大麻素前药的生物合成的制作方法

本申请要求2016年4月15日提交的美国临时申请no.62/323,296的优先权权益；本申请还要求2016年4月25日提交的美国临时申请no.62/327,212的优先权权益，其内容整体并入本申请。

本发明涉及可药用大麻素前药的生物合成。还描述了大麻素的合成中涉及的酶的生产和操作，并且出乎意料地发现ph影响使用本发明方法生产的大麻素前药的比例。

背景技术：

大麻素是在属于大麻(cannabaceae)科的一年生植物大麻(cannabissativa)中存在的萜酚化合物。该植物包含多于400种化学物质和约70种大麻素。后者主要积聚在腺毛中。天然产生的大麻素中最具活性的是四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，thc)，其用于治疗多种医学病症，包括青光眼、aids消瘦、神经性疼痛、与多发性硬化相关的痉挛状态的治疗、纤维肌痛和化疗引起的恶心。thc在变态反应、炎症、感染、癫痫、抑郁、偏头痛、双相障碍、焦虑障碍、药物依赖和药物戒断综合症的治疗中也有效。

另外的活性大麻素包括大麻二酚(cannabidiol，cbd)(thc的异构体)，其是已知针对急性和慢性神经变性提供保护的强效抗氧化剂和抗炎化合物。大麻萜酚(cannabigerol，cbg)是在大麻中以高浓度存在的另一种大麻素。cbg是高亲和力的α2-肾上腺素能受体激动剂和中等亲和力的5-ht1a受体拮抗剂。cbg是低亲和力的cb1受体拮抗剂，并且具有抗抑郁活性。

另一种植物大麻素大麻色烯(cannabichromene，cbc)具有抗炎、抗真菌和抗病毒特性。植物大麻素已被用作治疗多种疾病的治疗剂，并且在植物中可在植物对致病因子的防御机制中发挥类似的作用。

尽管其已知的有益效果，但由于与大规模种植和维持植物相关的高成本和从植物组织中提取、分离和纯化大麻素中的困难，大麻素的治疗用途受到阻碍。

因此，需要开发允许以治疗用途所需的量大规模生产大麻素和大麻素前药的方法。本发明解决了这种需要。

技术实现要素：

本发明提供了用于合成大麻素前药的方法。还描述了本发明前药的代表性实例，其可施用于需要基于大麻素之治疗的患者，例如用于治疗例如青光眼、慢性疼痛、aids的病症以及用于癌症的治疗。

在一个实施方案中，本发明提供了用于生产式ii或式iii的大麻素前药的方法：

其包括

(a)使根据式i的化合物与大麻素合酶接触以生产根据式ii或式iii的化合物；

以及

(b)任选地使式ii或式iii化合物脱羧。

对于式i、式ii和式iii化合物，取代基r和r³各自独立地选自-h、乙酰基、丙酰基、3-羟基-2-甲基丙酰基、tms、tbdms、苄基、-c(o)[ch2]x-c(o)oh、-c(o)[ch2]x-or⁴、-c(o)[chr4]x-c(o)oh、-c(o)[chr⁴]x-or⁵、-c(o)[cr⁴r⁵]x-or⁶、-c(o)o[ch2]x-or⁴、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or⁴、-c(o)-c(o)-[och2ch2]x-or⁴、-c(o)[ch2]x-nr⁴r⁵、-c(o)o[ch2]x-nr⁴r⁵、-c(o)-nh-[ch2]x-nr⁴r⁵、-c(o)[ch2]x-n⁺(r⁴)(r⁵))(r⁶)x^-、-c(o)o[ch2]x-n⁺(r⁴)(r⁵))(r⁶)x^-、-c(o)-nh-[ch2]x-n⁺(r⁴)(r⁵))(r⁶)x^-、l-氨基酸残基、d-氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基、-p(o)[oy](oz)和-p(o)[nr⁴nr⁵][oy]。

式i、式ii和式iii中的取代基r¹为-h、-cooh、-coor^a或-(ch2)ncooh，而r²选自(c1-c10)烷基、(c2-c10)烯基、(c2-c10)炔基、(c3-c10)环烷基、(c3-c10)环烷基亚烷基、(c3-c10)芳基和(c3-c10)芳基亚烷基。

对于一些式ii或式iii化合物，取代基r或r³为-c(o)[chr4]x-c(o)oh、-c(o)[chr⁴]x-or⁵、-c(o)[cr⁴r⁵]x-or⁶、-c(o)o[ch2]x-or⁴、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or⁴或-c(o)-c(o)-[och2ch2]x-or⁴。对于这样的化合物，取代基r⁴和r⁵各自独立地为-nh2、-nh(ch3)、-nh(ch2ch3)或n(ch3)2。对于某些其他式ii或iii化合物，取代基r⁴和r⁵各自独立地为-h或(c1-c5)烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基或叔丁基。

取代基r⁴、r⁵和r⁶各自独立地选自-h、-oh、甲酰基、乙酰基、新戊酰基和(c1-c5)烷基。在一个实施方案中，r⁴和r⁵各自独立地为-h或(c1-c5)烷基并且基团-nr⁴r⁵为-nh2、-nh(ch3)、-nh(ch2ch3)或n(ch3)2。根据另一个实施方案，r⁴和r⁵为甲酰基或乙酰基并且基团-nr⁴r⁵为-nh[c(o)h]和-nh[c(o)ch3]。对于式i、ii和iii化合物，取代基r^a为(c1-c10)烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。

对于一些式i、式ii和式iii化合物，变量“x”为来自可药用酸的反荷离子，而变量“y”和“z”各自独立地选自-h、(c1-c5)烷基、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵阳离子、甲基铵阳离子和可药用碱。对于根据本发明的化合物，下标“x”和“n”选自0、1、2、3、4、5和6。

在一个实施方案中，对于根据本发明的化合物，取代基r选自-c(o)[ch2]x-c(o)oh、-c(o)[ch2]x-or⁴、-c(o)[ch2]x-nr⁴r⁵和-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or⁴，取代基r¹为-cooh并且r²为(c1-c10)烷基，例如丙基或戊基基团。

对于某些式i、式ii和式iii化合物，r为-c(o)[ch2]x-or⁴，下标“x”为1、2、3或4，并且r⁴为-h或(c1-c5)烷基。

在一个实施方案中，r为-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or⁴，下标“x”为1、2、3或4并且取代基r⁴为甲基。

根据另一个实施方案，取代基r为-c(o)[ch2]x-nr⁴r⁵，下标“x”为1、2、3或4并且取代基基团r⁴和r⁵各自独立地为-h或(c1-c5)烷基，例如甲基或乙基。

本发明还提供了根据式iv或式v的大麻素前药。

对于式iv和式v化合物，r⁷和r¹⁰各自独立地选自-h、乙酰基、丙酰基、3-羟基-2-甲基丙酰基、四氢吡喃基、-c(o)[ch2]x-c(o)oh、-c(o)[ch2]x-or¹¹、-c(o)[chr¹¹]x-c(o)oh、-c(o)[chr¹¹]x-or¹²、-c(o)[cr¹¹r¹²]x-or¹³、-c(o)o[ch2]x-or¹¹、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or¹¹、-c(o)-c(o)-[och2ch2]x-or¹¹、-c(o)[ch2]x-nr¹¹r¹²、-c(o)o[ch2]x-nr¹¹r¹²、-c(o)-nh-[ch2]x-nr¹¹r¹²、-c(o)[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²))(r¹³)x^-、-c(o)o[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²))(r¹³)x^-、-c(o)-nh-[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²))(r¹³)x^-、l-氨基酸残基、d-氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基、-p(o)[oy](oz)和-p(o)[nr¹¹nr¹²][oy]。

式iv和式v中的r⁸为-h、-cooh、-coor^a或-(ch2)ncooh，并且取代基r^a为(c1-c10)烷基，例如甲基、乙基或叔丁基并且取代基r⁹选自(c1-c10)烷基、(c2-c10)烯基、(c2-c10)炔基、(c3-c10)环烷基、(c3-c10)环烷基亚烷基、(c3-c10)芳基和(c3-c10)芳基亚烷基。

在一个实施方案中，r⁷和r¹⁰各自独立地为-c(o)[ch2]x-or¹¹、-c(o)[chr¹¹]x-c(o)oh、-c(o)[chr¹¹]x-or¹²、-c(o)[cr¹¹r¹²]x-or¹³、-c(o)o[ch2]x-or¹¹、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or¹¹和-c(o)-c(o)-[och2ch2]x-or¹¹。对于这样的化合物，取代基r¹¹、r¹²和r¹³各自独立地为-h或(c1-c5)烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基或叔丁基。对于某些其他化合物，取代基r¹¹和r¹²选自-nh2、-nh(ch3)、-nh(ch2ch3)或n(ch3)2。

对于根据式iv和v的化合物，取代基r¹¹、r¹²和r¹³各自独立地选自-h、-oh、甲酰基、乙酰基、新戊酰基和(c1-c5)烷基。在一个实施方案中，r¹¹和r¹²为-h或(c1-c5)烷基并且基团-nr¹¹r¹²为-nh2、-nh(ch3)、-nh(ch2ch3)或n(ch3)2。根据另一个实施方案，r¹¹或r¹²为甲酰基或乙酰基并且基团-nr¹¹r¹²为-nh[c(o)h]或-nh[c(o)ch3]。当r⁸为-coor^a时，取代基r^a为(c1-c10)烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。

变量“x”为来自可药用酸的反荷离子，而变量“y”和“z”各自独立地选自-h、(c1-c5)烷基、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵阳离子、甲基铵阳离子和可药用碱。

对于式iv和式v化合物，下标“x”和“n”独立地选自0、1、2、3、4、5和6。

在一个实施方案中，r⁷选自-c(o)[ch2]x-c(o)oh、-c(o)[ch2]x-or¹¹、-c(o)[ch2]x-nr¹¹r¹²、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or¹¹和-c(o)[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²)(r¹³)x^-，取代基r⁸为-h或-cooh，并且r⁹为丙基、丁基或戊基。根据该实施方案，对于某些式iv和v化合物，r⁸为-h并且r⁹为丙基或戊基。

在一个实施方案中，在r⁷处的前药部分为乙酰基。根据另一个实施方案，r⁷为新戊酰基部分。

对于某些式v化合物，r⁷和r¹⁰二者均为乙酰基或新戊酰基，而对于一些其他式v化合物，r⁷为-h并且r¹⁰为乙酰基或新戊酰基。

对于某些本发明化合物，在r⁷处的前药部分是-c(o)[ch2]x-oh基团或-c(o)[ch2]x-ome基团，其中下标“x”为1或2。在一个实施方案中，提供了式v的前药，其中r⁷和r¹⁰二者均为-c(o)[ch2]x-oh基团或-c(o)[ch2]x-ome基团。根据又一个实施方案，r⁷为-h并且r¹⁰为-c(o)[ch2]x-oh或-c(o)[ch2]x-ome基团。

