CD40L-FC融合多肽及其使用方法与流程

本专利申请要求2016年5月13日提交的美国临时专利申请号62/336,129的权益，该临时专利申请通过引用以其全文并入本文。序列表的引用本申请通过引用结合作为文本文件与本申请一起提交的序列表，该文本文件名称为“cd40f-100-wo-seqlisting.txt”，其创建于2017年5月11日，并且具有41,547字节的大小。
背景技术：
：癌症一直是主要的全球健康负担。尽管在癌症的治疗方面有所进展，但对于更有效且毒性更小的疗法仍然存在未满足的医疗需求，尤其对于患有对现有治疗具有抗性的晚期疾病或癌症的那些患者。免疫系统，特别是t细胞介导的细胞毒性在肿瘤控制中的作用是公认的。有越来越多的证据表明t细胞在癌症患者中控制肿瘤生长和存活，无论是在该疾病的早期和晚期阶段。然而，肿瘤特异性t细胞应答很难在癌症患者中上升和维持。迄今为止受到显著关注的t细胞通路包括通过毒性t淋巴细胞抗原-4(ctla-4，cd152)和程序性死亡配体1(pd-l1，也被称为b7-h1或cd274)发信号。然而最近，对cd40配体(cd40l)作为肿瘤控制的介质产生了兴趣。cd40l是tnf分子家族的成员，其主要在激活的t细胞(包括th0、th1和th2亚型)上表达，并形成与该家族的其他成员类似的同源三聚体。此外，还发现cd40l在肥大细胞和激活的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。cd40l与抗原呈递细胞(apc)上的其受体cd40结合，这导致取决于靶细胞类型的许多作用。通常，cd40l起到共刺激分子的作用并通过apc上的mhc分子诱导与t细胞受体刺激相关的apc中的激活。尽管在过去十年在开发用于对抗癌症和其他疾病的策略中做出了显著的进步，但是患有晚期、难治性和转移性疾病的患者具有有限的临床选择。化疗、放射、和高剂量化疗已成为剂量限制。仍然存在对新的毒性更少的方法和具有更好的疗效、更长的临床益处、和改进的安全性特性的治疗的大量未满足的需要，特别是对于患有对现有的治疗具有抗性的晚期疾病或癌症的那些患者。技术实现要素：在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)，该融合蛋白包括经由肽接头彼此共价连接的三个cd40配体(cd40l)亚基或其片段(sccd40l)的单链融合；和fc单体，其中该sccd40l经由肽接头与fc单体共价连接。在另一个方面，本发明提供了两种融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)的二聚体，每种融合蛋白包括经由肽接头彼此共价连接的三个cd40配体(cd40l)亚基或其片段(sccd40l)的单链融合；和fc单体，其中该sccd40l经由肽接头与fc单体共价连接，并且其中该二聚体经由fc单体的相互作用而形成。在一个特定方面，本发明提供了一种含有单链融合的融合蛋白，该单链融合从n-末端到c-末端包括具有如下氨基酸序列的第一cd40l亚基：npqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl(seqidno:1)该第一cd40l亚基与具有如下氨基酸序列的第一肽接头共价连接：ggggsgggs(seqidno:2)该第一肽接头与具有如下氨基酸序列的第二cd40l亚基共价连接：qiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl(seqidno:3)该第二cd40l亚基与具有如下氨基酸序列的第二肽接头共价连接：ggggsgggs(seqidno:2)该第二肽接头与具有如下氨基酸序列的第三cd40l亚基共价连接：qiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl(seqidno:3)该第三cd40l亚基与具有如下氨基酸序列的第三肽接头共价连接：ggggsggggsggggs(seqidno:4)该第三肽接头与fc多肽共价连接。在另一个方面，本发明提供了激活cd40多肽的方法，该方法涉及使cd40多肽与根据本文描述的任何方面的分离的融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)接触。在另一个方面，本发明提供了在受试者中增强抗肿瘤免疫应答的方法，该方法涉及向受试者给予根据本文描述的任何方面的分离的融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)。在另一个方面，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法涉及向受试者给予根据本文描述的任何方面的分离的融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)，和任选的一种或多种免疫检查点抑制剂。在另一个方面，本发明提供了含有编码根据本文描述的任何方面的融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)的核酸分子的多核苷酸。在相关方面，本发明提供了含有根据本文描述的任何方面的多核苷酸的载体。在另一个相关方面，本发明提供了含有根据本文描述的任何方面的载体的宿主细胞，该宿主细胞包括表达根据本文描述的任何方面的分离的融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)的宿主细胞。在另一个方面，本发明提供了制备根据本文描述的任何方面的融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)的方法，该方法涉及培养根据本文描述的任何方面的宿主细胞；和分离融合蛋白。在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒含有本文描述的任何方面的分离的融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)、多核苷酸、载体或宿主细胞。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)结合并激活cd40(例如，cd40激动剂)。在不同的实施例中，sccd40l折叠为cd40l同源三聚体。在不同的实施例中，分离的融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)是二聚体。在不同的实施例中，cd40l亚基与fc单体的比率为3:1。在不同的实施例中，分离的融合蛋白在约21℃或更高温度下具有小于约10％的聚集，持续至少3天。在不同的实施例中，分离的融合蛋白在约21℃下具有小于约1％的聚集，持续至少7天或更长时间。在某些实施例中，分离的融合蛋白在约45℃下具有小于约10％的聚集，持续至少3天或更长时间。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，cd40l-fc融合蛋白或cd40l亚基包括与如下具有至少约85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：qiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl(seqidno:3)。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，一个或多个cd40l亚基具有在位置74处的trp残基(例如，对应于全长膜结合cd40l的位置194处的c→w取代)。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，一个或多个cd40l亚基具有人cd40l序列。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，sccd40l与fc单体的n-末端或c-末端连接。在某些实施例中，fc单体含有铰链区。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，fc单体包含人fc序列(例如，igg4氨基酸序列)。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，与这些cd40l亚基或其片段共价连接的肽接头含有约9至约20个氨基酸。在某些实施例中，与这些cd40l亚基或其片段共价连接的肽接头含有约9至约15个氨基酸。在具体的实施例中，与这些cd40l亚基或其片段共价连接的肽接头含有9个氨基酸。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，肽接头含有一个或多个甘氨酸(gly)或丝氨酸(ser)氨基酸残基。在不同的实施例中，cd40l亚基之间的接头是(gly4ser)n(seqidno:5)，其中n是选自2、3和4的正整数；(gly3ser)n(seqidno:6)，其中n选自3、4和5；gly(gly3ser)n(seqidno:7)，其中n选自2、3和4；或gly(gly2ser)n(seqidno:8)，其中n选自3、4、5和6。在具体的实施例中，该接头是ggggsggggsggggs(seqidno:4)或ggggsgggs(seqidno:2)。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)含有如下氨基酸序列：npqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsgggsqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsgggsqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsggggsggggseskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:9；sccd40l-igg4p-fp6；medi5083)；npqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsggggsggggsqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsggggsggggsqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsggggsggggseskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:10；sccd40l-igg4p-fp7)；或dpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvmlengkqltvkreglyyvytqvtfcsnrepssqrpfivglwlkpssgserillkaanthsssqlceqqsvhlggvfelqagasvfvnvteasqvihrvgfssfgllklgggsggsqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvmlengkqltvkreglyyvytqvtfcsnrepssqrpfivglwlkpssgserillkaanthsssqlceqqsvhlggvfelqagasvfvnvteasqvihrvgfssfgllklgggsggsqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvmlengkqltvkreglyyvytqvtfcsnrepssqrpfivglwlkpssgserillkaanthsssqlceqqsvhlggvfelqagasvfvnvteasqvihrvgfssfgllklggggsggggsggggsvprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvaiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk(seqidno:11；鼠类替代物fp5样，小鼠igg1d265afc)。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，融合蛋白(例如，cd40l-fc融合蛋白)结合多达六种cd40多肽。在不同的实施例中，cd40多肽在细胞上。在不同的实施例中，该细胞表达cd40多肽。在某些实施例中，该细胞是抗原呈递细胞、巨噬细胞、b细胞或树突细胞。在不同的实施例中，该细胞在受试者体内。在某些实施例中，该受试者患有癌症。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，一种或多种免疫检查点抑制剂包含pd-l1或ctla-4拮抗剂。在不同的实施例中，该pd-l1或ctla-4拮抗剂是抗体。在某些实施例中，该抗pd-l1抗体是度伐鲁单抗。在某些实施例中，该抗ctla-4抗体是曲美木单抗。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，免疫应答和/或抗癌应答增强。在本文描述的任何方面的不同的实施例中，肿瘤微环境的免疫抑制减少。定义除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下的参考文献为技术人员提供了本发明所用的多个术语的通用定义：singleton等人，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology[微生物学和分子生物学词典](第2版1994)；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology[剑桥科技词典](walker编辑，1988)；theglossaryofgenetics[遗传学词汇],第5版,r.rieger等人(编辑),springerverlag[施普林格维拉格](1991)；以及hale和marham,theharpercollinsdictionaryofbiology[哈珀科林斯生物学词典](1991)。除非另外指明，否则如本文所使用的以下术语具有以下赋予它们的含意。“抗肿瘤活性”意指任何减少或稳定化肿瘤细胞的增殖或存活的生物活性。在一个实施例中，该抗肿瘤活性是抗肿瘤免疫应答。“免疫调节剂”意指增强免疫应答(例如抗肿瘤免疫应答)的试剂。本发明的示例性免疫调节剂包括抗体，如抗ctla-4抗体、抗pd-l1抗体及其片段；以及蛋白质，如cd40l-fc融合蛋白或其片段。