用标准参数(例如配体浓度，时间)的速率方程用于迭代曲线拟合。拟合的接近度由制造商在bia评估软件1.0版中提供的算法确定。结果图4显示了，如所预期的那样，cd200受体不与固定在芯片表面上的赫赛汀结合。图5显示了cd200受体与野生型cd200-fc(图5a)和k130y突变体cd200-fc(图5b)结合的传感图。从图5中的传感图的比较可以清楚地看出，k130y以比野生型cd200-fc更大的亲和力和更慢的解离速率与cd200受体结合。表2记录了野生型和突变体cd200-fc分子的结合速率值(m-1s-1)、解离速率值(s-1)和结合亲和力值(nm)：wt，k130y，i131y，g129i，f128r，n81k。使用t1/2(s)＝0.693/koff(s-1)的关系计算半寿期。表2：突变体cd200-fc分子的结合速率值(m-1s-1)、解离速率值(s-1)和结合亲和力值(nm)实施例3：使用功能性细胞模型的分析由gvkbiosciencesprivatelimited(印度，campusmlr1，surveynos.125&126，idamallapur，hyderabad–500076)实施氧化爆发测定法。根据制造商的说明，使用商业的基于流式细胞术的试剂盒(cay601130，caymanchemicals，michigan，48108，usa)在分离的人嗜中性粒细胞中测量氧化爆发。该测定法使用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)在氧化爆发开始后通过流式细胞术定量氧化爆发。使用二氢罗丹明123(一种可透过细胞的非荧光染料)测量氧化活性，其中所述二氢罗丹明123在pma刺激后通过氧化活性转化为荧光化合物罗丹明123。具有pma刺激和没有cd200-fc温育的样品提供阳性对照。没有pma刺激的样品用作阴性背景对照。测定方案通过菲克帕克分离和葡聚糖沉降从外周血中分离人嗜中性粒细胞。将细胞悬浮于测定缓冲液(500mlrpmi基础培养基，5gbs和500μl1m氯化钙)中，浓度为1x106个细胞/ml。将细胞在37℃水浴中与参比分子(野生型cd200-fc)或cd200-fc突变体温育30分钟。接下来，将10μl体积的10x二氢罗丹明123工作原液加入到细胞中，将其在37℃在水浴中温育15分钟。用200nmpma(1mm原液)刺激细胞，并在37℃水浴中再温育45分钟。在最后的温育步骤后，将细胞在室温离心(500×g)10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于0.5ml测定缓冲液中。通过流式细胞术(bdfacsverse，bdbiosciences，新泽西，us)分析细胞。使用仅用pma处理的细胞的平均荧光强度值绘制数据，并与用pma和测试化合物(野生型cd200-fc或突变体cd200-fc)处理的细胞进行比较。graphpadprism6.0版用于执行数据分析。使用前向和侧向散射(fsc对ssc)在分析程序中对嗜中性粒细胞簇进行门控，以确保收集了合适的细胞群数据。最后，分析荧光直方图以定量野生型和突变体cd200-fc蛋白对氧化爆发的影响。数据分析使用下式测量cd200-fc介导的抑制氧化爆发：抑制百分数＝100-(100x(平均测试化合物计数－平均阴性对照计数)/(平均阳性对照计数－平均阴性对照计数)上式中的计数来自门控细胞群体的平均荧光强度值。通过单向anova和bonferroni后测试比较所有列来分析数据的统计显著性。结果表3详述了来自门控细胞群体的野生型cd200-fc、k130y和阳性和阴性对照的平均荧光强度值。图6比较了野生型cd200-fc和k130y在氧化爆发测定法中的作用。从图6中可以容易地看出，k130y突变的cd200-fc在氧化爆发测定法中以比野生型cd200-fc更低的剂量更强力地抑制pma刺激的氧化爆发。此外，功能活性的这种增加可归因于k130y突变，因为这两种蛋白质除了k130y突变外，其余均是相同的。人们认识到，嗜中性粒细胞在发炎组织中大量存在(例如，类风湿关节和滑液)，并且它们具有通过蛋白酶和有毒氧代谢物的分泌直接对组织、骨和软骨造成损害的巨大潜力，以及通过抗原呈递和分泌细胞因子、趋化因子、前列腺素和白三烯来驱动炎症(wright，h.l.等，(2010)rheumatology49，1618-1631)。因此，可以预期抑制嗜中性粒细胞活化的物质可用作炎症和自身免疫病的有用治疗，所述疾病的病理学完全或部分由异常的嗜中性粒细胞活化介导。表3：来自门控细胞群体的野生型cd200-fc、k130y和阳性和阴性对照的平均荧光强度值。来自重复实验的sd值在括号中。权利要求书(按照条约第19条的修改)1.突变的cd200蛋白，其包含在对应于seqidno:1的氨基酸残基位置130和/或131的突变，其中所述突变是选自k130y和/或i131y的替代突变。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其包含一个或多个额外的突变，例如那些选自g129i、f128r和n81k的突变。3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其包含seqidno:12或seqidno:13的序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质，其包含所述蛋白质的胞外结构域(ecd)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质，其包含seqidno:3或seqidno:4的序列。6.融合蛋白，其包含通过任选的接头部分与非cd200蛋白编码部分融合的权利要求1至5中任一项所述的蛋白质。7.根据权利要求6所述的蛋白质，其中所述接头部分是包含1至15个氨基酸的肽。8.根据权利要求6或权利要求7所述的蛋白质，其中所述非cd200蛋白编码部分是抗体或其片段。9.根据权利要求6至8中任一项所述的蛋白质，其中所述非cd200蛋白编码部分是fc片段。10.根据权利要求6至9中任一项所述的蛋白质，其包含seqidno:6或seqidno:7的序列。11.根据权利要求1至10中任一项所述的蛋白质，其是cd200受体的调节物。12.根据权利要求1至10中任一项所述的蛋白质，其是cd200受体的激动剂。13.多核苷酸，其编码权利要求1至12中任一项所述的蛋白质。14.药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项所述的蛋白质。15.根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白质，或者根据权利要求14所述的组合物，用于治疗自身免疫病。当前第1页12