在一个实施方案中，在r⁷处的前药部分为-c(o)[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²)(r¹³)x^-部分，例如-c(o)o[ch2]-n⁺(ch3)(ch2ch3)2x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(ch2ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]2-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]3-n⁺(ch3)3x^-或-c(o)o[ch2]4-n⁺(ch3)3x^-基团。

对于某些式iv和v化合物，在r⁷处的前药部分为-c(o)o[ch2]4-nh2、-c(o)o[ch2]-nh2、-c(o)o[ch2]-nh(ch3)、-c(o)o[ch2]-nh(甲酰基)或-c(o)o[ch2]-n(ch3)2。

在一个实施方案中，在r⁷处的前药部分为聚乙二醇基团，例如-c(o)-ch2-[och2ch2]x-oh或-c(o)-ch2-[och2ch2]x-och3基团，其中下标“x”为1、2、3或4。举例说明性的这样的前药不限于-c(o)-ch2-[och2ch2]3-och3和-c(o)-ch2-[och2ch2]2-och3基团。

如上所述，包含在本发明范围内的是根据式v的大麻素前药，其中r⁷和r¹⁰二者均为前药部分或只有r⁷或r¹⁰中的一个为前药部分，所述前药部分选自-c(o)[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²)(r¹³)x^-部分，例如-c(o)o[ch2]-n⁺(ch3)(ch2ch3)2x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(ch2ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]4-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]4-nh2、-c(o)o[ch2]-nh2、-c(o)o[ch2]-nh(ch3)、-c(o)o[ch2]-nh(甲酰基)、或-c(o)o[ch2]-n(ch3)2、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-oh或-c(o)-ch2-[och2ch2]x-och3基团。举例说明性的这样的前药不限于-c(o)-ch2-[och2ch2]3-och3和-c(o)-ch2-[och2ch2]2-och3。

用于生产大麻素前药(例如分别根据式vii和viii的前药)的系统也包括在本发明的范围内。

根据本发明，用于合成式vii和viii化合物的系统包含：(i)含有溶剂、大麻素合酶和根据式vi的反应物的生物反应器；以及

(ii)配置成控制生物反应器的至少一种条件的控制机构(controlmechanism)，其中根据式vi的化合物与大麻素合酶相互作用以生产根据式vii或式viii的化合物。

在一个实施方案中，使用本发明系统生产的式vii和viii化合物在用作药物或营养剂之前进行脱羧。

式vi、vii或viii中的取代基r¹⁴和r¹⁷各自独立地选自-h、乙酰基、丙酰基、3-羟基-2-甲基丙酰基、tms、tbdms、苄基、四氢吡喃基、-c(o)[ch2]x-c(o)oh、-c(o)[ch2]x-or¹⁸、-c(o)[chr¹⁸]x-c(o)oh、-c(o)[chr¹⁸]x-or¹⁹、-c(o)[cr¹⁸r¹⁹]x-or²⁰、-c(o)o[ch2]x-or¹⁸、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or¹⁸、-c(o)-c(o)-[och2ch2]x-or¹⁸、-c(o)[ch2]x-nr¹⁸r¹⁹、-c(o)o[ch2]x-nr¹⁸r¹⁹、-c(o)-nh-[ch2]x-nr¹⁸r¹⁹、-c(o)[ch2]x-n⁺(r¹⁸)(r¹⁹))(r²⁰)x^-、-c(o)o[ch2]x-n⁺(r¹⁸)(r¹⁹))(r²⁰)x^-、-c(o)-nh-[ch2]x-n⁺(r¹⁸)(r¹⁹))(r²⁰)x^-、l-氨基酸残基、d-氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基、-p(o)[oy](oz)和-p(o)[nr¹⁸nr¹⁹][oy](oz)。

取代基r¹⁵为-h、-cooh、-coor^a或-(ch2)ncooh并且r¹⁶选自(c1-c10)烷基、(c2-c10)烯基、(c2-c10)炔基、(c3-c10)环烷基、(c3-c10)环烷基亚烷基、(c3-c10)芳基和(c3-c10)芳基亚烷基。

对于根据式vi、vii或viii的化合物，r^a为(c1-c10)烷基，例如甲基、乙基或丁基并且取代基r¹⁸、r¹⁹和r²⁰各自独立地选自-h、-oh、甲酰基、乙酰基、新戊酰基和(c1-c5)烷基。

对于一些式vi、vii或viii化合物，r¹⁴和r¹⁷各自独立地为-c(o)[ch2]x-or¹⁸、-c(o)[chr¹⁸]x-c(o)oh、-c(o)[chr¹⁸]x-or¹⁹、-c(o)[cr¹⁸r¹⁹]x-or²⁰、-c(o)o[ch2]x-or¹⁸、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or¹⁸和-c(o)-c(o)-[och2ch2]x-or¹⁸。对于这样的化合物，取代基r¹⁸、r¹⁹和r²⁰各自独立地为-h或(c1-c5)烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基或叔丁基。对于某些其他化合物，取代基r¹⁸和r¹⁹选自-nh2、-nh(ch3)、-nh(ch2ch3)或n(ch3)2。

在一个实施方案中，r¹⁸和r¹⁹各自独立地为-h或(c1-c5)烷基并且-nr¹⁸r¹⁹基团为-nh2、-nh(ch3)、-nh(ch2ch3)和n(ch3)2。根据另一个实施方案，r¹⁸和r¹⁹各自独立地为甲酰基或乙酰基并且基团-nr¹⁸r¹⁹为-nh[c(o)h]或-nh[c(o)ch3]。

变量“x”为来自可药用酸的反荷离子并且变量“y”和“z”各自独立地选自-h、(c1-c5)烷基、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵阳离子、甲基铵阳离子和可药用碱。对于式vi、vii和viii化合物，下标“x”和“n”独立地选自0、1、2、3、4、5和6。

在一个实施方案中，大麻素合酶是选自以下的天然酶或重组酶：四氢大麻酚酸合酶(tetrahydrocannabinolicacidsynthase，thca合酶)、四氢次大麻酚酸合酶(tetrahydrocannabivarinacidsynthase，thcva合酶)、大麻二酚酸合酶(cannabidiolicacidsynthase，cbda合酶)或大麻色烯酸合酶(cannabichromeneacidsynthase，cbca合酶)。

上述一般描述和下面的详细描述是示例性和解释说明性的，并且旨在对要求保护的本发明提供进一步解释说明。从以下对本发明的详细描述中，其他目的、优点和新特征对本领域技术人员来说将是很明显的。

发明详述

定义

除非另有说明，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。因此，例如，提及“细胞”包括多个/种细胞，且提及“分子”是提及一个/种或更多个/种分子。

本文中使用的“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且将根据其使用的上下文有某种程度的变化。如果在使用它的上下文中，该术语的使用对本领域普通技术人员不清楚，那么“约”将意指达到特定项的加或减10％。

术语“烷基”是指具有指定碳原子数的直链或支链饱和烃。例如，(c1-c10)烷基意指包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基和新己基等。烷基可以是未经取代的或任选地经一个或更多个如下文中所述的取代基取代的。

术语“烯基”是指具有指定碳原子数和至少一个双键的直链或支链不饱和烃。(c2-c10)烯基基团的实例包括但不限于乙烯、丙烯、1-丁烯、2-丁烯、异丁烯、仲丁烯、1-戊烯、2-戊烯、异戊烯、1-己烯、2-己烯、3-己烯、异己烯、1-庚烯、2-庚烯、3-庚烯、异庚烯、1-辛烯、2-辛烯、3-辛烯、4-辛烯和异辛烯。烯基基团可以是未经取代的或任选地经一个或更多个如下文中所述的取代基取代的。

术语“炔基”是指具有指定碳原子数和至少一个三键的直链或支链不饱和烃。(c2-c10)炔基的实例包括但不限于乙炔、丙炔、1-丁炔、2-丁炔、1-戊炔、2-戊炔、1-己炔、2-己炔、3-己炔、1-庚炔、2-庚炔、3-庚炔、1-辛炔、2-辛炔、3-辛炔和4-辛炔。炔基可以是未经取代的或任选地经一个或更多个如下文中所述的取代基取代的。

术语“烷氧基”是指具有指定碳原子数的-o-烷基。例如，(c1-c6)烷氧基包括-o-甲基、-o-乙基、-o-丙基、-o-异丙基、-o-丁基、-o-仲丁基、-o-叔丁基、-o-戊基、-o-异戊基、-o-新戊基、-o-己基、-o-异己基和-o-新己基。

术语“芳基”是指3至14元的单环、双环、三环或多环芳香烃环体系。芳基基团的实例包括萘基、芘基和蒽基。芳基可以是未经取代的或任选地经一个或更多个如下文中所述的取代基取代的。

术语“亚烷基”、“亚环烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”、“亚芳基”和“亚杂芳基”单独或作为另一取代基的一部分，分别意指来自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基的二价基团，例如-ch2ch2ch2ch2-。对于亚烷基、亚烯基或芳基连接基团，没有暗示连接基团的取向。

术语“卤素”和“卤”是指-f、-cl、-br或-i。

术语“杂原子”意指包括氧(o)、氮(n)和硫(s)。

“羟基(hydroxyl)”或“羟基(hydroxy)”是指-oh基团。

术语“羟烷基”是指具有指定碳原子数的烷基基团，其中一个或更多个烷基基团的氢原子被-oh基团替代。羟烷基基团的实例包括但不限于-ch2oh、-ch2ch2oh、-ch2ch2ch2oh、-ch2ch2ch2ch2oh、-ch2ch2ch2ch2ch2oh、-ch2ch2ch2ch2ch2ch2oh、及其支链形式。

术语“环烷基”或“碳环”是指单环、双环、三环或多环的，3元至14元环体系，其为饱和的、不饱和的或芳香族的。杂环可通过任何杂原子或碳原子连接。环烷基包括如上定义的芳基和杂芳基。环烷基的代表性实例包括但不限于环乙基、环丙基、环异丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、苯基、萘基、蒽基、苯并呋喃基和苯并噻吩基。环烷基可以是未经取代的或任选地经一个或更多个如下文中所述的取代基取代的。