“cd40l多肽”意指与ncbi登录号np_000065具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有cd40结合活性的多肽或其片段。术语“cd40l”是指全长cd40l和可溶性片段两者(例如由蛋白水解生成的cd40l的细胞外结构域形式)，和cd40l的单体形式以及寡聚形式(例如三聚cd40l)。人cd40l的膜结合和可溶形式的氨基酸序列如下所示：cd40lsp|p29965|cd40l_人-膜结合形式(seqidno:12)细胞质结构域＝1-20；信号锚ii型膜蛋白区＝21-46；可溶形式＝113-261mietynqtsprsaatglpismkifmylltvflitqmigsalfavylhrrldkiedernlhedfvfmktiqrcntgerslsllnceeiksqfegfvkdimlnkeetkkensfemqkgdqnpqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslclkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklcd40l-可溶形式(seqidno:13)mqkgdqnpqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslclkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl“cd40l核酸分子”意指编码cd40l多肽的多核苷酸。示例性cd40l核酸分子序列以ncbi登录号nm_000074提供。“cd40多肽”意指与ncbi登录号np_001241具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有cd40l结合活性的多肽或其片段。以下提供了示例性cd40氨基酸序列(seqidno:14)：mvrlplqcvlwgclltavhpepptacrekqylinsqccslcqpgqklvsdctefteteclpcgesefldtwnrethchqhkycdpnlglrvqqkgtsetdtictceegwhctseacescvlhrscspgfgvkqiatgvsdticepcpvgffsnvssafekchpwtscetkdlvvqqagtnktdvvcgpqdrlralvvipiifgilfaillvlvfikkvakkptnkaphpkqepqeinfpddlpgsntaapvqetlhgcqpvtqedgkesrisvqerq“cd40核酸分子”意指编码cd40多肽的多核苷酸。示例性cd40核酸分子序列以ncbi登录号nm_001250提供。“pd-l1多肽”意指与ncbi登录号np_001254635具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有pd-1和cd80结合活性的多肽或其片段。以下提供了示例性pd-l1氨基酸序列(seqidno:15)：mrifavfifmtywhllnapynkinqrilvvdpvtseheltcqaegypkaeviwtssdhqvlsgkttttnskreeklfnvtstlrintttneifyctfrrldpeenhtaelvipelplahppnerthlvilgaillclgvaltfifrlrkgrmmdvkkcgiqdtnskkqsdthleet“pd-l1核酸分子”意指编码pd-l1多肽的多核苷酸。示例性pd-l1核酸分子序列以ncbi登录号nm_001267706提供。“抗pd-l1抗体”意指选择性结合pd-l1多肽的抗体。示例性抗pd-l1抗体描述于例如us20130034559/us8779108和us20140356353，这些专利通过引用并入本文。度伐鲁单抗(medi4736)是示例性抗pd-l1抗体。其他抗pd-l1抗体包括bms-936559(美施贵宝公司(bristol-myerssquibb))和mpdl3280a(罗氏公司(roche))。度伐鲁单抗vl(seqidno:16)eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik度伐鲁单抗vh(seqidno:17)evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsrywmswvrqapgkglewvanikqdgsekyyvdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycareggwfgelafdywgqgtlvtvss度伐鲁单抗vhcdr1(seqidno:18)gftfsrywms度伐鲁单抗vhcdr2(seqidno:19)nikqdgsekyyvdsvkg度伐鲁单抗vhcdr3(seqidno:20)eggwfgelafdy度伐鲁单抗vlcdr1(seqidno:21)rasqrvsssyla度伐鲁单抗vlcdr2(seqidno:22)dassrat度伐鲁单抗vlcdr3(seqidno:23)qqygslpwt“pd-1多肽”意指与ncbi登录号np_005009具有至少约85％氨基酸同一性、并且具有pd-l1结合活性的多肽或其片段。以下提供了示例性pd-1氨基酸序列(seqidno:24)：mqipqapwpvvwavlqlgwrpgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvvgvvggllgslvllvwvlavicsraargtigarrtgqplkedpsavpvfsvdygeldfqwrektpeppvpcvpeqteyativfpsgmgtssparrgsadgprsaqplrpedghcswpl“pd-1核酸分子”意指编码pd-1多肽的多核苷酸。示例性pd-1核酸分子序列以ncbi登录号nm_005018提供。“ctla-4多肽”意指与基因库登录号aal07473.1具有至少85％氨基酸序列同一性的多肽或其具有t细胞抑制活性的片段。以下提供了示例性ctla-4氨基酸序列(seqidno:25)：gi|15778586|gb|aal07473.1|af414120_1ctla-4[智人]maclgfqrhkaqlnlatrtwpctllffllfipvfckamhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkatevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyvidpepcpdsdfllwilaavssglffysflltavslskmlkkrsplttgvyvkmpptepecekqfqpyfipin“ctla-4核酸分子”意指编码ctla-4多肽的多核苷酸。示例性ctla-4核酸分子以基因库登录号af414120.1提供。“抗ctla-4抗体”意指选择性结合ctla-4多肽的抗体。示例性抗ctla-4抗体描述于例如：美国专利号6,682,736；7,109,003；7,123,281；7,411,057；7,824,679；8,143,379；7,807,797；和8,491,895(其中，曲美木单抗是11.2.1)，这些专利通过引用并入本文。曲美木单抗是示例性抗ctla-4抗体。以下提供了曲美木单抗的序列。曲美木单抗，美国专利号6,682,736曲美木单抗vl(seqidno:26)psslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakv曲美木单抗vh(seqidno:27)gvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardprgatlyyyyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvh曲美木单抗vhcdr1(seqidno:28)gftfssygmh曲美木单抗vhcdr2(seqidno:29)viwydgsnkyyadsv曲美木单抗vhcdr3(seqidno:30)dprgatlyyyyygmdv曲美木单抗vlcdr1(seqidno:31)rasqsinsyld曲美木单抗vlcdr2(seqidno:32)aasslqs曲美木单抗vlcdr3(seqidno:33)qqyystpft如在本披露中所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖包含抗原结合位点的任何多肽，无论它是在体外或在体内生产的。术语包括但不限于：多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、以及接合抗体。除非用术语“完整”另外修饰，如在“完整抗体”中，出于本披露的目的，术语“抗体”还包括抗体片段如fab、f(ab')2、fv、scfv、fd、dab和保留抗原结合功能(即特异性结合例如ctla-4或pd-l1的能力)的其他抗体片段。典型地，此类片段将包含抗原结合结构域。术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”是指包含负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸的抗体分子的一部分。例如，在抗原很大的情况下，抗原结合结构域可只结合抗原的一部分。负责与抗原结合结构域特异性相互作用的抗原分子的一部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域典型地包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)，然而，它不一定必须包含两者。例如，所谓的fd抗体片段仅由vh结构域组成，但是仍然保留完整抗体的一定抗原结合功能。抗体的结合片段通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解来产生。结合片段包括fab、fab'、f(ab')2、fv以及单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体以外，抗体应理解为其每个结合位点是相同的。使用酶(木瓜蛋白酶)来消化抗体的结果是两个相同的抗原结合片段，又称为“fab”片段和“fc”片段，它们不具有抗原结合活性，但具有结晶的能力。用酶(胃蛋白酶)来消化抗体的结果是f(ab')2片段，其中该抗体分子的两个臂保持链接并且包含两个抗原结合位点。f(ab')2片段具有交联抗原的能力。当本文使用时，“fv”是指保留了抗原识别和抗原结合位点两者的抗体的最小片段。当本文使用时，“fab”是指包含轻链的恒定结构域和重链的chi结构域的抗体的片段。术语“mab”是指单克隆抗体。本发明的抗体包含但不限于全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；fab、fab'、单链v区片段(scfv)、融合多肽以及非常规抗体。在本披露中，“包含(comprises、comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可以具有美国专利法赋予它们的意义并且可以意指“包括(includes、including)”等；“基本上由……组成(consistingessentiallyof或consistsessentially)”同样具有美国专利法赋予的意义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。如本文所使用的术语“确定”、“评估”、“测定”、“测量”和“检测”是指定量和定性确定两者，并且正因如此，术语“确定”本文可与“测定”、“测量”、等等互换使用。其中定量确定为目的时，使用短语“确定分析物以及类似物的量”。其中定性和/或定量确定为目的时，使用短语“确定分析物的水平”或“检测”分析物。如本文所使用的术语“fc结构域”结构域是指抗体恒定区的一部分。传统地，术语fc结构域是指涵盖抗体的配对ch2、ch3和铰链区的蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶)裂解产物。在本披露的上下文中，术语fc结构域或fc是指不管产生手段的任何多肽(或编码这样一种多肽的核酸)，其包括免疫球蛋白多肽的ch2、ch3和铰链区的全部或一部分。“融合多肽”或“融合蛋白”意指包含两种或更多种不同多肽的多肽或非天然存在于相同多肽中的其活性片段。在不同的实施例中，两种或更多种不同多肽通过肽键或肽接头共价地可操作地连接(例如化学地连接或框内融合)在一起。在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“同一”或百分比“同一性”是指当比较和比对(如有必要，引入缺口)以获得最大对应性(不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分)时相同或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。百分比同一性可以使用序列比较软件或算法或者通过目测测量。本领域中已知有可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的不同算法和软件(参见例如karlin等人，1990,proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊],87:2264-2268，如在karlin等人，1993,proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊],90:5873-5877中的改进，并且并入nblast和xblast程序(altschul等人，1991,nucleicacidsres.[核酸研究],25:3389-3402)。在某些实施例中，有缺口的blast可以如altschul等人，1997,nucleicacidsres.[核酸研究]25:3389-3402中所述的使用。blast-2、wu-blast-2(altschul等人，1996,methodsinenzymology[酶学方法],266:460-480)、align、align-2(genentech[基因泰克公司],南旧金山，加利福尼亚)或megalign(dnastar)。术语“分离的”是指基本上不含存在于其天然环境中的其他元素的分子。例如，分离的蛋白质基本上不含来自于细胞或其衍生的组织源的细胞材料或其他蛋白质。术语“分离的”也指制剂，其中分离的蛋白质是足够纯的而作为药物组合物给予，或是至少70％-80％(w/w)纯的，更优选地是至少80％-90(w/w)纯的，甚至更优选地是90％-95纯的；并且最优选地是至少95％、96％、97％、98％、99％、或100％(w/w)纯的。“参比”意指用于比较的标准。“特异性结合”意指一种试剂(例如，cd40l)识别并结合一种分子(例如，cd40多肽)，但是其基本上不识别并结合样品(例如生物样品)中的其他分子。例如，特异性结合的两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于高亲和力和区别于非特异性结合的低等至中等容量，非特异性结合通常具有中等至高等容量的低亲和力。“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、羊或猫。本文提供的范围被理解为对该范围内的所有值的简写。例如，一个1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字的组合或子范围，该组由以下组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。如本文所使用的术语“治疗(treat、treating、treatment等)”是指减少或改善障碍和/或与其相关的症状。将被理解的是，尽管不能排除，但是治疗障碍或病症并不要求完全地消除该障碍、病症或与其相关的症状。除非明确声明或从上下文显而易见，否则如本文所使用的术语“或”被理解为包括在内。除非明确声明或从上下文显而易见，否则如本文所使用的术语“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”被理解为单数的或复数的。此外，当在本文使用时，“和/或”应被理解为这两个指定的特征或组分每一者与或不与另一者的特定披露。因此，术语“和/或”如在本文在词组如“a和/或b”中使用时，旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)以及“b”(单独)。同样，术语“和/或”如在词组如“a、b和/或c”中使用时，旨在涵盖以下的实施例中的每一者：a、b、和c；a、b、或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。除非明确声明或从上下文显而易见，否则如本文所使用的术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。大约可以被理解为在声明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非从上下文显而易见，本文提供的所有数值被该术语约修饰。本文变量的任何定义中对化学基团清单的叙述包括将所述变量定义为任何单个基团或所列基团的组合。对本文变量或方面的实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。可以将本文提供的任何组合物或方法与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种进行组合。附图说明图1描绘了包含人氨基酸序列的本发明的cd40l-fc融合蛋白的示意图。如所描绘的，medi5083cd40l-fp包含3xcd40l亚基+igg4pfc(148kda)、9-glyser接头区、和突变用于发育的残基194(未配对的cys)的单链融合。亚基间接头：seqidno:2。图2是一系列代表性的高效尺寸排阻色谱法(hpsec)色谱图，描绘了在45℃下，第1天(左上)、第3天(右上)和第7天(左下)的cd40l-fc融合蛋白sccd40l-igg4p-fp7的稳定性数据，其包含c194w取代(相对于全长膜结合cd40l氨基酸序列)。图3是显示如通过nfkb荧光素酶测定所测量的medi5083稳定性样品生物活性的图。图4是描绘在hucd40293heknfkbc3细胞模型中参考medi5083和人igg4p同种型对照的cd40l-fp7的生物活性评估的图。图5是描绘在ramos-bluenfkb/ap-1b细胞模型中参考medi5083和人igg4p同种型对照的cd40l-fp7的生物活性评估的图。图6是显示medi5083刺激人原代b细胞增殖的图。图7是显示medi5083激活的和成熟的人单核细胞衍生的树突细胞(modc)的一组图。通过标记物cd80(左上)、cd83(中上)和cd86(右上)的增加显示激活。通过标记物hla-abc(左下)和hla-dr(中下)的增加显示成熟。图8是显示medi5083在人单核细胞衍生的树突细胞(modc)中诱导th1细胞因子/趋化因子应答的一组图。显示了il12p70(左上)、ifnγ(中上)、tnf-α(右上)、il-8(中下)和il-10(右下)的分泌增加。未观察到il-1β(左下)的分泌增加。图9是一组荧光激活细胞分选(facs)直方图，显示medi5083以剂量依赖性方式经由mdc激活和成熟来驱动t细胞增殖。通过流式细胞术(用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(cfse)稀释)来监测人cd4+(顶行)和cd8+(中间行)淋巴细胞的体外增殖。图10是显示medi5083将人抑制性(m2)：刺激性(m1)巨噬细胞比率转向免疫刺激表型的一组图。图11是描绘人单核细胞衍生的巨噬细胞m1/m2极化的一组图。图12是显示medi5083对人cd40具有高度特异性的图。图13是描绘小鼠替代物cd40l-fp在低应答性肿瘤模型中具有显著的抗肿瘤活性的一系列图。将来自每个治疗组的平均肿瘤体积绘制在左侧，并且将个体小鼠的应答绘制在图的右侧。图14是描绘在b16-f10肿瘤模型中小鼠替代物cd40l-fp与α-pd-l1组合的抗肿瘤活性的图。图15是描绘在b16-f10肿瘤模型中小鼠替代物cd40l-fp与α-pd-l1组合的抗肿瘤活性的一系列图。将个体小鼠的应答绘制在图上。图16是描绘在b16-f10肿瘤模型中小鼠替代物cd40l-fp与α-ctla-4组合的抗肿瘤活性的图。图17是描绘在b16-f10肿瘤模型中小鼠替代物cd40l-fp与α-ctla-4组合的抗肿瘤活性的一系列图。将个体小鼠的应答绘制在图上。图18是描绘在b16-f10肿瘤模型中小鼠替代物cd40l-fp与α-pd-l1停止的肿瘤生长组合的图。图19是描绘小鼠替代物cd40l-fp与α-pd-l1和α-ctla4中的一种或多种组合的抗肿瘤活性的一系列图。图20是描绘在b16-f10肿瘤模型中小鼠替代物cd40l-fp与α-pd-1组合的抗肿瘤活性的图。图21是描绘在b16-f10肿瘤模型中小鼠替代物cd40l-fp与α-pd-1组合的抗肿瘤活性的一系列图。将个体小鼠的应答绘制在图上。图22是描绘在b16-f10肿瘤模型中小鼠替代物cd40l-fp诱导的血清细胞因子/趋化因子分泌的一系列图。在第2次给药(t1)后的24小时观察到ifnγ(左上)、tnf-α(右上)、il12(左下)和kc/gro(右下)的增加的水平。图23是描绘在b16-f10肿瘤模型中小鼠替代物cd40l-fp诱导的血清细胞因子/趋化因子分泌的一系列图。在第4次给药(t2)后的24小时观察到ifnγ(左上)、tnf-α(右上)、il12(左下)和kc/gro(右下)的增加的水平。图24是描绘在小鼠中小鼠替代物cd40l-fp增加瘤内cd8+t细胞激活和pd-l1表达的一系列图。图25是显示在小鼠中小鼠替代物cd40l-fp驱动脾髓样细胞成熟和b细胞激活的图。图26是描绘在小鼠中小鼠替代物cd40l-fp诱导th1细胞因子和cxcl-1趋化因子分泌的一系列图。图27是描绘药代动力学和药效学(pk-pd)模型的一系列图，其描述了在猴中medi5083单剂量后的b细胞激活和运输。具体实施方式本发明的特征在于包含三个cd40配体(cd40l)亚基和fc多肽(cd40l-fc)的融合蛋白。在一个方面，cd40l-fc融合蛋白包含三个cd40配体(cd40l)亚基的单链融合和经由肽接头连接的fc单体。已经发现，cd40l亚基之间长度为9个氨基酸或更长的肽接头保持稳定性和/或不引起此类融合蛋白的聚集。这与经由长度大于8个氨基酸的肽接头连接时易于聚集的其他tnf家族配体相反。因此，本发明至少部分地基于这些发现。本发明的特征还在于包含cd40l-fc融合蛋白(例如，medi5083)的用于治疗癌症的组合物和方法。在不同的实施例中，cd40l-fc融合蛋白(例如，medi5083)与免疫检查点抑制剂组合给予，该免疫检查点抑制剂包括抗ctla-4抗体和/或抗pd-l1抗体中的一种或多种。如本文下面所报道的，用这些试剂的治疗在小鼠肿瘤模型中减少了肿瘤体积和/或延迟了肿瘤生长。cd40l-fc融合蛋白本发明提供了cd40l-fc融合蛋白，该cd40l-fc融合蛋白包含经由肽接头彼此共价连接的三个cd40配体(cd40l)亚基或其片段(sccd40l)的单链融合，和经由肽接头与sccd40l共价连接的fc单体。在不同的方面，融合蛋白的三个cd40l亚基被排列成使得肽接头将cd40l亚基的c-末端连接到另一个cd40l亚基的n-末端。因此，本发明的融合蛋白从n-末端到c-末端包含如下部分，该部分包含经由肽接头与第二cd40l亚基的n-末端连接的第一cd40l亚基的c-末端和与第三cd40l亚基的n-末端连接的第二cd40l亚基的c-末端。在不同的实施例中，三个cd40l亚基的单链融合经由c-末端或n-末端的肽接头与fc多肽连接。即fc多肽的n-末端的n-末端与三个cd40l亚基的单链融合的第三cd40l亚基的c末端连接，或fc多肽的c-末端与三个cd40l亚基的单链融合的第一cd40l亚基的n-末端连接。cd40l(也被称为cd154、cd40配体、gp39或tbam)是33kda，ii型膜糖蛋白(swiss-protacc-nop29965)。另外地，存在较短的18kdacd40l可溶形式(也被称为scd40l或可溶性cd40l)。cd40l的这些可溶形式通过膜结合蛋白的蛋白水解加工产生，但是在没有更高级寡聚化(例如三聚化)的情况下，可溶性物种的细胞活性很弱。cd40l结合并激活cd40。在不同的实施例中，cd40l-fc融合蛋白包含三个cd40l亚基(其自组装成cd40l三聚体)的区域。在一个方面，cd40l-fc融合蛋白组装成多聚体形式，能够结合cd40并且刺激至少一种cd40介导的活性。在不同的实施例中，cd40l亚基具有来自人cd40l的氨基酸序列。另外的cd40l同源物包括来自小鼠、鸡、恒河猴、猕猴、大鼠和兔的那些。cd40l-fc融合蛋白中cd40l亚基的组合可以是同源的或异聚的。在一些实施例中，cd40l-fc融合蛋白中所有cd40l亚基的氨基酸序列是同一的。在其他实施例中，cd40l-fc融合蛋白中至少两个cd40l亚基的氨基酸序列是不同的。本发明的cd40l-fc融合蛋白包含与抗体(例如，igg)的结构域或片段(包括但不限于fc结构域)融合的cd40l三聚体。在一个特定实施例中，本发明的cd40l-fc融合蛋白包含一个与fc结构域融合的cd40l三聚体。在一些实施例中，本发明的cd40l-fc融合蛋白经由fc结构域二聚化。在某些实施例中，fc结构域具有igg4pfc结构域的氨基酸序列。igg4pfc是igg4片段可结晶γ(fcγ)结构域，其含有在位置228处(根据eu编号)的铰链区的丝氨酸至脯氨酸取代。igg4pfc中的丝氨酸至脯氨酸取代促进稳定性、赋予完整的重链间二硫键形成、和/或经由“半抗体交换”防止二聚体的重组(nirula等人(2011)curr.opin.rheumatol.[风湿病学新见]23(1):119-124；aalberse等人(2009)clin.exp.allergy[临床与实验过敏期刊]39(4):469-477)。在具体的实施例中，igg4pfc结构域的氨基酸序列是人序列。在本领域已知的是，fc区的变体(例如，氨基酸取代和/或添加和/或缺失)增强或降低抗体的效应子功能。因此，在某些实施例中，本发明的cd40l-fc融合蛋白包含fc结构域，并且在该fc结构域中具有一个或多个改变以使cd40l-fc融合蛋白的功能特性改变。在某些实施例中，本发明的cd40l-fc融合蛋白包含fc结构域，并且在该fc结构域中具有一个或多个改变以减少或消除至少一种fcγr介导的效应子功能。在不同的方面，本披露提供了具有igg4fc的cd40l-fc融合蛋白，该igg4fc在选自下组的一个或多个位置处包含至少一个修饰，该组由以下组成：228和235，如通过如在卡巴特中列出的eu索引编号的。在仍另一个特定方面，该fc区是一个igg4fc区，并且变体氨基酸是228p、235e以及235y中的一个或多个，如通过如在卡巴特中列出的eu索引编号的。本发明的cd40l-fc融合蛋白中的cd40l亚基和fc多肽通过多肽接头连接，其中每个接头与至少两个多肽或亚基融合。cd40l-fc融合蛋白中的接头的组合可以是同源的或异聚的。在一些实施例中，存在于本发明的cd40l-fc融合蛋白中的所有肽接头的氨基酸序列都是同一的。在其他实施例中，存在于本发明的cd40l-fc融合蛋白中的至少两个肽接头的氨基酸序列是不同的。接头多肽应该具有适合以这样一种方式连接两个或更多个单体亚基的长度，在该方式中它们相对于彼此采取正确的构象，这样使得它们保留所希望的活性。将天然存在的以及人工的肽接头用于将多肽连接进新颖的连接的融合多肽中在文献中是熟知的。因此，融合两个或更多个单体亚基的接头是天然接头、人工接头或其组合。如本文所述的，已经发现，cd40l亚基之间长度为9个氨基酸或更长的肽接头保持稳定性和/或不引起此类融合蛋白的聚集。因此，多肽接头包含9个至约20个氨基酸残基、9个至约15个氨基酸残基、或9个氨基酸残基。选择被包含在该多肽接头中的氨基酸残基应该展示出不显著地干扰本发明的cd40l-fc融合蛋白的活性或功能的特性。因此，多肽接头应该大体上不展示出将与本发明的cd40l-fc融合蛋白的活性或功能不一致的职责(charge)，或干扰内部折叠，或与一个或多个单体亚基中的氨基酸残基形成键或其他相互作用，这将严重地妨碍结合。在不同的实施例中，多肽接头具有构象柔性。合适的柔性接头包括具有gly和ser残基的组合的那些，其中gly与ser的比率≥1。在一些实施例中，多肽接头序列包含(g-g-g-g-x)n(seqidno:34)氨基酸序列，其中x是丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、甘氨酸(g)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)或缬氨酸(v)，并且n是正整数。在某些实施例中，多肽接头序列包含(g-g-g-s)n(seqidno:6)、(g-g-g-g-s)n(seqidno:5)、g(g-g-g-s)n(seqidno:7)、(g-g-g-g-g)n(seqidno:35)或(g-g-g-g-a)n(seqidno:36)氨基酸序列，其中n是正整数。