术语“腈或氰基”可互换使用并且是指与杂芳基环、芳基环和杂环烷基环的碳原子结合的-cn基团。

术语“胺或氨基”是指-nrcrd基团，其中rc和rd各自独立地是指氢、(c1至c8)烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、(c1-c8)卤代烷基和(c1-c6)羟烷基基团。

术语“tms”是指三甲基甲硅烷基基团。

术语“tbdms”是指叔丁基二甲基甲硅烷基基团。

术语“苄基”或“bz”是指苄基，即，c6h5-ch2-基团。

术语“thp”是指四氢吡喃基团。

术语“烷基芳基”是指c1-c8烷基基团，其中c1-c8烷基链的至少一个氢原子被芳基原子取代，该芳基原子可任选地用一个或更多个如下文中所述的取代基取代。烷基芳基的实例包括但不限于甲基苯基、乙基萘基、丙基苯基和丁基苯基基团。

“芳基亚烷基”是指二价亚烷基，其中c1-c10亚烷基基团中的一个或更多个氢原子被(c3-c14)芳基取代。(c3-c14)芳基-(c1-c10)亚烷基的实例包括但不限于1-苯基亚丁基、苯基-2-亚丁基、1-苯基-2-甲基亚丙基、苯基亚甲基、苯基亚丙基和萘基亚乙基。

“芳基亚烯基”是指二价亚烯基，其中c2-c10亚烯基基团中的一个或更多个氢原子被(c3-c14)芳基基团替代。

术语“芳基亚炔基”是指二价亚炔基，其中c2-c10亚炔基基团中的一个或更多个氢原子被(c3-c14)芳基基团替代。

术语“羧基”和“羧酸酯/盐(carboxylate)”包括可如以下通式所示的这样的部分：

式中的e为键或o并且r^f单独地为h、烷基、烯基、芳基或可药用盐。当e是o，并且r^f是如上所定义时，该部分在本文中是指羧基基团，并且特别地当r^f是氢时，该式表示“羧酸”。一般而言，其中明确显示的氧被硫替代时，该式表示“硫代羰基”基团。

除非另有说明，否则“立体异构体”意指基本上不含所述化合物的其他立体异构体的化合物的一种立体异构体。因此，具有一个手性中心的立体异构纯化合物将基本上不含该化合物的相反对映体。具有两个手性中心的立体异构纯化合物将基本上不含该化合物的其他非对映体。典型的立体异构纯化合物包含大于按重量计约80％的化合物的一种立体异构体和小于按重量计约20％的化合物的其他立体异构体，例如大于按重量计约90％的化合物的一种立体异构体和小于按重量计约10％的化合物的其他立体异构体，或大于按重量计约95％的化合物的一种立体异构体和小于按重量计约5％的化合物的其他立体异构体，或大于按重量计约97％的化合物的一种立体异构体和小于按重量计约3％的化合物的其他立体异构体。

如果所示结构与对该结构给定的名称之间存在差异，则以所示结构为准。此外，如果结构或结构的一部分的立体化学未用例如粗体或虚线表示，则结构或结构的一部分应解释为包含其所有立体异构体。

本发明集中于大麻素或大麻素类似物的前药以及用于制造大麻素或大麻素类似物的前药的生物合成方法。更具体地，本发明涉及在无细胞环境中大麻素或大麻素类似物的前药形式的酶催化合成。

术语“前药”是指生物活性药剂(药物)的前体。前药必须经历化学或代谢转换变成生物活性药剂。可通过化学转化方法将前药离体转换为生物活性药剂。在体内，通过去除前药部分以形成生物活性药剂的代谢过程、酶促过程或降解过程的作用将前药转化为生物活性药剂。

因此，在一个其实施方案中，本发明提供了用于生产根据式ii或式iii的大麻素前药的方法：

通过使根据式i的化合物与大麻素合酶接触以生产根据式ii或式iii的化合物。

对于式i、ii和iii化合物，取代基r和r³各自独立地选自-h、乙酰基、丙酰基、3-羟基-2-甲基丙酰基、tms、tbdms、苄基、四氢吡喃基、-c(o)[ch2]x-c(o)oh、-c(o)[ch2]x-or⁴、-c(o)[chr4]x-c(o)oh，-c(o)[chr⁴]x-or⁵、-c(o)[cr⁴r⁵]x-or⁶、-c(o)o[ch2]x-or⁴、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or⁴、-c(o)-c(o)-[och2ch2]x-or⁴、-c(o)[ch2]x-nr⁴r⁵、-c(o)o[ch2]x-nr⁴r⁵、-c(o)-nh-[ch2]x-nr⁴r⁵、-c(o)[ch2]x-n⁺(r⁴)(r⁵))(r⁶)x^-、-c(o)o[ch2]x-n⁺(r⁴)(r⁵))(r⁶)x^-、-c(o)-nh-[ch2]x-n⁺(r⁴)(r⁵))(r⁶)x^-、l-氨基酸残基、d-氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基、-p(o)[oy](oz)和-p(o)[nr⁴nr⁵][oy](oz)。

对于某些式i、ii和iii化合物，取代基r¹为-h、-cooh、-coome、-cooet或-coo(t-bu)并且r²选自(c1-c10)烷基、(c2-c10)烯基、(c2-c10)炔基、(c3-c10)环烷基、(c3-c10)环烷基亚烷基、(c3-c10)芳基和(c3-c10)芳基亚烷基。因此，在一个实施方案中，本发明提供了式i、ii和iii化合物，其中r¹为-cooh并且r²为(c1-c10)烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。

在一个实施方案中，本发明提供了式ii化合物，其中取代基r为-c(o)[ch2]x-or⁴、-c(o)[chr⁴]x-or⁵、-c(o)[cr⁴r⁵]x-or⁶或-c(o)o[ch2]x-or⁴，r¹为-cooh，并且r²为(c1-c10)烷基，例如丙基或戊基。

对于这样的式ii化合物，取代基r⁴、r⁵和r⁶各自独立地选自-h、-oh、甲酰基、乙酰基、新戊酰基、-nh2、-nh(ch3)、-nh(ch2ch3)、n(ch3)2、-nh[c(o)h]、-nh[c(o)ch3]和(c1-c5)烷基。

根据该实施方案，当r为-c(o)[ch2]x-or⁴或-c(o)o[ch2]x-or⁴时，取代基r⁴为-h、甲基或乙基并且下标“x”为1、2、3、4、5或6。在一个实施方案中，r⁴为-h并且下标“x”为1或2。根据另一个实施方案，r⁴为-ch3并且下标“x”为1或2。

对于一些本发明的式ii化合物，r为-c(o)[chr⁴]x-or⁵，r¹为-cooh或-cooet，r²为丙基或戊基，并且下标“x”为1或2。在一个实施方案中，r⁴为-oh并且r⁵为-h、甲基或乙基。因此，本发明提供了用于生产根据式ii的大麻素前药的方法，其中取代基r为-c(o)-ch(oh)-ch2-oh，r¹为-cooh并且r²为丙基或戊基。

对于一些根据式ii的前药，取代基r为-c(o)[ch2]x-nr⁴r⁵、-c(o)-nh-[ch2]x-nr⁴r⁵、-c(o)o[ch2]x-n⁺(r⁴)(^r5)(r⁶)x^-，r¹为-cooh或-cooet，并且r²为(c1-c10)烷基，例如丙基或戊基。

在一个实施方案中，r为-c(o)o[ch2]x-n⁺(r⁴)(r⁵))(r⁶)x^-，r¹为-cooh或-cooet，并且r²为丙基或戊基。对于这样的式ii前药，r⁴、r⁵和r⁶各自独立地为-h、甲基、乙基或其组合并且x^-为反荷离子，例如氯离子、溴离子、磷酸根、乙酸根、柠檬酸根、硫酸根、琥珀酸根、半琥珀酸、草酸根或丙二酸根。对于这样的前药，下标“x”为1、2、3或4。

根据另一方面，对于根据式ii的化合物，r为-c(o)[ch2]x-nr⁴r⁵，r¹为-cooh或-cooet，并且r²为丙基或戊基。这样的化合物的取代基r⁴和r⁵各自独立地为-h、甲基、乙基、乙酰基或甲酰基并且下标“x”为1、2、3或4。

在另一个实施方案中，r为-c(o)-nh-[ch2]x-nr⁴r⁵并且r⁴和r⁵各自为-h、甲基、乙基、乙酰基或甲酰基。举例说明性的这样的前药不限于式ii化合物，其中r为-c(o)-nh-[ch2]-nh2、-c(o)-nh-[ch2]-n(ch3)2、-c(o)-nh-[ch2]-nh(ch3)、-c(o)-nh-[ch2]-nh(甲酰基)和-c(o)-nh-[ch2]-nch3(甲酰基)。

在一个实施方案中，式ii的前药是这样的前药，其中r为-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or⁴、-c(o)-c(o)-[och2ch2]x-or⁴，r¹为-cooh并且r²为丙基或戊基。举例说明性的这样的r基团不限于-c(o)-ch2-[och2ch2]2-oh、-c(o)-ch2-[och2ch2]2-och3、-c(o)-ch2-[och2ch2]3-oh和-c(o)-ch2-[och2ch2]2-och3。

可将如上所述根据式ii的大麻素前药在将其用作药剂之前任选地脱羧。脱羧通过保持本发明前药的药理学完整性的任何物理或化学方式实现，例如通过使在r¹处具有羧酸基团的式ii前药与热源或uv光接触。或者脱羧通过使这样的化合物的溶液与弱碱(例如与碳酸氢钠)接触来实现。

使用上述方案脱羧的举例说明性的式ii前药是那些，其中r¹为-cooh，r²为丙基或戊基，并且取代基r为以下中的一个：-c(o)[ch2]-oh、-c(o)[ch2]2-oh、-c(o)[ch2]-och3、-c(o)[ch2]2-och3、-c(o)-ch(oh)-ch2-oh、-c(o)o[ch2]-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(ch2ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]2-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)o[ch2]2-n⁺(ch2ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]2-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)nh[ch2]-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)nh[ch2]-n⁺(ch2ch3)3x^-、-c(o)nh[ch2]-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)nh[ch2]2-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)nh[ch2]2-n⁺(ch2ch3)3x^-或-c(o)nh[ch2]2-n⁺(ch3)3x^-。

根据又一个实施方案，脱羧的式ii前药是这样的化合物，其中r¹为-h，r²为丙基或戊基并且取代基r为聚乙二醇基团，例如-c(o)-ch2-[och2ch2]2-oh、-c(o)-ch2-[och2ch2]2-och3、-c(o)-ch2-[och2ch2]3-oh或-c(o)-ch2-[och2ch2]3-och3。