在一些实施例中，多肽接头是固有非结构化的天然的或人工的多肽(参见例如，schellenberger等人，naturebiotechnol.[自然生物技术]27:1186-1190,2009；还参见sickmeier等人，nucleicacidsres.[核酸研究]35:d786-93,2007)。在某些实施例中，cd40l亚基之间的接头是(gly4ser)n(seqidno:5)，其中n是选自2、3和4的正整数；(gly3ser)n(seqidno:6)，其中n选自3、4和5；gly(gly3ser)n(seqidno:7)，其中n选自2、3和4；或gly(gly2ser)n(seqidno:8)，其中n选自3、4、5和6。在具体的实施例中，该接头是ggggsggggsggggs(seqidno:4)或ggggsgggs(seqidno:2)。在某些实施例中，cd40lfc融合蛋白含有单链融合，该单链融合从n-末端到c-末端包括具有如下氨基酸序列的第一cd40l亚基：npqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl(seqidno:1)该第一cd40l亚基与具有如下氨基酸序列的第一肽接头共价连接：ggggsgggs(seqidno:2)该第一肽接头与具有如下氨基酸序列的第二cd40l亚基共价连接：qiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl(seqidno:3)该第二cd40l亚基与具有如下氨基酸序列的第二肽接头共价连接：ggggsgggs(seqidno:2)该第二肽接头与具有如下氨基酸序列的第三cd40l亚基共价连接：qiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllkl(seqidno:3)该第三cd40l亚基与具有如下氨基酸序列的第三肽接头共价连接：ggggsggggsggggs(seqidno:4)该第三肽接头与fc多肽共价连接。在具体的实施例中，cd40lfc融合蛋白包含以下的氨基酸序列中的一个或由其组成：npqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsgggsqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsgggsqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsggggsggggseskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk；(seqidno:9；sccd40l-igg4p-fp6；medi5083)；npqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsggggsggggsqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsggggsggggsqiaahviseasskttsvlqwaekgyytmsnnlvtlengkqltvkrqglyyiyaqvtfcsnreassqapfiaslwlkspgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvnvtdpsqvshgtgftsfgllklggggsggggsggggseskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk；(seqidno:10；sccd40l-igg4p-fp7)；或dpqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvmlengkqltvkreglyyvytqvtfcsnrepssqrpfivglwlkpssgserillkaanthsssqlceqqsvhlggvfelqagasvfvnvteasqvihrvgfssfgllklgggsggsqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvmlengkqltvkreglyyvytqvtfcsnrepssqrpfivglwlkpssgserillkaanthsssqlceqqsvhlggvfelqagasvfvnvteasqvihrvgfssfgllklgggsggsqiaahvvseansnaasvlqwakkgyytmksnlvmlengkqltvkreglyyvytqvtfcsnrepssqrpfivglwlkpssgserillkaanthsssqlceqqsvhlggvfelqagasvfvnvteasqvihrvgfssfgllklggggsggggsggggsvprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvaiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk(seqidno:11；鼠类替代物fp5样，小鼠igg1d265afc)。抗肿瘤疗法本文提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括将cd40l-fc融合蛋白(例如，medi5083)单独地给予或与免疫检查点抑制剂(例如，抗ctla4抗体、抗pd-l1抗体和/或抗pd-1抗体或其抗原结合片段)组合给予。如本文所示，将cd40l-fc融合蛋白(例如，medi5083)单独地给予或与抗ctla4抗体、抗pd-l1抗体和/或抗pd-1抗体组合给予导致小鼠肿瘤模型中肿瘤体积减少。在某些方面，将cd40l-fc融合蛋白(例如，medi5083)单独地给予或与抗ctla4抗体、抗pd-l1抗体和/或抗pd-1抗体组合给予至患有实体瘤的患者。使用癌症疗法(包括单独的cd40l-fc融合蛋白(例如，medi5083)或与抗ctla4抗体、抗pd-l1抗体和/或抗pd-1抗体组合的cd40l-fc融合蛋白(例如，medi5083))的治疗包括例如减少癌症的进展速率、阻滞或稳定化肿瘤生长、肿瘤收缩和/或肿瘤消退。在一些方面，肿瘤生长的减少或阻滞可以是统计学上显著的。可以通过与基线处的患者肿瘤的生长、针对预期的肿瘤生长、针对基于大的患者群体的预期肿瘤生长或针对对照群体的肿瘤生长进行比较来测量肿瘤生长的减少。在其他实施例中，本发明的这些方法增加存活。对给予癌症疗法的临床应答可以使用临床医生已知的诊断技术来评估，这些诊断技术包括但不限于磁共振成像(mri)扫描、x-射线照相成像、计算机断层照相(ct)扫描、流式细胞术或荧光激活的细胞分选器(facs)分析、组织学、宏观病理学、以及血液化学，包括但不限于可通过elisa、ria和色谱法可检测到的改变。t细胞调控通路有越来越多的证据表明t细胞在癌症患者中控制肿瘤生长和存活，无论是在该疾病的早期和晚期阶段。然而，肿瘤特异性t细胞应答很难在癌症患者中上升和维持。受到显著关注的t细胞调控通路通过毒性t淋巴细胞抗原-4(ctla-4，cd152)和程序性死亡配体1(pd-l1，也被称为b7h-1或cd274)发信号。ctla-4在激活的t细胞上表达，并随着cd28介导的t细胞激活作为共抑制剂以抑制t细胞应答。ctla-4被认为在tcr接合之后调节幼稚和记忆性t细胞的早期激活幅度，并且是影响抗肿瘤免疫和自身免疫两者的中央抑制通路的一部分。ctla-4在t细胞上表达，并且其配体cd80(b7.1)和cd86(b7.2)的表达主要限于抗原呈递细胞、t细胞、和其他免疫介导的细胞。已经报道了阻断ctla-4信号通路的拮抗性抗ctla-4抗体增强t细胞激活。一个这种抗体(伊匹单抗(ipilimumab))在2011年被fda批准用于转移性黑色素瘤的治疗。另一个抗ctla-4抗体曲美木单抗，在iii期试验中测试了对于晚期黑色素瘤的治疗，但相比当时的标准治疗(替莫唑胺或达卡巴嗪)没有显著增加患者的总体存活。pd-l1也是涉及控制t细胞激活的受体和配体的复杂系统的一部分。在正常组织中，pd-l1在t细胞、b细胞、树突细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓源性肥大细胞以及不同非造血细胞上表达。它的正常功能是通过与它的两个受体程序性死亡1(也被称为pd-1或cd279)和cd80(也被称为b7-1或b7.1)的相互作用来调节t细胞激活与耐受之间的平衡。pd-l1还通过肿瘤来表达并且在多个部位上起作用以帮助肿瘤避开由宿主免疫系统进行的检测和消除。pd-l1在宽范围的癌症中高频率地表达。在一些癌症中，pd-l1的表达与存活减少与不利预后相关。阻断pd-l1与其受体(例如pd-1)之间的相互作用的抗体能够在体外解除pd-l1依赖性免疫抑制作用并且增强抗肿瘤t细胞的细胞毒性活性。cd40l是tnf分子家族的成员，其主要在激活的t细胞(包括th0、th1和th2亚型)上表达，并形成与该家族的其他成员类似的同源三聚体。此外，还发现cd40l在肥大细胞和激活的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。cd40l与抗原呈递细胞(apc)上的受体cd40结合，这导致取决于靶细胞类型的许多作用。通常，cd40l起到共刺激分子的作用并通过apc上的mhc分子诱导与t细胞受体刺激相关的apc中的激活。通过cd40l穿过受体cd40发信号引发一系列事件，这些事件导致携带cd40的细胞的激活和最佳t细胞初免。更具体地，cd40l和cd40之间的同源相互作用促进b细胞分化成抗体分泌细胞和记忆b细胞(burkly,于以下中：adv.exp.med.bio.[实验医学和生物学进展],第489卷,d.m.monroe,u.hedner,m.r.hoffman,c.negrier,g.f.savidge,以及g.c.i.white,编辑.kloweracademic/plenumpublishers[克鲁维尔学术/普雷纳姆出版社],2001,第135页)。另外地，cd40l和cd40之间的相互作用通过巨噬细胞和树突细胞的激活以及天然杀伤细胞和细胞毒性t淋巴细胞的产生来促进细胞介导的免疫(参见burkly，同上)。单链fc融合蛋白本发明的单链cd40lfc融合蛋白表现出稳定性和生物活性。如本文所述的，cd40l稳定性和活性至少部分是由于本发明的cd40lfc融合蛋白中使用的接头的长度。这是出人意料并且未预期到的，因为其他tnf配体fc融合蛋白已经产生，但是当使用长度大于8个氨基酸的肽接头时倾向于聚集。本发明的cd40lfc融合蛋白还提供单链fc蛋白的其他特征和优点。已知tnf配体家族的天然存在的可溶性细胞因子成员展示出它们作为同源三聚体的生物活性。然而，tnf配体的三聚体复合物倾向于经由它们的单体的解离而变性，并且难以从重组单体单元制备。为了防止同源三聚体解离成单体，tnf配体的至少三个单体经由它们的c-末端和n-末端通过肽接头彼此共价连接，以形成“单链(sc)”分子。因此，整个分子(具有两个肽接头的tnf配体家族成员的至少三个单体)由单个蛋白链组成，使得不再能够发生解离成单体。此外，如在本发明的单链融合蛋白中，将tnf配体与fc结构域融合可用于获得二聚化三聚体。可溶性结构域的二聚化是经由二硫桥键组装两个fc结构域完成的。细胞或邻近细胞上单链tnf配体的局部富集具有增加这些融合蛋白的生物活性的潜力。抗pd-l1抗体度伐鲁单抗(medi4736)是示例性抗pd-l1抗体，其对pd-l1有选择性并且阻断pd-l1与pd-1和cd80受体的结合。度伐鲁单抗可以在体外解除pd-l1介导的对人t细胞激活的抑制，并且经由t细胞依赖性机制在异种移植物模型中抑制肿瘤生长。关于用于本文提供的方法中的度伐鲁单抗(或其片段)的信息可以发现于美国专利号8,779,108，该专利的披露通过引用以其全文并入本文。度伐鲁单抗的片段可结晶(fc)结构域在igg1重链的恒定结构域中含有三重突变，该三重突变减少与负责介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的补体组分c1q和fcγ受体的结合。用于本文提供的这些方法中的度伐鲁单抗和其抗原结合片段包含重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在一个特定方面，用于本文提供的这些方法中的度伐鲁单抗或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区。在一个特定方面，用于本文提供的这些方法中的度伐鲁单抗或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含上文所示的kabat定义的cdr1、cdr2和cdr3序列，并且其中该轻链可变区包含上文所示的卡巴特定义的cdr1、cdr2和cdr3序列。本领域的普通技术人员将能够容易地鉴定本领域技术人员已知的乔西亚(chothia)定义的、abm定义的或其他的cdr定义。在一个特定方面，用于本文提供的这些方法中的度伐鲁单抗或其抗原结合片段包含如在美国专利号8,779,108中所披露的2.14h9opt抗体的可变重链和可变轻链cdr序列，该专利通过引用以其全文并入本文。抗ctla-4抗体特异性结合ctla-4并抑制ctla-4活性的抗体用于增强抗肿瘤免疫应答。关于用于本文提供的方法中的曲美木单抗(或其抗原结合片段)的信息可以发现于us6,682,736(其中它被称为11.2.1)，该专利的披露通过引用以其全文并入本文。曲美木单抗(也被称为cp-675,206、cp-675、cp-675206、和替西木单抗(ticilimumab))是一种人类igg2单克隆抗体，该单克隆抗体对于ctla-4有高度选择性并阻断ctla-4与cd80(b7.1)和cd86(b7.2)的结合。它已显示导致体外免疫激活，并且用曲美木单抗治疗的一些患者已显示出肿瘤消退。用于本文提供的这些方法中的曲美木单抗包含重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在一个特定方面，用于本文提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含上文所示的氨基酸序列，该重链可变区包含上文所示的氨基酸序列。在一个特定方面，用于本文提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含上文所示的卡巴特(kabat)定义的cdr1、cdr2和cdr3序列，并且其中该轻链可变区包含上文所示的卡巴特定义的cdr1、cdr2和cdr3序列。本领域的普通技术人员将能够容易地鉴定本领域技术人员已知的乔西亚(chothia)定义的、abm定义的或其他的cdr定义。