表1在结构上举例说明了使用本发明方法生产的示例性式ii前药，其中x-为如上所述的反荷离子。

表1

本发明方法还允许合成根据式iii的大麻素前药。如果必要的话，可使用上述方案中的一个将这些前药在其用作药剂之前进行脱羧。

因此，在一个实施方案中，根据式iii的前药是这样的化合物，其中取代基r为-c(o)[ch2]-oh、-c(o)[ch2]2-oh、-c(o)[ch2]-och3、-c(o)[ch2]2-och3或-c(o)-ch(oh)-ch2-oh，取代基r¹为-cooh、-coome或cooet，r²为丙基或戊基，并且r³为-h、tms、tbdms、四氢吡喃或苄基。

根据另一个实施方案，根据式iii的前药是这样的化合物，其中取代基r和r³各自独立地为-c(o)[ch2]-oh、-c(o)[ch2]2-oh、-c(o)[ch2]-och3、-c(o)[ch2]2-och3和-c(o)-ch(oh)-ch2-oh；取代基r¹为-h或-cooh，并且r²为丙基或戊基。

在一个实施方案中，根据式iii的前药是这样的化合物，其中取代基r为-c(o)o[ch2]-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(ch2ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]2-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)o[ch2]2-n⁺(ch2ch3)3x^-或-c(o)o[ch2]2-n⁺(ch3)3x^-，取代基r¹为-cooh或-cooet，并且r²为丙基或戊基。如果必要的话，可将这样的式iii前药在其用作药剂之前进行脱羧。

根据该实施方案的一个方面，根据式iii的前药是这样的化合物，其中r和r³二者均为-c(o)o[ch2]-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)o[ch2]n⁺(ch2ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]n⁺(ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]2-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)o[ch2]2-n⁺(ch2ch3)3x^-或-c(o)o[ch2]2-n⁺(ch3)3x^-，并且取代基r¹为-h或-cooh。

对于某些式iii前药，r为-c(o)nh[ch2]-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)nh[ch2]-n⁺(ch2ch3)3x^-、-c(o)nh[ch2]-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)nh[ch2]2-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)nh[ch2]2-n⁺(ch2ch3)3x^-或-c(o)nh[ch2]2-n⁺(ch3)3x^-。或者，r和r³二者均为-c(o)nh[ch2]-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)nh[ch2]-n⁺(ch2ch3)3x^-、-c(o)nh[ch2]-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)nh[ch2]2-n⁺(ch2ch3)2(ch3)x^-、-c(o)nh[ch2]2-n⁺(ch2ch3)3x^-或-c(o)nh[ch2]2-n⁺(ch3)3x^-，r¹为-h或-cooh并且r²为丙基或戊基。

对于这样的前药，x-为反荷离子，例如氯离子、溴离子、磷酸根、乙酸根、柠檬酸根、硫酸根、琥珀酸根、半琥珀酸根、草酸根或丙二酸根。

当r¹为-cooh时，可将式iii前药在其用作药剂之前进行脱羧。脱羧是通过使前药与热接触或将前药的溶液暴露于uv光或通过与碱(例如碳酸氢钠)溶液接触来进行。

对于任何式iii化合物，例如上述的化合物，当r³为式iii中的tms、苄基或tbdms时，在这些保护基用作药剂之前，使用化学领域公知的方案将这些保护基去除。

使用本发明方法生产的示例性式iii前药是表2中所示的那些。

表2

用于合成根据本发明方法的大麻素前药的大麻素酸合酶包括但不限于四氢大麻酚酸合酶(thca合酶)、四氢次大麻酚酸合酶(thcva合酶)、大麻二酚酸合酶(cbda合酶)或大麻色烯酸合酶(cbca合酶)。这些酶可从天然来源获得或者可通过使用任何合适的重组方法获得，包括使用pichiapink^tm酵母表达系统，其在2014年8月25日提交的美国临时申请no.：62/041,521和2016年2月26日以美国公开no.2016-0053220公开的2015年8月25日提交的美国专利申请14/835,444中描述，这些申请的内容通过引用以其整体并入本文。

在本发明的一个实施方案中，用于使用本发明方法生产前药的溶剂是水性缓冲液、非水性溶剂或包含水性缓冲液和非水性溶剂的混合物。通常用于本发明方法的缓冲液是柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、hepes、tris缓冲液、mops或甘氨酸缓冲液。举例说明性的非水溶剂包括但不限于二甲基亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)或异丙醇、β-环糊精和其组合。

在一个实施方案中，溶剂是水性缓冲液和非水性溶剂的混合物。对于这样的混合物，非水性溶剂的浓度可在10％至50％(v/v)之间变化，优选地，反应混合物中非水性溶剂的浓度为10％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一个实施方案中，反应混合物中非水性溶剂的浓度为30％。在另一个实施方案中，反应混合物中非水性溶剂的浓度为20％，或者可在10％和20％之间、10％至30％之间或10％至40％之间变化。

本申请的发明人已经出乎意料地发现，反应混合物中非水性溶剂的浓度影响酶催化反应的速率以及作为产物获得的大麻素前药的比例。例如，观察到两亲性的环糊精、环状寡糖的存在并且用作表面活性剂，加速了由式i化合物(底物)向式ii或式iii化合物(产物)的酶催化环化反应的速率。出乎意料地注意到反应混合物中环糊精的浓度还影响产物比例，即，使用本发明方法生产的式ii化合物的量与式iii化合物的量的比例。

另一个出乎意料的和意想不到的观察是反应混合物的ph影响使用本发明方法生产的大麻素前药的比例。在一个优选的实施方案中，当与thca合酶接触时，根据反应混合物的ph，根据本发明的式i化合物产生不同比例的四氢大麻酚酸(thca)的前药或大麻色烯酸(cbca)的前药。

因此，在其一个实施方案中，本发明提供了在反应混合物的不同ph值下生产大麻素前药的方法。在一个实例中，前药的生物酶促合成在3.0至8.0的ph下进行，例如在3.0至7.0、3.0至6.0、3.0至5.0或3.0至4.0的ph下进行。

在一个实施方案中，反应是在3.8至7.2的ph下进行。根据另一个实施方案，反应是在3.5至8.0、3.5至7.5、3.5至7.0、3.5至6.5、3.5至6.0、3.5至5.5、3.5至5.0或3.5至4.5的ph下进行。

本发明还提供了根据式iv或式v的大麻素前药。

对于式iv或式v前药，r⁷或r¹⁰各自独立地选自-h、乙酰基、丙酰基、3-羟基-2-甲基丙酰基、-c(o)[ch2]x-c(o)oh、-c(o)[ch2]x-or¹¹、-c(o)[chr¹¹]x-c(o)oh、-c(o)[chr¹¹]x-or¹²、-c(o)[cr¹¹r¹²]x-or¹³、-c(o)o[ch2]x-or¹¹、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or¹¹、-c(o)-c(o)-[och2ch2]x-or¹¹、-c(o)[ch2]x-nr¹¹r¹²、-c(o)o[ch2]x-nr¹¹r¹²、-c(o)-nh-[ch2]x-nr¹¹r¹²、-c(o)[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²))(r¹³)x^-、-c(o)o[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²))(r¹³)x^-、-c(o)-nh-[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²))(r¹³)x^-、l-氨基酸残基、d-氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基、-p(o)[oy](oz)和-p(o)[nr¹¹nr¹²][oy]。下标“x”和“n”独立地选自0、1、2、3、4、5和6。在多个实施方案中，取代基r¹¹、r¹²和r¹³各自独立地为-h或(c1-c5)烷基，例如甲基、乙基丙基、丁基或叔丁基。对于某些其他化合物，取代基r¹¹和r¹²选自-nh2、-nh(ch3)、-nh(ch2ch3)或n(ch3)2。

根据本发明的示例性β-氨基酸残基包括但不限于β-苯丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丁酸、3-氨基-3(3-溴苯基)丙酸、2-氨基-3-环戊烯-1-羧酸、3-氨基异丁酸、3-氨基-2-苯基丙酸、4，4-联苯丁酸、3-氨基环己烷羧酸、3-氨基环戊烷羧酸和2-氨基乙基苯乙酸。

举例说明性的γ-氨基酸包括但不限于γ-氨基丁酸、抑胃酶氨酸(statine)、4-氨基-3-羟基丁酸和4-氨基-3-苯基丁酸(巴氯芬)。

对于式iv或式v前药，取代基r⁸为-h、-cooh或-coor^a或-(ch2)ncooh并且式iv和v中的取代基r⁹选自(c1-c10)烷基、(c2-c10)烯基、(c2-c10)炔基、(c3-c10)环烷基、(c3-c10)环烷基亚烷基、(c3-c10)芳基和(c3-c10)芳基亚烷基。

当r⁸为-coor^a时，取代基r^a选自(c1-c10)烷基，例如甲基、乙基、丙基或叔丁基。在一个实施方案中，r^a为乙基或叔丁基。

对于根据本发明的前药，取代基r¹¹、r¹²和r¹³各自独立地选自-h、-oh、甲酰基、乙酰基、新戊酰基、-nh2、-nh(ch3)、-nh(ch2ch3)、n(ch3)2、-nh[c(o)h]、-nh[c(o)ch3]和(c1-c5)烷基，变量“x”是来自可药用酸的反荷离子，而变量“y”和“z”各自独立地选自-h、(c1-c5)烷基、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵阳离子、甲基铵阳离子和从可药用碱中获得的阳离子。式iv和v前药的下标“x”和“n”为任何整数，例如0、1、2、3、4、5或6。

示例性的可药用酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、氨茴酸、甲磺酸、硬脂酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、扑酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羟基乙磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、藻酸、β-羟基丁酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸。上述可药用盐列表并不意在是穷举性的而仅是举例说明性的，因为本领域普通技术人员将理解大麻素前药的其他可药用盐并且可使用处方领域中已知的方法来制备。

例如，通过使游离碱与合适的酸反应可容易地从游离碱制备酸加成盐。用于制备酸加成盐的合适的酸包括(i)有机酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等，以及(ii)无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。

在一个实施方案中，对于式iv和v前药，r¹¹、r¹²和r¹³各自独立地选自-h或(c1-c5)烷基。当r¹¹、r¹²或r¹³中的任何一个为(c1-c5)烷基时，烷基选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或其组合。在该实施方案方面，r¹¹、r¹²和r¹³各自独立地选自-h、甲基或乙基。