在一个特定方面，用于本文提供的方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包含如在us6,682,736中所披露的11.2.1抗体的可变重链和可变轻链cdr序列，该专利通过引用以其全文并入本文。其他抗ctla-4抗体描述于例如us20070243184中。在一个实施例中，该抗ctla-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)，也被称作mdx-010；bms-734016。抗体选择性结合ctla-4和pd-l1并且抑制ctla-4和pd-l1的结合或激活的抗体可用于本发明方法。一般而言，抗体的制备可以例如使用传统的杂交瘤技术(kohler和milstein(1975)nature[自然],256:495-499)，重组dna方法(美国专利号4,816,567)，或用抗体、文库进行的噬菌体展示(clackson等人(1991)nature[自然],352:624-628；marks等人(1991)j.mol.biol.[分子生物学杂志],222:581-597)。对于其他抗体生产技术，还参见antibodies:alaboratorymanual[抗体：实验室手册],harlow等人编辑,coldspringharborlaboratory[冷泉港实验室],1988。本发明不限于任何具体的来源、起源物种、生产方法。完整抗体(也被称为免疫球蛋白)典型地是四聚体糖基化蛋白质，该四聚体糖基化蛋白质由每个大约25kda的两条轻(l)链和每个大约50kda的两条重链(h)构成。被指定为λ链和κ链的两种类型的轻链发现于抗体中。取决于重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分为五个大类：a、d、e、g、和m，并且有些可进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、和iga2。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型在本领域中是熟知的。对于抗体结构的综述，参见harlow等人，同上。简单地说，每个轻链由一个n-末端可变结构域(vl)和一个恒定结构域(cl)构成。每个重链由一个n-末端可变结构域(vh)、三个或四个恒定结构域(ch)和铰链区构成。最邻近vh的ch结构域被指定为ch1。vh和vl结构域由称为框架区(fr1、fr2、fr3、和fr4)的相对保守序列的四个区域组成，这些框架区为称为互补性决定区(cdr)的高变序列的三个区域形成一个支架。cdr含有大多数负责与抗原特异性相互作用的残基。三个cdr被称为cdr1、cdr2和cdr3。重链上的cdr组分被称为h1、h2和h3，而轻链上的cdr组分相应地被称为l1、l2、和l3。cdr3和特别是h3，是抗原结合结构域中分子多样性的最大来源。例如，h3可以是短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸残基。fab片段(抗原结合片段)由通过恒定区之间的二硫键共价连接的vh-ch1和vl-cl结构域组成。为了克服fv中非共价连接的vh和vl结构域在宿主细胞中共表达时解离的倾向，可构建一个所谓的单链(sc)fv片段(scfv)。在scfv中，柔性和足够长的多肽将vh的c-末端链接至vl的n-末端或将vl的c-末端链接至vh的n-末端。最通常地，一个15残基的(gly4ser)3肽可用作接头，但是其他接头在本领域中也是已知的。抗体多样性是编码可变区和各种体细胞事件的多个种系基因的组合装配的结果。体细胞事件包括具有多样性(d)的可变基因区段和连接(j)基因区段的重组来构成一个完整的vh区以及可变基因区段和连接基因区段的重组来构成一个完整的vl区。重组过程本身是不精确的，导致在v(d)j交叉点的氨基酸的缺失或添加。多样性的这些机制发生在抗原暴露之前的发育的b细胞中。抗原刺激后，b细胞中表达的抗体基因经历体细胞突变。基于种系基因区段的估计的数目、这些区段的随机重组和随机vh-vl配对，可产生多达1.6×107个不同的抗体(fundamentalimmunology[基础免疫学],第3版,paul编辑,ravenpress[雷文出版社],newyork[纽约市],n.y.[纽约州],1993)。当将促进抗体多样性(如体细胞突变)的其他方法考虑在内时，据认为可以潜在地产生多于1×1010个不同的抗体(immunoglobulingenes[免疫球蛋白基因],第2版,jonio等人编辑,academicpress,sandiego,calif.[加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社],1995)。由于许多方法涉及抗体多样性，独立地产生的抗体在多个cdr中将具有同一的或甚至基本上相似的氨基酸序列是极不可能的。本文提供了示例性抗ctla-4和抗pd-l1cdr的序列。用于携带cdr的结构将大体上是一个抗体重链或轻链或其一部分，其中该cdr位于对应于天然存在的vh和vl的cdr的位置。可以确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置，例如，如kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest[免疫学感兴趣的蛋白质序列],第91-3242号,nationalinstitutesofhealthpublications[国立卫生研究院出版物],bethesda[贝塞斯达],md.[马里兰州],1991中所述的。本发明的抗体(例如抗ctla-4、抗pd-l1)可任选地包含抗体恒定区或其部分。例如，vl结构域可以具有在其c-末端附接的抗体轻链恒定结构域，包括人cκ或cλ链。类似地，基于vh结构域的特定的抗原结合结构域可以具有附接一个免疫球蛋白重链的全部或一部分，该免疫球蛋白重链衍生自任何抗体同位素，例如igg、iga、ige和igm，和任何该同位素子类，其包括但不限于igg1和igg4。本领域的普通技术人员将认识到，本发明的抗体可用于检测、测量和抑制与ctla-4和pd-l1有些不同的蛋白质。预期这些抗体可以保持结合的特异性，只要靶蛋白质包含与至少100个、80个、60个、40个、或20个连续氨基酸的任何序列(如本文所述)具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、或更高同一性的序列。百分比同一性是通过标准比对算法来确定，这些标准比对算法例如像altshul等人((1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志],215:403-410)描述的基本局部比对工具(blast)，needleman等人((1970)j.mol.biol.,48:444-453)的算法，或meyers等人((1988)comput.appl.biosci.[计算机应用生物科学],4:11-17)的算法。除了序列同源性分析，可以进行表位作图(参见例如，epitopemappingprotocols[表位作图实验方案],morris编辑,humanapress[胡玛纳出版社],1996)和二级和三级结构分析，以鉴定由所披露的抗体假定的具体3d结构和它们与抗原的复合物。此类方法包括但不限于：x射线晶体学(engstom(1974)biochem.exp.biol.[生物化学实验生物学],11:7-13)和本披露抗体的虚拟表现形式的计算机建模(fletterick等人(1986)computergraphicsandmolecularmodeling[计算机图形学和分子建模],在currentcommunicationsinmolecularbiology[分子生物学现代通讯]中,coldspringharborlaboratory[冷泉港实验室],coldspringharbor[冷泉港],n.y.[纽约州])。衍生物本发明的多肽(例如，cd40l)和抗体(例如抗ctla-4、抗pd-l1)可以包括这些序列的变体，其保留了特异性结合它们的靶标的能力。此类变体可以由熟练的技术人员通过使用本领域中熟知的技术从这些多肽或抗体的序列中衍生而来。例如，可以在fr和/或cdr中制造氨基酸取代、缺失、或添加。在fr中的改变一般被设计来改善抗体的稳定性和免疫原性，而在cdr中的改变典型地被设计来增加抗体对它的靶标的亲和力。fr的变体还包括天然存在的免疫球蛋白同种异型。此类亲和力增加的改变可凭经验通过涉及改变cdr和测试其靶标的亲和抗体的常规技术来确定。例如，可以在所披露的cdr中的任一个中制造保守的氨基酸取代。可以根据antibodyengineering[抗体工程],第2版,oxforduniversitypress[牛津大学出版社],borrebaeck编辑,1995中所述的方法进行不同改变。这些包括但不限于由在序列内编码功能上等效的氨基酸残基的不同密码子的取代改变的核苷酸序列，从而产生“沉默”的改变。例如，非极性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸以及组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本发明的多肽和/或抗体的衍生物和类似物可以通过本领域中熟知的不同技术来生产，这些技术包括重组的和合成的方法(maniatis(1990)molecularcloning,alaboratorymanual[分子克隆，实验室手册],第2版,coldspringharborlaboratory[冷泉港实验室],coldspringharbor[冷泉港]n.y.[纽约州]，和bodansky等人(1995)thepracticeofpeptidesynthesis[肽合成的实践],第2版,springverlag[施普林格出版社],柏林,德国)。在一个实施例中，用于制造为本发明vh结构域的氨基酸序列变体的vh结构域的方法包含如下步骤：在当前披露的vh结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代、或插入一个或多个氨基酸，任选地将这样提供的vh结构域与一个或多个vl结构域组合，并测试该vh结构域或vh/vl组合或特异性结合抗原的组合。可采用类似方法，其中将本文披露的vl结构域的一个或多个序列变体与一个或多个vh结构域组合。stemmer(nature[自然](1994)370:389-391)也披露了类似改组或组合技术，描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术但观察到该方法可用于产生抗体。在进一步的实施例中，人们可以使用一个或多个选择的vh和/或vl基因的随机诱变产生携带衍生自本文所披露的序列的一个或多个序列的新颖的vh或vl区。gram等人(proc.nat.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊](1992)89:3576-3580)描述了一个这种技术，易错pcr。可使用的另一个方法是将诱变引导至vh或vl基因的cdr。barbas等人(proc.nat.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊](1994)91:3809-3813)和schier等人(j.mol.biol.[分子生物学杂志](1996)263:551-567)披露了此类技术。类似地，一个或多个或所有三个cdr可以接合至vh或vl结构域的谱系中，然后针对对ctla-4或pd-l1具有特异性的抗原结合片段来对这些结构域进行筛选。免疫球蛋白可变结构域的一部分将包含大致上如本文阐述的cdr中的至少一个，以及任选地，来自如本文阐述的scfv片段的干预框架区。该部分可包括fr1和fr4中的一个或两个的至少约50％，该50％为fr1的c-末端50％和fr4的n-末端50％。可变域的实质性部分的n-末端或c-末端的另外的残基可以是通常不与天然存在的可变域区域相关的那些残基。例如，通过重组dna技术构建的抗体可导致由所引入的接头编码的n-或c-末端残基的引入以便促进克隆或其他操纵步骤。其他操纵步骤包括引入接头以将可变结构域连接至另外的蛋白质序列，这些蛋白质序列包括免疫球蛋白重链恒定区、其他可变结构域(例如在双抗体产生中)、或蛋白质的标签，如在下文更详细地讨论。熟练的技术人员将认识到，本发明的抗体可以包含抗原结合片段，该抗原结合片段仅含有来自vl或vh结构域的单个cdr。这些单链特异性结合结构域中的任一个可以用于筛选能够形成一个双结构域特异性抗原结合片段的互补结构域，该抗原结合片段能够例如结合到ctla-4和pd-l1。本文所述的本发明的抗体(例如，抗ctla-4和/或抗pd-l1)可连接至另一功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(白蛋白、另一种抗体等)。例如，这些抗体可以通过化学交联或通过重组方法连接。这些抗体还可以按以下专利中所列出的方式连接至多种非蛋白质聚合物例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯中的一种：美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337。这些抗体可以通过共价缀合至一种聚合物而被化学地修饰，例如来增加它们的循环半衰期。示例性聚合物和附接这些抗体的方法还在美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546中示出。所披露的抗体还可以改变以具有与天然模式不同的糖基化模式。例如，一个或多个碳水化合物部分可以被删除和/或一个或多个糖基化位点可以被添加至原始抗体。将糖基化位点添加至当前披露的抗体可以通过改变氨基酸序列以含有本领域中已知的糖基化位点共有序列来实现。在抗体上增加碳水化合物部分的数目的另一种手段是通过使糖苷与抗体的氨基酸残基进行化学或酶促偶联。此类方法描述在wo87/05330中以及在aplin等人(1981)crccrit.rev.biochem.[crc生物化学关键评论],22:259-306中。将任何碳水化合物部分从抗体除去可以通过化学或酶促方法来实现，例如，如hakimuddin等人(1987)arch.biochem.biophys.[生物化学与生物物理学集刊],259:52；和edge等人(1981)anal.biochem.[分析生物化学],118:131，以及通过thotakura等人(1987)meth.enzymol.[酶学方法],138:350中所述的。抗体也可以用可检测或功能性标记来加标记。