在一个实施方案中，r⁷为乙酰基、丙酰基、3-羟基-2-甲基丙酸，r⁸为-cooh，取代基r⁹为(c1-c10)烷基，并且r¹⁰为-h。

根据另一个实施方案，r⁷和r¹⁰中每一个各自独立地为乙酰基、丙酰基、3-羟基-2-甲基丙酸，r⁸为-cooh，并且取代基r⁹为(c1-c10)烷基，例如甲基、丙基或戊基。

对于一些式iv和v化合物，r⁷选自-c(o)[ch2]x-c(o)oh、-c(o)[ch2]x-or¹¹、-c(o)[ch2]x-nr¹¹r¹²、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or¹¹和-c(o)[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²)(r¹³)x^-。

根据一个实施方案，r⁷和r¹⁰各自独立的为-c(o)[ch2]x-c(o)oh、-c(o)[ch2]x-or¹¹、-c(o)[ch2]x-nr¹¹r¹²、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or¹¹或-c(o)[ch2]x-n⁺(r¹¹)(r¹²)(r¹³)x^-。

如果r⁸为-cooh，则可将式iv或式v前药在其用作药剂之前进行脱羧。脱羧通过使酸形式的式iv或式v前药与热接触，或使前药酸的溶液与热或uv光接触来实现。

在一个实施方案中，r⁸为-h，并且r⁹为根据式iv的前药的丙基或戊基。根据该实施方案，取代基r⁷选自乙酰基、新戊酰基、2-羟基乙酰基、-c(o)[ch2]2-oh、-c(o)[ch2]-och3、-c(o)[ch2]2-och3、-c(o)[ch(oh)-ch2]-oh和-c(o)[ch(oh)]-oh。

根据另一个实施方案，r⁷和r¹⁰二者均为选自乙酰基、新戊酰基、2-羟基乙酰基、-c(o)[ch2]2-oh、-c(o)[ch2]-och3、-c(o)[ch2]2-och3、-c(o)[ch(oh)-ch2]-oh和-c(o)[ch(oh)]-oh的化学部分。

在一个实施方案中，r⁷为乙酰基并且r¹⁰为2-羟基乙酰基。在另一个实施方案中，r⁷为乙酰基并且r¹⁰为-c(o)[ch2]2-oh或-c(o)[ch2]-och3。

在又一个实施方案中，r⁷为-c(o)[ch(oh)-ch2]-oh并且r¹⁰为乙酰基。

在又一个实施方案中，r⁷为-h并且r¹⁰选自乙酰基、新戊酰基、2-羟基乙酰基、-c(o)[ch2]2-oh、-c(o)[ch2]-och3、-c(o)[ch2]2-och3、-c(o)[ch(oh)-ch2]-oh和-c(o)[ch(oh)]-oh。

在一个实施方案中，r⁷为-h并且r¹⁰为乙酰基。在另一个实施方案中，r⁷为-h并且r¹⁰为-c(o)[ch2]2-oh或-c(o)[ch2]-och3。

在一个实施方案中，r⁷为-h并且r¹⁰为-c(o)[ch2]2-och3。根据另一个实施方案，r⁷为-h并且r¹⁰为-c(o)[ch(oh)-ch2]-oh或-c(o)[ch(oh)]-oh。

在一个实施方案中，取代基r⁷是选自以下的基团：-c(o)o[ch2]-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(et)(ch3)2x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺ch3(et)2x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(et)3x^-或-c(o)o[ch2]4-n⁺(ch3)3x^-，r⁸为-h，r⁹为丙基并且r¹⁰为-h。

在一个实施方案中，r⁷和r¹⁰二者均为-c(o)o[ch2]-n⁺(ch3)3x^-或-c(o)o[ch2]-n⁺ch3(et)2x^-。

根据另一个实施方案，r⁷和r¹⁰二者均为-c(o)o[ch2]-n⁺(et)(ch3)2x^-或-c(o)o[ch2]-n⁺(et)3x^-。在又一个实施方案中，r⁷和r¹⁰二者均为-c(o)o[ch2]4-n⁺(ch3)3x^-。

根据另一个实施方案，取代基r⁷选自-c(o)o[ch2]-n⁺(ch3)3x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(et)(ch3)2x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺ch3(et)2x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺(et)3x^-或-c(o)o[ch2]4-n⁺(ch3)3x^-，r⁹为戊基并且r¹⁰为-h。

根据另一个实施方案，式v中的r⁷和r¹⁰二者均为-c(o)o[ch2]-n⁺(ch3)3x^-或-c(o)o[ch2]-n⁺ch3(et)2x^-。

在一个实施方案中，式v中的r⁷和r¹⁰二者均为-c(o)o[ch2]-n⁺(et)3x^-。在又一个实施方案中，式v中的r⁷和r¹⁰二者均为-c(o)o[ch2]4-n⁺(ch3)3x^-。

对于某些式iv或式v化合物，r⁷或r10是选自以下的基团：-c(o)nh[ch2]nh2、-c(o)nh[ch2]4nh2、-c(o)nh[ch2]nh(ch3)、-c(o)nh[ch2]nh(甲酰基)，或包含peg的前药(例如-c(o)och2-[och2ch2]2-och3或-c(o)och2-[och2ch2]3-och3)并且r⁹为丙基或戊基。

根据一个实施方案，r7和r10各自独立地选自-c(o)nh[ch2]nh2、-c(o)nh[ch2]4nh2、-c(o)nh[ch2]nh(ch3)、-c(o)nh[ch2]nh(甲酰基)、-c(o)och2-[och2ch2]2-och3和-c(o)och2-[och2ch2]3-och3。

可将根据式iv或式v的大麻素或大麻素类似物的前药在使用前进行纯化。纯化通过在化学和生物化学领域中常规使用程序的进行，包括溶剂萃取或色谱纯化方法。纯化的前药产物的纯度可通过薄层色谱(tlc)、与质谱仪联用的高效液相色谱法(hplc-ms)或通过任何合适的分析技术确定。核磁共振波谱、质谱分析或uv、可见光谱是可用于确认本发明前药特性(identity)的分析方法的实例。

通常来说，本发明前药的对映体纯度为约90％ee至约100％ee，例如，根据本发明的大麻素或大麻素类似物的前药可具有约91％ee、约92％ee、约93％ee、约94％ee、约95％ee、约96％ee、约97％ee、约98％ee和约99％ee的对映体纯度。大麻素具有不同的生理特性并且已知可减轻疼痛、刺激食欲并且已被测试作为用于治疗多种疾病状况(例如变态反应、炎症、感染、癫痫、抑郁、偏头痛、双相障碍、焦虑障碍和青光眼)的候选治疗剂。大麻素所发挥的生理作用受其刺激大麻素受体(例如cb1、cb2和cb3受体)或使其失活的能力影响。

使用生物反应器大规模生产大麻素前药

本发明提供了包含用于大规模生产大麻素前药的生物反应器的系统。用于合成大麻素前药的生物反应器可配置成用于分批合成或连续合成以允许商业化生产药学上可用的大麻素前药。

在一个实施方案中，用于生产根据式vii或式viii的大麻素前药的系统：

包含：

(i)包含溶剂、大麻素合酶和根据式vi的反应物的生物反应器；

(ii)配置成控制生物反应器的至少一种条件的控制机构，其中根据式vi的化合物与大麻素合酶相互作用以生产根据式vii或式viii的化合物；以及

(iii)任选地使式vii或式viii化合物脱羧。

对于根据式vi、vii和viii的化合物，取代基r¹⁴和r¹⁷各自独立地选自-h、乙酰基、丙酰基、3-羟基-2-甲基丙酰基、tms、tbdms、苄基、四氢吡喃、-c(o)[ch2]x-c(o)oh、-c(o)[ch2]x-or¹⁸、-c(o)[chr¹⁸]x-c(o)oh、-c(o)[chr¹⁸]x-or¹⁹、-c(o)[cr¹⁸r¹⁹]x-or²⁰、-c(o)o[ch2]x-or¹⁸、-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or¹⁸、-c(o)-c(o)-[och2ch2]x-or¹⁸、-c(o)[ch2]x-nr¹⁸r¹⁹、-c(o)o[ch2]x-nr¹⁸r¹⁹、-c(o)-nh-[ch2]x-nr¹⁸r¹⁹、-c(o)[ch2]x-n⁺(r¹⁸)(r¹⁹))(r²⁰)x^-、-c(o)o[ch2]x-n⁺(r¹⁸)(r¹⁹))(r²⁰)x^-、-c(o)-nh-[ch2]x-n⁺(r¹⁸)(r¹⁹))(r²⁰)x^-、l-氨基酸残基、d-氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基、-p(o)[oy](oz)和-p(o)[nr¹⁸nr¹⁹][oy](oz)。

在一个实施方案中，r¹⁴为-c(o)[chr¹⁸]x-or¹⁹、-c(o)o[ch2]x-or¹⁸或-c(o)-ch2-[och2ch2]x-or¹⁸，并且取代基r¹⁸和r¹⁹各自独立地为-h、甲基、乙基或丙基。

根据另一个实施方案，当r¹⁴为-c(o)[chr¹⁸]x-or¹⁹时，取代基r¹⁸为-oh、-nh2、-nh(ch3)、-nh(ch2ch3)、n(ch3)2、-nh[c(o)h]、-nh[c(o)ch3]、甲基或乙基并且r¹⁹为-h或甲基。

对于某些式vii化合物，r¹⁴为-c(o)o[ch2]-oh、-c(o)o[ch2]2-och3、-c(o)o[ch2-ch(oh)]-oh或-c(o)o[ch2-ch(oh)]-och3并且r¹⁷为-h。

在一个实施方案中，取代基r¹⁴和r¹⁷二者均为-c(o)-ch2-[och2ch2]2-oh或-c(o)-ch2-[och2ch2]3-oh。根据另一个实施方案，r¹⁴为-c(o)-ch2-[och2ch2]2-oh或-c(o)-ch2-[och2ch2]3-oh并且r¹⁷为-h。

在一个实施方案中，r¹⁴为-c(o)[ch2]x-nr¹⁸r¹⁹、-c(o)o[ch2]x-nr¹⁸r¹⁹、-c(o)-nh-[ch2]x-nr¹⁸r¹⁹或季铵基团，例如选自-c(o)[ch2]x-n⁺(r¹⁸)(r¹⁹))(r²⁰)x^-、-c(o)o[ch2]x-n⁺(r¹⁸)(r¹⁹))(r²⁰)x^-、-c(o)-nh-[ch2]x-n⁺(r¹⁸)(r¹⁹))(r²⁰)x^-的基团。

对于这样的式vii和viii前药，r¹⁸、r¹⁹和r²⁰各自独立地选自-h、-oh、甲酰基、乙酰基、新戊酰基、甲基、乙基、丙基、丁基和戊基并且x-选自氯离子、乙酸根、丙二酸根或琥珀酸根。下标“x”和“n”独立地选自0、1、2、3、4、5和6。

在一个实施方案中，r¹⁴为-c(o)-nh-[ch2]4-nh2、-c(o)-nh-[ch2]4-nh(ch3)或-c(o)-nh-[ch2]4-n(ch3)2并且r¹⁵为-h。

根据另一个实施方案，r¹⁴为-c(o)o[ch2]-nh2、-c(o)o[ch2]-nh(ch3)或-c(o)o[ch2]-n(ch3)2并且r¹⁵为-h。

在又一个实施方案中，r¹⁴为-c(o)[ch2]-n⁺h3x^-、-c(o)[ch2]2-n⁺h3x^-、-c(o)[ch2]-n⁺h2(ch3)x^-或-c(o)[ch2]-n⁺h(ch3)2x^-，r¹⁵为-h。

在又一个实施方案中，r¹⁴为-c(o)o[ch2]-n⁺h3x^-、c(o)o[ch2]2-n⁺h3x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺h2(ch3)x^-或-c(o)o[ch2]-n⁺h(ch3)2x^-，并且r¹⁵为-h。

在又一个实施方案中，r¹⁴为-c(o)nh[ch2]-n⁺h3x^-、-c(o)nh[ch2]2-n⁺h3x^-、-c(o)nh[ch2]-n⁺h2(ch3)x^-或-c(o)nh[ch2]-n⁺h(ch3)2x^-，并且r¹⁵为-h。

本发明在其一个实施方案中提供了式vii化合物，其中r¹⁴和r¹⁷二者均选自-c(o)o[ch2]-nh2、-c(o)o[ch2]-nh(ch3)、-c(o)o[ch2]-n(ch3)2、-c(o)[ch2]-n⁺h3x^-、-c(o)[ch2]2-n⁺h3x^-、-c(o)[ch2]-n⁺h2(ch3)x^-、-c(o)[ch2]-n⁺h(ch3)2x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺h3x^-、-c(o)o[ch2]2-n⁺h3x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺h2(ch3)x^-、-c(o)o[ch2]-n⁺h(ch3)2x^-、-c(o)nh[ch2]-n⁺h3x^-、-c(o)nh[ch2]2-n⁺h3x^-、-c(o)nh[ch2]-n⁺h2(ch3)x^-和-c(o)nh[ch2]-n⁺h(ch3)2x^-。变量x^-为反荷离子并且为碱金属阳离子、碱土金属阳离子或由可药用酸提供的反荷离子。

在一个实施方案中，r¹⁵为-cooh或-(ch2)ncooh并且“n”为1。根据另一个实施方案，根据式vii或式viii的化合物在药用之前进行脱羧并且对于这样的化合物，r¹⁵为-h。

在一个实施方案中，r¹⁵为-coora，例如-coome或-cooet。对于这样的化合物，在脱羧之前，通过与碱(例如碳酸氢钠溶液)接触可以发生酯的水解。

式vi、vii和viii中的r¹⁶选自(c1-c10)烷基、(c2-c10)烯基、(c2-c10)炔基、(c3-c10)环烷基、(c3-c10)环烷基亚烷基、(c3-c10)芳基和(c3-c10)芳基亚烷基。在一个实施方案中，r¹⁶为(c1-c10)烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。

在一个实施方案中，前药是-p(o)[oy](oz)，且为选自磷酸二氢盐、碱金属磷酸盐、碱土金属磷酸盐的磷酸盐和有机碱的磷酸盐。

根据该实施方案，当前药是有机碱的磷酸盐时，有机碱选自胆碱、甜菜碱、咖啡因、n，n-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、葡糖胺、异丙胺、甲基葡糖胺、吗啉、哌啶、三乙胺、三甲胺、三丙胺、四甲基氢氧化铵、哌嗪、组氨酸、精氨酸和赖氨酸。

对于某些式vii和viii化合物，变量“y”和“z”独立地选自-h、-h、(c1-c5)烷基、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵阳离子和甲基铵阳离子。

在一个实施方案中，用于生产大麻素前药的系统包含配置成用于批量合成的生物反应器。因此，介质的组成、酶和底物的浓度在生物酶促过程开始时是固定的，并且在催化期间不允许改变。当生物反应器的介质中期望产物的浓度达到预定值或底物的浓度低于预定水平时(例如达到其中没有可检测到的底物向产物的催化转化的水平时)，合成终止。

在一个实施方案中，大麻素酸合酶是his标记的，以便通过将his标记的酶隔离到生物反应器内的含镍树脂支持物上从而促进酶与反应介质中产物的分离。

批量处理模式的替代方案是连续处理模式，其中向生物反应器中连续添加限定量的底物和介质，同时从生物反应器中去除含有大麻素产物的等量介质以保持产品形成的恒定速率。

可使用任何控制机构来控制生物反应器的条件。控制机构可与生物反应器偶联，或者可无线地或远程地与生物反应器相互作用。使用控制机构来控制条件，例如进出生物反应器的氧水平、搅拌、ph和材料流动(例如通过控制至少一个泵)。在一些实施方案中，控制机构配置成基于从光学监测系统中获得的信息来控制生物反应器的条件。

控制机构可包含具有处理器和存储器装置的处理电路，其配置成以完成或促进多种过程和功能，例如控制生物反应器中的ph、温度和压力，或改变介质进出生物反应器的流量。这样的控制受与至少一个传感器多于一个传感器的通信影响。

药物组合物

将使用本发明方法合成的式ii或式iii的前药，或使用本发明系统的生物反应器生产的根据式iv或v的前药或根据式vii或式viii的前药施用于需要单独治疗或与具有相似或不同生物活性的其他化合物组合治疗的患者或对象。例如，可将前药和包含本发明前药的组合物以组合治疗施用，即以单个或分开的剂型同时施用，或在彼此在数小时或数天内以分开的剂型施用。这样的组合治疗的实例包括将包含根据式ii、iii、iv、v、vii和viii的前药的组合物与用于治疗以下的其他药剂一起施用：青光眼、aids消瘦、神经性疼痛、与多发性硬化相关的痉挛状态的治疗、纤维肌痛和化疗引起的恶心、呕吐、消度综合征(wastingsyndrome)、hiv-消瘦、酒精使用障碍(alcoholusedisorder)、张力失常、多发性硬化、炎性肠病、关节炎、皮炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、抗炎、抗惊厥、抗精神病、抗氧化、神经保护、抗癌、免疫调节作用、周围神经性疼痛、与带状疱疹后神经痛相关的神经性疼痛、糖尿病神经病变、带状疱疹、烧伤、光线性角化病、口腔疮和溃疡、会阴切开术后疼痛、银屑癣、瘙痒症、接触性皮炎、湿疹、大疱性疱疹样皮炎(bullousdermatitisherpetiformis)、剥脱性皮炎、蕈样肉芽肿病、天疱疮、重度多形红斑(例如，史-约综合征(stevens-johnsonsyndrom))、脂溢性皮炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、莱特尔综合征(reiter’ssyndrome)、痛风、软骨钙质沉着症、痛经继发性关节疼痛、纤维肌痛、肌肉骨骼疼痛、神经病性术后并发症、多发性肌炎、急性非特异性腱鞘炎、滑囊炎、上髁炎、创伤后骨关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、滑膜炎、幼年型类风湿性关节炎和毛发生长抑制。

本发明还提供了药物组合物，其包含与可药用载体混合的根据本发明的前药的可药用盐、溶剂合物或立体异构体。在一些实施方案中，按照药物调剂(pharmaceuticalcompounding)的习惯做法(acceptedpractice)，组合物还包含一种或更多种另外的治疗剂、可药用赋形剂、稀释剂、辅助剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、着色剂、缓冲剂、风味赋予剂。

本发明的组合物可以以剂量单位制剂经口、表面、肠胃外、通过吸入或喷雾或经直肠施用。本文中使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输液技术。

根据本发明的合适的经口组合物包括但不限于片剂、含片(troche)、锭剂(l0zenge)、水性或油性混悬剂、可分散的散剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆剂或酏剂。

包括在本发明范围内的是适合于单一单位剂量的药物组合物，其包含本发明的前药，其可药用的立体异构体、盐、溶剂合物、水合物、或互变异构体和可药用载体。

适合于经口使用的本发明组合物可根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备。例如，本发明前药的液体制剂包含选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的一种或更多种试剂，以提供本发明前药的药学上优雅且适口的制剂。

对于片剂组合物，与无毒可药用赋形剂混合的活性成分用于制造片剂。这样的赋形剂的实例包括但不限于惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；黏合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未经包衣的或其可通过已知的包衣技术进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并因此在期望的时间段中提供持续的治疗作用。例如，可使用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

用于经口使用的制剂也可作为硬明胶胶囊提供，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。

对于水性混悬剂，将本发明前药与适于维持稳定混悬剂的赋形剂混合。这样的赋形剂的实例包括但不限于羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶。

经口混悬剂还可包含分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂，例如卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、十七碳乙烯氧基鲸蜡醇、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯、聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬剂还可含有一种或更多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯、一种或更多种着色剂、一种或更多种矫味剂，以及一种或更多种甜味剂(例如蔗糖或糖精)。

油性混悬剂可通过将前药混悬在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来制备。油性混悬剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。

糖浆剂和酏剂可用甜味剂(例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖)配制。这样的制剂还可包含缓和剂(demulcent)、防腐剂和矫味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌注射剂或水性混悬剂的形式。该混悬剂可根据本领域已知使用那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂配制。无菌可注射制剂还可以是无菌可注射溶液或无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂的混悬剂，例如作为1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受载剂和溶剂是水、林格液(ringer’ssolution)和等张氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油通常用作溶剂或助悬介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(例如油酸)可用于注射剂的制备。

用于肠胃外施用的组合物在无菌介质中施用。根据所使用的载剂和制剂中药物的浓度，肠胃外制剂可以是混悬剂或包含溶解的药物的溶液剂。还可将辅助剂(例如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂)添加至肠胃外组合物。