可检测标记包括放射性标记，如131i或99tc，可使用常规化学来将它们附接至抗体。可检测标记还包括酶标记，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。可检测标记进一步包括化学部分，如生物素，其可经由结合至特定同源可检测部分(例如标记的抗生物素蛋白)来检测。在本发明的范围内涵盖cdr序列仅在非本质上与本文所列出的抗体不同的抗体。典型地，一个氨基酸被具有类似电荷、疏水性、或立体化学特征的相关氨基酸取代。此类取代将在技术人员的普通技能之内。不像在cdr中，可以在fr中进行更多实质性的改变，而不对抗体的结合特性造成不利影响。对fr的改变包括但不限于人源化非人衍生的或工程化某些框架残基，这些框架残基对于抗原接触或将结合位点稳定化是重要的，例如，改变恒定区的类或亚类，改变可能改变效应子功能(如fc受体结合)的特定氨基酸残基(例如，如在美国专利号5,624,821和5,648,260和lund等人(1991)j.immun.[免疫学杂志]147:2657-2662以及morgan等人(1995)immunology[免疫学]86:319-324中所述的)，或改变衍生恒定区的物种。本领域的技术人员将理解，以上所述的修改不是全部详尽的，并且由于本披露的传授，许多其他的修改将对熟练的技术人员是显而易见的。共同疗法使用如本文提供的本发明的组合(如单独的cd40l-fc融合蛋白、或cd40l-fc融合蛋白与免疫检查点抑制剂(例如，抗ctla4抗体、抗pd-l1抗体和/或抗pd-1抗体或其抗原结合片段)组合)来治疗患有实体瘤的患者可导致累加或协同作用。如本文所使用的术语“协同”是指疗法的组合(例如，cd40l-fc融合蛋白、抗ctla-4抗体和抗pd-l1抗体的组合)。在一些实施例中，疗法的组合(例如，cd40l-fc融合蛋白、抗ctla4抗体和抗pd-l1抗体的组合)的协同作用可以允许使用更低剂量的一种或多种治疗剂和/或以更少的频率向患有实体瘤的患者给予所述治疗剂。例如，利用更低剂量的治疗剂和/或以更少频率给予所述疗法的能力具有减少与向受试者给予所述疗法相关的毒性而不减少所述疗法在实体瘤的治疗中的功效的潜力。在共同疗法中，cd40l-fc融合蛋白、抗ctla-4抗体和抗pd-l1抗体的组合可以在一次或多次单独给予中一次一起给予。此外，协同作用可以导致治疗剂在实体瘤的管理、治疗或改善中改进的功效。治疗剂的组合的协同作用可避免或减少与使用任一单一疗法相关的不良或不需要的副作用。cd40l-fc融合蛋白产生本发明的cd40l-fc融合蛋白的重组表达需要构建含有编码该cd40l-fc融合蛋白的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得了编码cd40l-fc融合蛋白的多核苷酸，便可以使用本领域熟知的技术通过重组dna技术生产用于产生该cd40l-fc融合蛋白的载体。因此，提供了用于通过表达含有编码cd40l-fc融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域的技术人员熟知的方法构建含有编码cd40l或fc多肽的序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组dna技术、合成技术以及体内基因重组。因此，本发明提供了包含编码本发明的cd40l-fc融合蛋白的核苷酸序列(可操作地连接至启动子)的可复制载体。通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞中，并且然后通过常规技术培养经转染的细胞，以产生本发明的cd40l-fc融合蛋白。因此，本发明包括含有编码本发明的cd40l-fc融合蛋白的多核苷酸(可操作地连接至异源性启动子)的宿主细胞。合适的宿主细胞包括但不限于微生物，如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)。可以利用多种宿主表达载体系统表达本发明的cd40l-fc融合蛋白。此类宿主表达系统代表通过其可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的媒介物，但还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时，可以原位表达本发明的cd40l-fc融合蛋白的细胞。这些包括但不限于用含有cd40l-fc融合蛋白编码序列的重组细菌噬菌体dna、质粒dna或粘粒dna表达载体转化的微生物，如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)，或哺乳动物细胞系统(例如，cos、cho、bhk、293、nso和3t3细胞)。一旦已经通过重组表达产生本发明的cd40l-fc融合蛋白，便可以通过本领域已知的用于蛋白质纯化的任何方法纯化该cd40l-fc融合蛋白。测定cd40l-fc融合蛋白的特性和活性本发明的cd40l-fc单体亚基(分离的或作为多聚体的一部分)的稳定性可以通过本领域熟知的技术(如热(tm)和离液变性(如用尿素或胍盐处理)、蛋白酶处理(如用嗜热菌蛋白酶处理)或另一种本领域接受的方法来确定蛋白质稳定性)容易地测量。用于测量蛋白质稳定性的技术的全面综述可以发现于例如“currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学现代方案]”和“currentprotocolsinproteinscience[蛋白质科学现代方案]”，通过johnwileyandsons.[约翰·威利父子出版公司]2007。cd40l-fc融合蛋白与cd40的结合亲和力和其他结合特性可以通过本领域已知的多种体外测定方法(包括例如平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(elisa))或动力学(例如，分析)和其他方法，如间接结合测定、竞争性结合测定、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤))确定。这些方法和其他方法可以利用所检查的一种或多种组分上的标记，和/或采用多种检测方法包括但不限于发色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可以发现于paul,w.e.编辑,fundamentalimmunology[基础免疫学],第4版,lippincott-raven,philadelphia[利平科特-雷文出版社](1999)。本文描述了用于确定cd40l-fc融合蛋白的功能或活性的另外的体外和体内方法。这些测定可用于确定一种或多种免疫应答(例如，t细胞功能和记忆、b细胞激活或增殖、树突细胞成熟或激活、th1细胞因子或趋化因子应答、单核细胞衍生的巨噬细胞m1/m2极化、抗原呈递和/或肿瘤微环境的免疫抑制中的一种或多种)。在体内，用于测定抗癌或抗肿瘤活性的不同动物模型是本领域已知的，包括例如b16-f10肿瘤小鼠模型。另外，评估药效学和药代动力学特性的方法也是熟知的。试剂盒本发明提供了用于增强抗肿瘤活性的试剂盒。在不同的实施例中，该试剂盒包括cd40l-fc融合蛋白(例如，medi5083)。该试剂盒可以包含另外的治疗组合物，这些治疗组合物包括例如抗ctla-4抗体(例如，曲美木单抗)、抗pd-l1抗体(例如，度伐鲁单抗)、和/或抗pd-1抗体。在一些实施例中，该试剂盒包含含有治疗组合物的无菌容器；此类容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他合适的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容纳药物的其他材料制成。如果需要的话，该试剂盒还包含用于给予本发明的治疗组合的说明书。在具体实施例中，这些说明书包括以下中的至少一个：治疗剂的描述；用于增强抗肿瘤活性的剂量日程表和给予；注意事项；警告；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。这些说明书可以直接打印在容器(当存在时)上，或作为标签应用于容器，或作为单独的页、小册子、卡片、或在容器中提供或是与容器一起提供的文件夹。除非另外指明，本发明的实施采用很好地处在熟练的技术人员的见识范围之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中已被充分解释，例如“molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]”，第二版(sambrook,1989)；“oligonucleotidesynthesis[寡核苷酸合成]”(gait,1984)；“animalcellculture[动物细胞培养]”(freshney,1987)；“methodsinenzymology[酶学方法]”“handbookofexperimentalimmunology[实验免疫学手册]”(weir,1996)；“genetransfervectorsformammaliancells[用于哺乳动物细胞的基因转移载体]”(miller和calos,1987)；“currentprotocolsinmolecularbiology[当前分子生物学方法]”(ausubel,1987)；“pcr:thepolymerasechainreaction[pcr：聚合酶链式反应]”，(mullis,1994)；“currentprotocolsinimmunology[免疫学现代实验方案]”(coligan,1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，并且按照这样，可以被考虑用于制作和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术将在以下的部分进行讨论。给出以下的实例是为了给本领域的普通技术人员提供如何准备和使用测定、筛选和本发明的治疗方法的一个完整的披露和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。实例现在参考以下实例来描述本发明。这些实例仅是说明性的，并且本发明决不应被解释为局限于这些实例，而是应当被解释为涵盖作为本文提供的教导的结果变得明显的任何以及所有变体。实例1.cd40l-fc的产生和稳定性研究cd40l起到共刺激分子的作用，并与抗原呈递细胞(apc)上的受体cd40结合，这导致取决于靶细胞类型的许多作用，包括b细胞激活和抗肿瘤抗体免疫应答的呈现、巨噬细胞和树突细胞的激活，以及自然杀伤细胞和细胞毒性t淋巴细胞的产生。构建融合蛋白，该融合蛋白包含经由肽接头连接的三个cd40配体(cd40l)亚基和fc单体(igg4pfc)的单链融合(cd40l-fc)(图1)。cd40l-fc融合蛋白包括sccd40l-igg4p-fp6(medi5083)、sccd40l-igg4p-fp7和鼠类替代物(fp5样，小鼠igg1d265afc)。测试cd40l-fc构建体的物理特性并观察到其是相似的(表1)。表1.cd40l-fc构建体的比较根据以下方案生成稳定性数据。将样品在pbs中浓缩至5mg/ml，并在室温和45℃孵育。通过高效尺寸排阻色谱法(hpsec)在不同的时间点(例如，第1、3、7天等)测试样品。fp7c194w的代表性hpsec色谱图显示在图2中。cd40l-fc构建体的稳定性数据显示在室温下长达7天的随时间的最小改变，和在45℃下随时间增加的聚集增加(表2)。表2.cd40l-fc构建体的稳定性数据如本文所述的，在hek293人cd40nfkb荧光素酶报告系统中测试稳定性程序上的fp6样品的生物活性。如通过nfkb荧光素酶测定所测量的medi5083稳定性样品生物活性与对照样品相当，两者在曲线的一般形状和参数(特别是ic50值)上的得分在预期的100pm-200pm范围内(图3)。实例2.cd40l-fc融合蛋白cd40l-fp7具有cd40l生物活性fp6cd40l融合蛋白(medi5083)通过结合和穿过表面结合的人cd40在免疫系统细胞(如b细胞和树突细胞)中发挥生物活性。为了确定cd40l融合蛋白fp7的cd40介导的活性，使用hek293cd40nfkb-luc细胞系和ramos-bluenfkb/ap-1报告b淋巴细胞系统。使用用人cd40和nfkb-荧光素酶报告系统转染的人hek细胞或用nfkb/ap-1报告系统转染的ramos-blue细胞开发了快速、简单的替代测定。在该研究中，相对于medi5083(米迪缪尼公司(medimmune))和同种型对照(同种型人igg4；米迪缪尼公司(medimmune))评估fp7cd40l融合蛋白(米迪缪尼公司(medimmune))的活性。根据2x和1x药物稀释方案制备fp7cd40l和medi5083。对于2x药物，使用以下稀释方案：200nm、66.7nm、22.2nm、7.4nm、2.5nm、823pm、274pm、92pm、31pm、10pm、3.4pm和0pm。对于1x药物，使用以下稀释方案：100nm、33.4nm、11.1nm、3.7nm、1.3nm、412pm、137pm、46pm、15pm、5pm、1.7pm、0pm。材料和方法hucd40hek生物活性测定方案将hucd40293heknfkbc3细胞维持在dmem(吉毕科公司(gibco))加10％热灭活的fbs(hi-fbs；吉毕科公司(gibco))和penstrep(吉毕科公司(gibco))中。细胞是粘附的，并且随着汇合的增加，细胞倾向于形成堆叠或细胞岛。当接近75％汇合时，细胞被分裂。为了收获细胞，吸出培养基，添加0.25％胰蛋白酶-edta(5ml；吉毕科公司(gibco))并伴随摆动涂覆细胞层。除去胰蛋白酶，添加培养基(10ml)，并通过搅拌除去细胞。将收获的细胞在dmem加2％hi-fbs中调节至5x105个细胞/ml，添加(100μl)至平底聚d-l赖氨酸biocoat96孔板(5x104个细胞/孔；康宁公司(corning))，并置于37℃培养箱中24小时。孵育后，从板中吸出培养基。将一百(100)μl的1x药物小心地添加至每个孔中(例如，沿着孔的侧面)，并注意使细胞的分离最小化。将细胞放回37℃培养箱中24小时。制备荧光素酶试剂(bright-glo荧光素酶测定底物；普洛麦格(promega))，使其平衡至室温，并添加(100μl)至每个孔中。将细胞和试剂充分混合以确保完全细胞裂解，并立即在perkinelmerevision-02光度计读板仪上读取。ramos-blue生物活性测定方案将ramos-bluenfkb/ap-1报告b淋巴细胞(invivogen公司)维持在imdmglutamax(吉毕科公司(gibco))加10％hi-fbs(吉毕科公司(gibco))、penstrep(吉毕科公司(gibco))和zeocin(100μg/ml；invivogen)培养基中。细胞是非粘附的，并且培养物以5x105个细胞/ml开始并保持低于6x106/ml。在第-1天，将细胞分裂成imdmglutamax加10％hi-fbs和pen/strep(无zeo)培养基。将细胞进行收获、调节至4x106个细胞/ml、并添加(100μl)至平底96孔板的孔中(4x105个细胞/孔；falcon)。将无zeo培养基中的一百(100)μl2x药物添加至每个孔中，并将细胞置于37℃培养箱中24小时。将来自ramos-blue细胞(40μl)的上清液转移至平底96孔板的孔中。制备ap-1quanti-blue试剂(溶解在100ml无菌水中的一个小袋；invivogen公司)，并向每个孔中添加ap-1quanti-blue试剂(160μl)。将含有细胞和ap-1quanti-blue试剂的板置于37℃培养箱中多达1小时，并在spectramaxm5分光光度计上在655nm读取。在两种报道细胞系测定中，cd40l-fp7显示出与medi5083等效的生物活性(图4和5以及表3和4)。cd40l-fp7融合蛋白中的cd40l亚基经由9-氨基酸glyser肽接头连接。出人意料的是，尽管相对于其他单链tnf配体-fc融合蛋白具有增加的接头长度(>8个氨基酸)，但9个氨基酸的接头长度没有减少cd40l活性，并且没有cd40l-fp7融合蛋白的聚集。在任何报告测定中，人igg4p同种型对照nip-228在背景中没有显示出活性。对于ramos-blue报告测定，用quanti-blueap-1检测培养基孵育60min(图5)和30min，显示出类似的曲线。然而，用quanti-blueap-1检测培养基孵育60min得到的动态范围大于孵育30min得到的动态范围。在另一个实验中，medi5083刺激人原代b细胞增殖(图6)。因此，这些实验显示medi5083具有生物活性并且可以激活适应性免疫。表3.参考medi5083和人igg4p同种型对照的cd40l-fp7的生物利用度评估：hucd40293heknfkbc3细胞模型表4.参考medi5083和人igg4p同种型对照的cd40l-fp7的生物利用度评估：ramos-bluenfkb/ap-1b-细胞细胞模型实例3.cd40l-fc融合蛋白medi5083激活单核细胞衍生的树突状细胞(modc)medi5083通过受体cd40在免疫系统细胞(如树突细胞、b细胞和巨噬细胞)中发挥生物活性。已显示cd40l激活剂在分别通过facs和elisa可检测的树突细胞中增加细胞表面激活标记物和炎性细胞因子分泌。本研究旨在确定用medi5083预处理modc是否增强人modc中的应答。材料和方法modc开始和培养将人单核细胞(例如新鲜的)在补充有gm-csf和il-4(均为100ng/ml；r&d系统(r&dsystems))的rpmi(rpmi1640+glut培养基；吉毕科公司(gibco))+10％热灭活的fbs(hi-fbs；吉毕科公司(gibco))(＝crpmi)中培养6天，每48小时用细胞因子再进料。6天后，将单核细胞衍生的树突细胞(modc)(特征在于粘附的丧失和细胞膜挤出的出现)进行计数，并在crpmi中调节至1x106/ml。在第6天，通过facs(macsquantpippen)在来自每个供体的1x106ml等分试样上进行表征。modc药物治疗和激活对于每个供体，将crpmi中的modc(100μl)添加至96孔板的孔中(每孔1x105个细胞)。在crpmi中产生medi5083(1:3稀释)的药物原液(4x)，以给出在从100nm至15pm的范围内的fp6的终浓度。对于4x药物，使用以下稀释方案：200nm、100nm、33.3nm、11.1nm、3.7nm、1.2nm、400pm、140pm、46pm、15pm、0pm。将同种型对照(100nm)用于无药物(0pm)。另外地，对于在组合孔中添加的固定浓度的药物，产生crpmi中的4x药物原液，以给出4nmmedi5083的终浓度。将4x药物(50μl)和50μlcrpmi添加至单一药物处理孔中。24小时后，将上清液(130μl)进行收集并转移至标记的96孔板中并冷冻用于随后的细胞因子分析(ifn-γ、il-10、il-12p70、il-13、il-1β、il-2、il-4、il-5、il-8、tnf-α)。通过facs加工细胞。细胞外facs染色方案：表型/功能组24小时后，modc细胞已粘附在板上。向孔中添加不含dpbsw/oca/mg(dpbs；吉毕科公司(gibco))(200μl)，并以1,500rpm旋转5min以进行洗涤。添加预热的trypleexpress(100μl；吉毕科公司(gibco))，并将细胞置于37℃持续15min。添加facs缓冲液(补充有5％hi-fbs和0.1％叠氮化钠(sigma)的dpbs)并将细胞洗涤两次。将细胞重新悬浮于30μl的10μg/ml人igg中，并在rt下孵育10min。在此期间，将modc添加至补偿板中并添加适当的抗体。添加facs缓冲液+叠氮化物(100μl)和fmo(荧光减1)对照中的抗体mastermix，并将细胞在4℃孵育20min。使用针对细胞表面标记物cd14、cd40、cd206、cd163、cd68、cd80、hla-dr、cd274(pd-l1)的抗体。将细胞用facs缓冲液洗涤两次，然后重新悬浮于facs缓冲液(100μl)中，并在流式细胞仪上获得样品。在flowjov9上分析数据。medi5083诱导高水平的细胞表面标记物hla-abc、hla-dr、cd80和cd86(其与抗原呈递相关)和cd83(激活抗原)(参见图7和表5)。表5.ec50值标记物ec50(nm)cd800.813cd830.234cd860.447hla-abc0.988hla-dr0.473还观察到高水平的另外细胞表面标记物，包括作为激活抗原的cd40和pd-l1，以及淋巴结归巢ccl19和ccl21受体ccr7。所有modc细胞表面标记物的表达以剂量应答性方式增加，在3.7nm和11.1nm之间平稳，尽管cd40表达似乎在高浓度下下调。因此，medi5083能够使人单核细胞衍生的树突细胞(modc)激活和成熟。这些实验证明medi5083可以激活先天性免疫。medi5083诱导il-12p70、ifn-γ、tnf-α和il-10分泌的剂量依赖性增加(图8)。最初诱导il-8分泌，但在3.7μm及以上的剂量下被抑制。没有观察到medi5083对il-1β的影响。在另一个实验中，通过medi5083的mdc激活和成熟以剂量依赖性方式驱动t细胞增殖(图9)。因此，medi5083能够在人modc中诱导th1细胞因子/趋化因子应答并驱动t细胞增殖。这些实验显示，medi5083具有桥接先天性和适应性免疫应答的潜力。实例4.cd40l-fc融合蛋白medi5083激活人巨噬细胞极化。单核细胞是非常可塑的，并且可以是体外分化的、具有促炎性m1表型或抑制性/伤口愈合性m2表型巨噬细胞。m1巨噬细胞是pdl1hi/cd80hi/cd40hi/hla-drhi/cd206lo/cd163lo/cd14lo，而m2巨噬细胞是pdl1lo/cd80lo/cd40lo/hla-drlo/cd206hi/cd163hi/cd14hi。另外地，m1巨噬细胞产生炎性细胞因子tnf-α、il-1β、il-6、il-12和il-23，而m2巨噬细胞产生抑制性细胞因子il-10和tgf-β。在肿瘤环境中，m2巨噬细胞可抑制对癌抗原的免疫应答。将极化切换为m1表型可以超越这种作用并使肿瘤消退。将实验设计为评估medi5083、人cd40l/人igg4融合蛋白对m1和m2极化巨噬细胞的作用。材料和方法单核细胞处理和极化方案(mia等人(2014)scanjimmunol[斯堪的纳维亚免疫学杂志]79:第305-314页)获得来自2个供体(d1：8367；d2：8375)的新鲜人单核细胞(全细胞公司(allcells))用于实验。进行细胞计数，并除去细胞等分试样(1x106)用于d0/静息单核细胞facs基线。将剩余的细胞分裂成两个相等的等分试样，将细胞离心(1,500rpm，5min)，并将一半重新悬浮于m1培养基(rpmi(rpmi1640+glut培养基；吉毕科公司(gibco))(补充有10％热灭活的fbs(hi-fbs；吉毕科公司(gibco))、penstrep(吉毕科公司(gibco))(＝crpmi)和50ng/mlgm-csf(r&d系统(r&dsystems)))中，并将一半重悬浮于m2培养基(crpmi加50ng/mlm-csf(r&d系统(r&dsystems)))中。将等分试样(2ml)转移至6孔板的孔中，并将板在37℃下孵育6天，每2天添加新鲜的细胞因子。从公开的方案中除去无血清培养基中的附着步骤。每次添加细胞因子时，注意并记录细胞形态。6天后，巨噬细胞向m1或m2极化。激活刺激的添加导致特征性细胞因子分泌和细胞表面标记物上调。在本研究中，激活以三种方式进行：(a)在第6天添加标准激活(50ng/mllps(lps大肠杆菌0111:b4；西格玛公司(sigma))+20ng/mlifn-γ(r&d系统(r&dsystems))至m1板和20ng/mlil-4(r&d系统(r&dsystems))+20ng/mlil-10(r&d系统)至m2板)，并用荧光激活细胞分选(facs)进行分析并在24小时后收集上清液。(b)在第6天添加标准激活加medi5083(4nm；米迪缪尼公司(medimmune))或同种型对照(4nm；米迪缪尼公司(medimmune))，并进行facs分析并在24小时后收集上清液。(c)在第6天添加标准激活，在24小时(第7天)后添加medi5083(4nm；米迪缪尼公司(medimmune))或同种型对照(4nm；米迪缪尼公司(medimmune))，并进行facs分析并在另外24小时后收集上清液。在收获时，将上清液(500μl)除去并冷冻用于随后的msd细胞因子分析(人th1/th210-plex板il-1β、il-2、il-4、il-5、il-8、il-10、il-12p70、il-13、ifn-γ和tgf-β)。吸出剩余的培养基，并且将板用dpbs(dpbsw/oca/mg；吉毕科公司(gibco))洗涤一次，并向每个孔中添加预热的trypleexpress解离缓冲液(0.5ml；吉毕科公司(gibco))。将细胞置于37℃培养箱中20min，轻拍平板以除去巨噬细胞，添加crpmi(2ml)，并使用5ml移液管剧烈吸出以收获细胞。按照该程序，在显微镜下检查孔以除去细胞。将细胞离心、在crpmi中调节至1x106个细胞/ml、并加工来用于facs。细胞外facs染色方案(4c)将细胞(2x105)添加至圆底96孔板的孔中，并以1500rpm离心5min。添加补充有5％hi-fbs(吉毕科公司(gibco))和0.1％叠氮化钠(sigma)的facs缓冲液(dpbs(dpbsw/oca/mg；吉毕科公司(gibco))(200μl)并将细胞洗涤一次。将细胞重新悬浮于50μl的1:4trustainfcx(生物传奇公司(biolegend))fc受体阻断中，并在室温下孵育10min。将抗体组mastermix(100μl)添加至孔中，并将细胞在4℃孵育20分钟。使用针对细胞表面标记物cd14、cd40、cd206、cd163、cd68、cd80、hla-dr、cd274(pd-l1)的抗体。将细胞用facs缓冲液洗涤两次，重新悬浮于facs缓冲液(100μl)中，并在macsquant流式细胞仪上获得样品。在flowjov9上分析数据。在gm-csf中6天后，巨噬细胞被称为m0-m1。用ifn-γ和lps激活24小时导致完全m1极化。同样地，在m-csf中6天后，巨噬细胞被称为m0-m2并且用il-4和il-10激活24小时导致完全m2极化。重要的是，6天后(激活前)，在显微镜下观察时，m0-m1巨噬细胞具有经典的扁平、展开的形态，并且m0-m2巨噬细胞具有经典粘附的纺锤样的细胞。在m2巨噬细胞中，在24小时激活阶段中包含medi5083(4nm)增加了m1标记物并减少m2标记物，这使极化从m2转向m1(图10，阴影线条；图11)。因此，这些实验显示medi5083能够逆转免疫抑制。实例5.cd40l-fc融合蛋白medi5083特异性结合cd40fp6(medi5083)的作用方式主要是通过激活表达抗原呈递细胞(树突细胞、b细胞、单核细胞和巨噬细胞)的cd40。fp6不与其他tnf受体亚家族蛋白(如gitr、trail和ox40)结合，并且是物种特异性的(在小鼠模型中不起作用)。开发了简单的elisa以评估fp6(medi5083)的人cd40特异性。开发基于简单elisa的方案的早期尝试证明需要使用更特异性的抗人igg4二级试剂来绕过用于控制测定特异性的受体/fc融合蛋白的fc组分的非特异性结合。另外地，确定了有效的较低浓度的受体和主要试剂。在本研究中，评估了更特定的二级试剂。材料和方法tnf受体结合测定将除了trail之外的不含fc组分的重组fc嵌合体受体(50μl，5μg/ml)涂覆在板上(1小时，37℃)，然后进行洗涤步骤(用pbs+0.05％tween进行3x)。重组受体包括：rhcd40(higg1fc)；rmcd40(higg1fc)；rhgitr(higg1fc)；rhtrail；rhox40(higg1fc)(r&d系统(r&dsystems))。将重组受体(无初级)单独地用作对照以检查与fc-hrp二级试剂的直接结合。将平板用pbs中的4％奶阻断(1小时，37℃)，然后进行洗涤步骤(用pbs进行2x)。将平板与1％bsapbs中的主要试剂(50μl，20nm)(例如，新鲜制备(1小时，37℃))一起孵育，然后进行洗涤步骤(用pbs+0.05％tween进行4x)。主要试剂包括fp6(higg4fc)和人igg4抗体(用作同种型对照)。将平板与二级试剂(在pbs中的4％奶中的hrp缀合的抗fc(100μl，1:25000))孵育，然后进行洗涤步骤(用pbs+0.05％tween进行4x)。为了制备hrp缀合的抗fc，在4％奶中制备小鼠抗人igg4(h+l)的1:4原液(赛默科技目录号ma1-34437)，对其进行1:5000稀释，并将0.5mg/ml在1:25000中使用。添加tmb(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)溶液(100μl/孔)。通过在添加之前不超过15分钟将等体积的rt溶液a添加至溶液b(tmb底物试剂盒；bdopteia目录号3555214)来制备tmb溶液。将反应在室温下孵育15分钟，并使其避光。具有hrp活性的孔变蓝。添加终止溶液(2n硫酸；100μl)，并且变蓝的孔变为亮黄色。