在药物组合物中以本发明的大麻素前药的按重量计总量为约0.1％至约95％。例如，按药物组合物的重量计大麻素前药(例如本发明的大麻二酚前药、thc前药或thc-v前药)的量可以是约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％、约3％、约3.1％、约3.2％、约3.3％、约3.4％、约3.5％、约3.6％、约3.7％、约3.8％、约3.9％、约4％、约4.1％、约4.2％、约4.3％、约4.4％、约4.5％、约4.6％、约4.7％、约4.8％、约4.9％、约5％、约5.1％、约5.2％、约5.3％、约5.4％、约5.5％、约5.6％、约5.7％、约5.8％、约5.9％、约6％、约6.1％、约6.2％、约6.3％、约6.4％、约6.5％、约6.6％、约6.7％、约6.8％、约6.9％、约7％、约7.1％、约7.2％、约7.3％、约7.4％、约7.5％、约7.6％、约7.7％、约7.8％、约7.9％、约8％、约8.1％、约8.2％、约8.3％、约8.4％、约8.5％、约8.6％、约8.7％、约8.8％、约8.9％、约9％、约9.1％、约9.2％、约9.3％、约9.4％、约9.5％、约9.6％、约9.7％、约9.8％、约9.9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。

在一个实施方案中，药物组合物包含以下按重量计总量的大麻素前药：约1％至约10％；约2％至约10％；约3％至约10％；约4％至约10％；约5％至约10％；约6％至约10％；约7％至约10％；约8％至约10％；约9％至约10％；约1％至约9％；约2％至约9％；约3％至约9％；约4％至约9％；约5％至约9％；约6％至约9％；约7％至约9％；约8％至约9％；约1％至约8％；约2％至约8％；约3％至约8％；约4％至约8％；约5％至约8％；约6％至约8％；约7％至约8％；约1％至约7％；约2％至约7％；约3％至约7％；约4％至约7％；约5％至约7％；约6％至约7％；约1％至约6％；约2％至约6％；约3％至约6％；约4％至约6％；约5％至约6％；约1％至约5％；约2％至约5％；约3％至约5％；约4％至约5％；约1％至约4％；约2％至约4％；约3％至约4％；约1％至约3％；约2％至约3％；或约1％至约2％。

实施例

a.化学合成

a.橄榄酚(olivetol)的合成

使用公开的程序(focella，a，etal.，j.org.chem.，vol.42，no.21，(1977)，p.3456-3457)合成橄榄酚。

i.6-n-戊基-2-羟基-4-氧代-环己-2-烯-1-羧酸甲酯

向在230ml无水甲醇中的甲醇钠(32.4g，0.60mol)和丙二酸二甲酯(90g，0.68mol)的搅拌溶液分批添加75g(0.48mol)90％的3-壬烯-2-酮。然后将反应混合物在n2下回流3小时并使其冷却至室温。溶剂在减压下蒸馏，并将残余物溶解在350ml的水中。将白色晶体的浆料和几乎澄清的溶液用80ml氯仿萃取三次。将水层用浓hcl酸化至ph4，并在过滤之前使得形成的白色沉淀放置过夜。将晶体在50℃高真空下干燥5小时以得到106.5g(0.4416mol)(92％)的6-正戊基-2-羟基-4-氧代-环己-2-烯-1-羧酸甲酯(mp96至98℃)。产物用石油醚∶乙酸乙酯(9∶1)的混合物重结晶，并得到94g纯的6-正戊基-2-羟基-4-氧代-环己-2-烯-1-羧酸甲酯(熔点为98至100℃)。

ii.1-正戊基-3，5-二羟基苯(橄榄酚)

向溶解在115ml二甲基甲酰胺中的6-正戊基-2-羟基-4-氧代-环己-2-烯-1-羧酸甲酯的搅拌的冰冷溶液滴加37.9g(0.23mol)的溶解在60ml二甲基甲酰胺中的溴。在添加结束时(约90分钟)，将反应混合物缓慢加热至80℃，在此期间二氧化碳的逸出变得非常剧烈。

将反应保持在该温度直至气体逸出停止，然后将反应再次加热至160℃并在该温度下保持约10小时。加热后，使反应冷却并在减压下去除溶剂dmf。将由此获得的残余物用水(80ml)处理，并用250ml的醚萃取两次。合并的醚层用水洗涤，然后用2×80ml的10％亚硫酸氢钠溶液、2×80ml的10％乙酸溶液洗涤，并随后再次用水洗涤。

在经无水硫酸钠干燥后，在减压下去除溶剂以得到46.8g的黏性油状物。将油状物在减压下蒸馏以得到作为产物的30.3g(0.168mol)(69.3％)的橄榄酚。hplc分析表明纯度为97.5％。

b.cbg的合成

按照tauraetal.，(1996)，thejournalofbiologicalchemistry，vol.271，no.21，p.17411-17416中所公开的方案合成cbg。

2-[(2e)-3，7-二甲基辛-2，6-二烯基]-5-戊基-苯-1，3-二醇(大麻萜酚(cbg))的合成

将香叶醇(3g，0.0194mol)和橄榄酚(2g，0.0111mol)溶解在包含有80mg对甲苯磺酸作为催化剂的400ml氯仿中，并将反应混合物在室温下在黑暗中搅拌12小时。12小时后，将反应混合物用饱和碳酸氢钠(400ml)洗涤，并随后用h2o(400ml)洗涤。将氯仿层在减压下在40℃下浓缩，并使用苯(1000ml)作为洗脱剂将得到的残余物用2.0cm×25cm硅胶柱进行色谱分离以得到作为产物的1.4g(0.00442m0l)(39.9％)cbg。

或者，如下纯化粗制cbg。向250ml烧杯添加7.25g粗制cbg和50ml苯。使烧瓶涡旋以溶解cbg，并添加50g硅胶以及搅拌棒。将溶液搅拌过夜，并随后倒入到44cm×2.75cm柱中。将柱用300ml苯洗脱。测定洗脱液中约70ml级分的cbg。合并包含cbg的级分1、2和3(～230ml)，并在压力下去除溶剂以得到包含＞80％cbg的6.464g残余物，其具有适合用于下一合成步骤的纯度。

在一个实施方案中，通过在250ml烧杯中将7.25g粗制cbg残余物与硅胶的浆料(50ml)混合来纯化粗制cbg。将该混合物缓慢搅拌1小时，并随后使用细网滤纸真空过滤。将滤饼用250m1苯洗涤直至获得澄清的滤液。在减压下去除滤液中的溶剂以得到具有＞80％cbg的6.567g残余物。

c.甲基碳酸镁(mmc)的合成

按照balasubrahmanyametal.，(1973)，organicsynthesis，collectivevolumev，johnwiley&sons，inc.，p.439-444中公开的方案合成甲基碳酸镁(methylmagnesiumcarbonate，mmc)。

在干燥的2l三颈烧瓶上安装机械搅拌器、冷凝器和1l压力平衡加料漏斗，烧瓶的顶部装有进气管。将干净的干燥镁带(40.0g，1.65mol)置于烧瓶中，并在添加无水甲醇(600ml)前用氮气冲洗系统。通过冷却反应混合物控制氢气逸出。当氢气的逸出停止时，缓慢的氮气流通过系统，并且冷凝器由总的冷凝-部分取出蒸馏头代替。停止氮气流动并在减压下从溶液中蒸馏出大部分甲醇。当搅拌糊状的甲醇镁混悬液不再实用时停止蒸馏。使用氮气再次冲洗该系统，并将来自蒸馏头的出口连接至含有矿物油的小捕集器上，以便可估算从反应体系中逸出的气体体积。

向反应烧瓶添加无水二甲基甲酰胺(dmf)(700ml)，并在当无水二氧化碳流(stream)通过连接至加料漏斗的进气管进入反应容器时剧烈搅拌所得混悬液。二氧化碳的溶解伴随着与混悬的甲醇镁的放热反应。当不再吸收co2时，将无色溶液在缓慢的co2气流下加热，直至液体蒸馏的温度达到140℃，表明已从反应混合物中去除残留的甲醇。使用缓慢的氮气流冲洗反应混合物以有助于在惰性气氛下将混合物冷却至室温。这样得到具有536mgmmc/mldmf的溶液⁸。

d.cbga(3-[3，7-二甲基-2，6-辛二烯]-2，4-二羟基-6-戊基苯-1-羧酸)的合成

如下制备6-羧酸-2-[(2e)-3，7-二甲基辛-2，6-二烯基]-5-戊基-苯-1，3-二醇，大麻萜酚酸(cbga)。向10ml锥形瓶添加1ml的mmc的dmf溶液。向该溶液添加2-[(2e)-3，7-二甲基辛-2，6-二烯基]-5-戊基-苯-1，3-二醇(120mg，0.379mmol)。将烧瓶在120℃下加热1小时，其后将反应混合物溶解在100ml的氯仿∶甲醇(2∶1)溶液中。用稀hcl将该溶液的ph调节至ph2.0，并随后使用50ml的h2o进行分配。

有机层经硫酸钠干燥并且通过蒸发去除溶剂。粗反应的hplc分析显示cbg至cbga的转化率为约40％。

或者，将3.16g(10mmol)的cbg(或任何其他中性大麻素)、8.63g(100mmol)的甲醇镁和44g(1mol)的干冰密封在压力兼容容器中。将容器加热至50℃，并将温度保持在该值持续3小时。加热后，将容器冷却至室温并缓慢排气。将反应混合物溶解于100ml氯仿∶甲醇(2∶1)溶剂中。用稀hcl将该溶液的ph调节至ph2.0，并随后使用50ml的h2o分配该溶液。有机层经硫酸钠干燥并且通过蒸发去除溶剂。粗制反应混合物的hplc分析显示使用该方案的cbg至cbga的转化率为约85％。

使用2.0cm×25cm的硅胶柱通过色谱法纯化粗制cbga。用正己烷∶乙酸乙酯(2∶1)的混合物(1000ml)洗脱产物以得到45mg(0.125mmol)(37.5％)的期望产物。

或者，通过使用lh-20亲脂性树脂作为介质对粗制品进行色谱分离获得超高纯度cbga。首先使用2l的dcm∶氯仿(4∶1)溶剂使400g的lh-20sephadex树脂溶胀。将溶胀的树脂借助重力填充在44×2.75cm的柱中。向柱装载溶解在最少量dcm∶氯仿(4∶1)溶剂中的2.1g粗制cbga，并用1.7l相同溶剂洗脱。收集100ml级分。使用该溶剂系统将未反应的cbg洗脱为黄色/橙色溶液。在约1.7l该溶剂通过后，不再观察到黄色/橙色级分，并且将洗脱溶剂改为100％丙酮以洗脱结合的cbga。

将含有cbga的级分合并并除去溶剂以获得0.52gcbga(～90％回收率)。在用丙酮洗脱之前，提高dcm：氯仿(4∶1)溶剂通过柱的体积，得到纯度大于99.5％的cbga。

e.tbdms-cbga(3-[3，7-二甲基辛-2，6-二烯]-2-羟基-6-戊基-4-[叔丁基二甲基甲硅烷氧基]苯甲酸)或tbdms-cbga-乙酯(3-[3，7-二甲基辛-2，6-二烯]-2-羟基-6-戊基-4-[叔丁基二甲基甲硅烷氧基]苯甲酸乙酯)的合成