在读板仪上在450nm进行读取fp6(medi5083)elisa测定对人cd40具有高度特异性(图12)。由其他人tnf受体家族成员(如gitr、trail和ox40)产生的低背景信号指明fp6对人cd40表现出高于比其他的人tnf受体家族成员(如gitr、trail和ox40)高的特异性。因此，开发了简单的elisa用于评估fp6对人cd40的特异性。该elisa测定中的关键组分是高度特异性的抗人igg4二级试剂。产生fp6特异性elisa的早期尝试使用更广泛的反应性抗人igg二级试剂(与用作fp6靶标的受体fc融合蛋白的人fc区结合)，导致假阳性信号。本文描述的实验的概述指明medi5083在体外特异性结合cd40并激活免疫应答的关键组分(表6)。表6.medi5083特异性结合cd40并激活免疫应答的关键组分体外测定效力人kinexa(kd)nd人cd40nfkb(n＝10)ec50：0.1nm人b细胞增殖(n＝3)ec50：0.2nm人dc细胞成熟/激活(n＝3)是通过modc生产th-1极化细胞因子是人单核细胞/mfm2→m1极化是tnf家族交叉反应性(ox40、gitr、trail)未观察到实例6.mucd40l-fp(medi5083小鼠替代物)在小鼠肿瘤模型中具有抗肿瘤活性。为了研究cd40l-fc融合蛋白在小鼠体内的作用，构建了medi5083的鼠类替代物mucd40l-fp。像medi5083，mucd40l-fp从n-末端到c-末端包含经由肽接头连接的3xcd40l亚基的单链融合，这些肽接头与fc多肽连接。然而，mucd40l-fp(代替medi5083中的人cd40l亚基和人igg4p)包含小鼠cd40l亚基和小鼠igg1fc。另外地，在mucd40l-fp中，与ggggsgggs(seqidno:2)相比，小鼠cd40l亚基之间的亚基间接头是gggsggs(seqidno:37)。在b16-f10同系小鼠模型中测试小鼠替代物cd40lfp。与同种型和未处理的对照相比，mucd40l-fp在b16-f10小鼠模型中减少了肿瘤体积和/或延迟了肿瘤生长(图13)。另外地，用mucd40l-fp处理的小鼠没有显著的体重减轻或其他可观察到的作用。因此，mucd40l-fp在低应答性肿瘤模型中显示出显著的抗肿瘤活性。在b16-f10同系小鼠模型中测试小鼠替代物cd40lfp与抗pd-l1的组合。与单独的抗pd-l1和同种型和未处理的对照相比，mucd40l-fp与抗pd-l1组合在b16-f10小鼠模型中的个体小鼠中减少了肿瘤体积和/或延迟了肿瘤生长。(图14和15)。在b16-f10同系小鼠模型中测试小鼠替代物cd40lfp与抗ctla-4的组合。与单独的抗ctla-4和同种型和未处理的对照相比，mucd40l-fp与抗ctla-4组合在b16-f10小鼠模型中的个体小鼠中减少了肿瘤体积和/或延迟了肿瘤生长。(图16和17)。在b16-f10同系小鼠模型中测试小鼠替代物cd40lfp与抗pd-l1和抗ctla-4的组合。与抗pd-l1和抗ctla-4的组合、或mucd40l-fp与抗pd-l1或抗ctla-4的组合相比，mucd40l-fp与抗pd-l1和抗ctla-4组合在b16-f10小鼠模型中的个体小鼠中减少了肿瘤体积和/或延迟了肿瘤生长(图18和19)。在b16-f10同系小鼠模型中测试小鼠替代物cd40lfp与抗pd-1的组合。与单独的抗pd-1和同种型和未处理的对照相比，mucd40l-fp与抗pd-1组合在b16-f10小鼠模型中的个体小鼠中减少了肿瘤体积和/或延迟了肿瘤生长。(图20和21)。此外，从单独地用mucd40l-fp、抗pdl-1、抗ctla-4或抗pd1或用mucd40l-fp与抗pdl-1、抗pd-1、抗ctla-4或抗pdl-1和抗ctla4组合来处理的b16-f10荷瘤小鼠收集血清。将第2次和第4次处理后24小时的血清细胞因子水平用mesoscalediscovery多重测定试剂盒测量。与第2次处理后24小时(图22)和第4次处理后24小时(图23)的单独的抗pd-l1、抗ctla-4和抗pd-1以及同种型和未治疗对照相比，单独地用mucd40l-fp处理或用mucd40l-fp与抗pdl-1、抗pd-1、抗ctla-4或抗pdl-1和抗ctla4组合处理诱导th1细胞因子ifnγ、tnfα、il12和kc/grot1水平升高。然而，在第2次处理后24个小时或第4次处理后24小时观察到il-1b、il-2、il-4、il-5或il-10没有改变(未显示数据)。因此，mucd40l-fp与抗pd-l1、抗pd-1、抗ctla-4组合(单独的或与抗pd-l1或抗pd1组合)在低应答性肿瘤模型中显示出显著的抗肿瘤活性。这些数据证明medi5083与免疫检查点抑制剂组合的有用性。实例7.mucd40l-fp(medi5083小鼠替代物)在小鼠中激活免疫应答为了理解小鼠替代物mucd40l-fp的作用，研究了b16-f10小鼠中的免疫应答。与未处理的和同种型对照相比，mucd40l-fp在小鼠中增加了瘤内cd8+t细胞激活和pd-l1表达(图24)。与对照小鼠相比，给予mucd40l-fp的小鼠具有增加的总cd8+t细胞和增加的cd8+、ifnγ+；cd8+、grazb+；和pd-l1+t细胞的百分比。在脾中，与未处理的和同种型对照相比，mucd40l-fp驱动b16-f10小鼠中的髓样细胞成熟和b细胞激活(图25)。mucd40l-fp还在b16-f10小鼠中诱导th1细胞因子和cxcl-1趋化因子分泌(图26)。与对照小鼠相比，给予mucd40l-fp的小鼠具有增加的ifnγ、tnfα、il-12和cxcl1分泌。实例8.在猴中进行medi5083药代动力学(pk)和药效动力学(pd)研究。为了理解medi5083在灵长类动物中的作用，在猴中进行药代动力学(pk)和药效动力学(pd)研究。基于公开的数据使用0.3mg/kg的起始剂量，并具有针对cd40的激动性mab(vonderheide等人2001)，其中medi5083具有相同的作用机制。公开的抗cd40mab的mtd为0.2mg/kg。等效的猕猴mtd将是人类mtd的3倍；0.6mg/kg。预测0.3mg/kg或更低的剂量是食蟹猕猴的安全起始剂量。单剂量pk/pd毒理学研究显示在任何测试剂量下均无毒性(表7)。表7.单剂量pk/pd毒理学研究(非-glp)组mg/kg途径剂量动物1媒介物iv&sc13m20.3iv13m33.0iv13m430.0iv13m530.0sc13m选择这些给予途径是因为它们与人体中提出的给予途径一致，并且预期提供适当的血清水平并与药效动力学作用相关。给药后4小时收集血液(0.5ml-1.0ml)。用特异性单克隆抗体分析血液以检测b细胞(包括激活的b细胞)、t细胞(t辅助细胞和细胞毒性t细胞)、自然杀伤(nk-)细胞和树突细胞。获得相对细胞数目(百分比)并在同一天确定总淋巴细胞计数。根据相对数目和总数目计算亚群的绝对数目。还将血液样品用于ki67免疫染色。将血清用于分析细胞因子、药代动力学分析和评估、以及抗药物抗体(ada)研究。产生pk-pd模型以描述在猴中单剂量medi5083后的b细胞激活和运输(图27)。该研究的pk结果如下列出：cl＝405ml/天/kg；vc＝137ml/kg；vp＝122ml/kg；v最大＝496μg/天；v最大＝496μg/天；且km＝0.026μg/ml。该研究的pd结果如下列出：r0＝1；s最大＝6.32/天；k输出＝8.13/天；且ec50＝0.08μg/ml。medi5083显示出非线性pk，并且受试者的血清半衰期在从2.7小时至18小时的范围。有趣的是，将medi5038进行sc给予具有比进行iv给予时更长的半衰期(30mg/kg：ivt1/2：6小时；sct1/2：18小时)。b细胞激活的ec50为0.08μg/ml(约50pm)，这与体外ec50一致。medi5038显示出延长的pd作用，因为与b细胞激活的2小时的半衰期相比，b细胞运输的半衰期为36小时。medi5038还在猴中激活t细胞增殖(cd8+记忆t细胞ki67)(以30mg/kgsc观察到pd，7天)。其他实施例从前述说明中，将显而易见的是，可以对本文所述的发明作出变更和修改以使其适应于不同用途和状况。此类实施例也在以下权利要求的范围内。本文变量的任何定义中对要素清单的叙述包括将所述变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或次组合)。本文实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用方式以相同的程度并入本文，如同每份单独的专利和出版物具体地且个别地指出通过引用的方式结合。<110>米迪缪尼有限公司（medimmunellc）<120>cd40l-fc融合多肽及其使用方法<130>cd40f-100-wo-pct<150>us62/336,129<151>2016-05-13<160>37<170>patentin版本3.5<210>1<211>143<212>prt<213>人工序列<220><223>cd40l变体<400>1asnproglnilealaalahisvalileserglualaserserlysthr151015thrservalleuglntrpalaglulysglytyrtyrthrmetserasn202530asnleuvalthrleugluasnglylysglnleuthrvallysarggln354045glyleutyrtyriletyralaglnvalthrphecysserasnargglu505560alaserserglnalapropheilealaserleutrpleulysserpro65707580glyargphegluargileleuleuargalaalaasnthrhisserser859095alalysprocysglyglnglnserilehisleuglyglyvalpheglu100105110leuglnproglyalaservalphevalasnvalthraspprosergln115120125valserhisglythrglyphethrserpheglyleuleulysleu130135140<210>2<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>2glyglyglyglyserglyglyglyser15<210>3<211>141<212>prt<213>人工序列<220><223>cd40l变体<400>3glnilealaalahisvalileserglualaserserlysthrthrser151015valleuglntrpalaglulysglytyrtyrthrmetserasnasnleu202530valthrleugluasnglylysglnleuthrvallysargglnglyleu354045tyrtyriletyralaglnvalthrphecysserasnargglualaser505560serglnalapropheilealaserleutrpleulysserproglyarg65707580phegluargileleuleuargalaalaasnthrhisserseralalys859095procysglyglnglnserilehisleuglyglyvalphegluleugln100105110proglyalaservalphevalasnvalthraspproserglnvalser115120125hisglythrglyphethrserpheglyleuleulysleu130135140<210>4<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>4glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser151015<210>5<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>5glyglyglyglyser15<210>6<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>6glyglyglyser1<210>7<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>7glyglyglyglyser15<210>8<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>8glyglyglyser1<210>9<211>687<212>prt<213>人工序列<220><223>medi5083<400>9asnproglnilealaalahisvalileserglualaserserlysthr151015thrservalleuglntrpalaglulysglytyrtyrthrmetserasn202530asnleuvalthrleugluasnglylysglnleuthrvallysarggln354045glyleutyrtyriletyralaglnvalthrphecysserasnargglu505560alaserserglnalapropheilealaserleutrpleulysserpro65707580glyargphegluargileleuleuargalaalaasnthrhisserser859095alalysprocysglyglnglnserilehisleuglyglyvalpheglu100105110leuglnproglyalaservalphevalasnvalthraspprosergln115120125valserhisglythrglyphethrserpheglyleuleulysleugly130135140glyglyglyserglyglygl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y、leu、ile、ser和val中的任一个<400>34glyglyglyglyxaa15<210>35<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>35glyglyglyglygly15<210>36<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>36glyglyglyglyala15<210>37<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>肽接头<400>37glyglyglyserglyglyser15当前第1页12