在氩气气氛下，向cbga或cbga-乙酯在dcm中的冷搅拌溶液中添加叔丁基二甲基甲硅烷基氯(1.0当量)和咪唑。使用tlc来监测反应进程。反应完成后通过添加盐水(brine)淬灭反应。在纯化和使用之前，分离有机层并使用无水硫酸镁干燥。如果使用cbga-乙酯作为起始原料，如果必要的话，在酶催化合成大麻素前药之前，可将产物水解成相应的酸。

使用类似的方案，在存在碱(例如咪唑)的情况下，通过cbga或cbga-酯与三甲基甲硅烷基氯的反应合成3-[3，7-二甲基辛-2，6-二烯]-2-羟基-6-戊基-4-[三甲基甲硅烷氧基]苯甲酸。

b.式i化合物的合成

a.大麻萜酚酸3，6，9，12-四氧杂十三烷酰酯的合成

将4-二甲基氨基吡啶(dmap)添加至二氯甲烷(dcm)中的3，6，9，12-四氧杂十三烷酸的溶液中。向该溶液添加n，n’-二环己基碳二亚胺或羰基二咪唑。在室温下搅拌后逐滴添加tbdms-cbga或tbdms-cbga-乙酯的dcm溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜、过滤并将滤液在减压下浓缩，之后通过硅胶柱色谱纯化粗制产物。

通过在-15℃下向大麻酚酸3，6，9，12-四氧杂十三烷酰酯的dcm溶液添加四丁基氟化铵或三乙胺三氢氟化物去除tbdms保护基。在该温度下搅拌反应混合物并使用tlc来监测脱保护的进程。随后将乙酸乙酯去保护(将etoac添加至反应并使用稀碳酸氢钠水溶液萃取(×3)有机层。

将合并的有机层干燥并在减压下蒸发溶剂，然后纯化。

b.大麻萜酚酸n，n-二甲基甘氨酰酯的合成

将4-二甲基氨基吡啶(dmap)添加至n，n-二甲基甘氨酸的dcm溶液。向该溶液添加n，n′-二环己基碳二亚胺。在室温下搅拌后，逐滴添加tbdms-cbga或tbdms-cbga-乙酯的dcm溶液。在室温下继续搅拌反应混合物过夜。第二天，过滤反应混合物并在减压下浓缩滤液，然后通过硅胶柱色谱纯化粗制产物。

使用本文中描述的方案进行tbdms保护基的去保护。

c.大麻萜酚酸(r)-2，3-二羟基丙基碳酸酯的合成

因此，在0℃下，在氩气气氛下，向在二氯甲烷中的(s)-2，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙-1-醇溶液添加三乙胺。向该溶液添加三光气，并将反应混合物在0℃下继续搅拌3至5小时。然后在0℃下将得到的氯甲酸(s)-2，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙酯溶液插管通至保持在氩的惰性气氛下的搅拌的tbdms-cbga或tbdms-cbga-乙酯和三乙胺的dcm溶液。

然后将所得混合物在室温下搅拌并通过tlc定期监测反应进程。完成后，将反应混合物稀释、过滤并将滤液在减压下浓缩以获得为油状物的cbga(s)-2，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙基碳酸酯。

通过在-15℃下将粗制产物溶解在冷dcm中实现tbdms保护基的去除。然后使该冷dcm溶液与三乙胺三氢氟酸盐(2n)的冷溶液接触，并在5℃下搅拌65小时。搅拌后向所得混合物添加etoac，然后在0℃添加碳酸氢钠稀水溶液并剧烈搅拌。将包含所见粗制品的有机层合并并干燥，然后使用hplc或硅胶柱色谱进行纯化。

使用上述合成方案来生产其他本发明的大麻素前药，例如，上述表1和2中举例说明的大麻素前药。应理解，可修改上述合成方案以适应用于制造本发明前药之部分的化学和反应性差异。然而，对合成方案这样的修改完全在化学领域普通技术人员掌握的范围内。

c.前药的合成

用于监测本发明前药的酶催化形成的举例说明性方案如下。本发明前药的酶催化合成在1.5mleppendorf扣帽管中进行。将25μl底物，例如以1.0mg/ml溶解在dmso中的式i化合物添加至200μl的100mm柠檬酸盐缓冲液(ph4.85)中。将该溶液在30℃下与25μl大麻素合酶孵育2小时。通过添加250μl的meoh终止反应并通过hplc进行分析。

在以下多种条件下测试酶活性：

1.测试如上所述的不同溶剂和溶剂混合物以增强底物溶解度并提高反应速率。

2.测定将在ph为4、5、6、7和8下进行。

3.酶测定在含有或不含有sds或triton-x的磷酸钠缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中进行。一些测定在混合溶剂系统中进行，所述混合溶剂系统包含不同浓度的dmso、dmf、ipa或环糊精(cyclodextrin，cd)。

4.在将反应混合物孵育1分钟至约4天的时间间隔后，监测前药的生物酶促合成。

式ii或式iii化合物的酶催化合成。

将2-羟丙基-β-环糊精(hpβcd；hpb)、磺丁基醚β-环糊精钠盐(sbeβcd；)或随机甲基化的β-环糊精(rmβcd；浓度35g/l)添加至10mm磷酸钠缓冲液(ph5.0)。在添加式i化合物之前，搅拌溶液以形成均匀溶液。在室温下混合1至2分钟后，添加thca合酶的缓冲溶液并将在30℃下孵育反应混合物。以均匀的时间间隔，取出等分试样(10μl)的反应混合物并将其添加至含有乙醇(50μl)的eppendorf管中以使酶变性。在10,000rpm下离心5分钟后，将乙醇层与变性的蛋白质沉淀物分离，转移至干净的eppendorf管，并使用氮气流蒸发溶剂。

将由此获得的残余物在缓冲液中重构并且通过反相hplc定量式ii或式iii前药的酶催化形成的进程。

或者，用95％etoh以10∶1稀释反应混合物以使环糊精沉淀出来，同时将大麻素或大麻素类似物的前药以及未反应的式i化合物留在溶液中。除去上清液后，蒸发溶剂并且在缓冲液中重构后，通过hplc分析由此得到的残余物。

用过量的90％etoh洗涤环糊精沉淀，并干燥以使其在以后的反应中重复使用。

1.式ii前药的合成

方案1举例说明了根据式ii的大麻素前药的生物酶促合成

方案1

将使用上述方案制备的cbgan，n-二甲基甘氨酰酯添加至在1.0mleppendorf管中含有环糊精和缓冲液的溶液。在cbga酯完全溶解后，将溶液在维持在37℃的控温水浴中孵育至少15分钟，然后添加已知量的thca合酶的缓冲溶液。

添加酶之后，以固定的时间间隔取出约25μl已知的反应混合物的等分试样，并通过添加固定体积的乙醇使酶变性。将沉淀离心后，分离乙醇层，干燥并在缓冲液中重构。可通过分光光度法或使用hplc追踪反应进程。

通过使用乙醇使酶变性并将含有thcan，n-二甲基甘氨酰酯的乙醇层蒸发至干燥而从反应混合物中分离产物thcan，n-二甲基甘氨酰酯。

式ii前药thcn，n-二甲基甘氨酰酯以两种方式获得：(1)通过加热thcan，n-二甲基甘氨酰酯的缓冲溶液进行脱羧，或(2)直接接触在酶变性后获得的thcan，n-二甲基甘氨酰酯的乙醇溶液。

使用生物反应器在商业规模上合成式ii前药，所述生物反应器包含与大麻素合酶接触的反应物cbgan，n-二甲基甘氨酰酯的缓冲溶液。通过去除等分试样的反应混合物用分光光度法监测反应进程。通过使反应混合物通过镍结合柱，将酶与产物thcan，n-二甲基甘氨酰酯分离。因为用于大规模合成前药的酶包含his标记，所以酶将与镍柱结合，而将产物和未反应的起始材料将保留在洗脱液中。

通过将期望的产物thcan，n-二甲基甘氨酰酯萃取到有机溶剂中或通过hplc进行纯化。通过使thcan，n-二甲基甘氨酰酯的溶液与热接触使thcan，n-二甲基甘氨酰酯脱羧。

2.式iii前药的合成

方案2和3分别举例说明了根据式iii的大麻素单酯和二酯前药的生物酶合成。用于将cbgan，n-二甲基甘氨酰酯或cbga双(n，n-二甲基甘氨酰)酯分别酶催化转化成相应的cbdn，n-二甲基甘氨酰酯和cbd双(n，n-二甲基甘氨酰)酯的方案与上述对于式ii前药的方案类似。

单酯前药可通过与如上所述的n，n-二甲基甘氨酰基羰基咪唑接触或通过化学领域中普通技术人员已知的任何偶联方案，经化学法转化成二酯前药。

方案2

方案3

使用类似于上述对于式ii前药的方法，在生物反应器中实现式iii前药的大规模合成。

d.前药的纯化

通过本文中所述的生物酶合成方案生产的大麻素前药通过数种分析方法纯化，包括hplc、尺寸排阻色谱和有机溶剂萃取。可将对应于期望的前药产物的级分合并并冻干至干燥。

e.使用方法

天然存在的大麻素四氢大麻酚(thc)作为用于治疗广泛医学病症的治疗剂正获得认可，所述医学病症包括青光眼、aids消瘦、神经性疼痛、多发性硬化相关的痉挛状态的治疗、纤维肌痛和化疗引起的恶心。thc在变态反应、炎症、感染、癫痫、抑郁、偏头痛、双相障碍、焦虑障碍、药物依赖和药物戒断综合症的治疗中也有效。

本发明提供了天然大麻素的前药作为用于治疗上述病症的治疗剂。例如，当配制用于肠胃外递送时，本发明的前药是用于减轻疼痛的候选治疗剂。这样的治疗是通过单独施用本发明前药的可药用制剂或与具有用于减轻疼痛的已知活性的另一种药剂组合施用来实现的。两种药剂可一起或分开施用，并且每种药剂的剂量由处方医师确定。

根据本发明的前药也是用于治疗炎症的候选治疗剂。例如，可施用本发明的前药以在患有类风湿性关节炎的对象中减轻关节的炎症及相关疼痛。本发明的前药可以以适合于这样治疗且由处方医师认为必要的剂量单独施用或与cox抑制剂联合施用(如果有必要的话)。