申请人：北京生命科学研究所
发明背景
自身免疫性疾病，亦称自身免疫性病症，其特征为免疫反应过度活跃或者错误地针对自体组织1。传统认为，自身免疫性疾病是t细胞和/或自身抗体介导的损害。根据近来的研究，t和b淋巴细胞以及先天免疫都在发病机理中起重要作用2。在分子水平上，t和b淋巴细胞的激活依赖于通过免疫受体，比如t-细胞抗原受体(tcr)和b-细胞抗原受体(bcr)进行的信号级联。这些免疫受体可以通过配体结合而激活，然后导致下游激酶靶点的活化。蛋白酪氨酸激酶(ptks)的复杂网络与重要通路相关。活化的ptks继而使受体相关跨膜衔接蛋白(receptor-associatedtransmembraneadaptors)胞质面中的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itams)磷酸化。通过一系列的翻译后修饰，比如磷酸化，启动下游效应物，如调节各种炎性细胞因子的基因表达的转录因子3,4。
蛋白激酶在b和t细胞的活化中起着重要作用。作为对胞外介质和环境变化的响应，蛋白激酶参与了控制t和b细胞活化、生长和分化的信号事件。一些小分子激酶抑制剂已经显示出具有治疗类风湿性关节炎、银屑病等疾病的潜力5-9。
在过度活跃的t淋巴细胞内，tcr介导的信号通路导致了炎性细胞因子，如刺激免疫反应的il-2和干扰素γ((ifn-γ)的上调。目前已确定，t细胞活化的关键启动事件为tcr-cd3复合物中基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)的磷酸化的增加，该磷酸化过程由src家族ptks完成。src家族由8种不同成员组成：src、lck、fyn、lyn、hck、fgr、blk和yes。其中，淋巴细胞特异性蛋白激酶(lck)和原癌基因酪氨酸蛋白激酶(fyn)在t细胞内表达，并且位于tcr介导的信号级联反应的起始阶段3,10,11。
lck主要在t细胞中表达，其在组成上与cd4和cd8表面受体的细胞质部分相关。在成熟外周t细胞中，lck使tcr磷酸化，并启动tcr链接的信号转导(tcr-linkedsignaltransduction)。lck还在胸腺细胞发育的所有阶段中表达，在发育t细胞的选择和成熟中起到关键作用10,11。
具体地，lck在tcr介导的信号通路的启动中起到使itam磷酸化的作用，这为syk家族激酶zap-70的串联sh2结构域提供了结合位点。一旦被募集，zap-70即被lck在其活化环的tyr493上磷酸化和活化12，这导致了zap-70的自磷酸化。活化的zap-70随后使接头蛋白，如lat磷酸化，该接头蛋白的作用是充当支架，以募集下游信号分子。这种级联以启动与细胞因子释放(尤其是il-2)相关的基因转录而告终，最后促进了t细胞的增殖13。干扰lck激酶活性可以产生强免疫抑制作用。例如，伊马替尼通过对lck的抑制作用减少了tcr诱导的增殖和活化14，口服给药选择性lck抑制剂a-770041(ic50＝147nm)可以抑制全血中由刀豆蛋白a刺激的il-2的生成，该作用的ec50约为80nm15。当剂量为10mg/kg/d时，a-770041显示出阻止异位移植心脏穿过主要组织相容性屏障的排异反应达至少65天15,16。通过靶向sh2结构域抑制lck的迷迭香酸(rosa)也显示出对t细胞活化和增殖的抑制作用17。当剂量为50mg/kg/d时，连续15天每日给予rosa可以抑制胶原诱导小鼠关节炎模型的滑膜炎18。甲酯衍生物(rosa-me)抑制il-2基因表达和t细胞增殖的作用远强于其对应物rosa。与rosa和mtx相比，口服给予小鼠50mg/kg/d剂量的rosa-me大大地减轻了炎症和关节炎指标19。
作为src家族的另一成员，fyn的功能与lck在启动tcr的酪氨酸磷酸化方面有部分重合。两种激酶都与tcr相互作用，并且增加了白细胞介素-2(il-2)的生成20,21。遗传学证据证明，fyn活化与tcr诱导的lck转位直接相关，提示fyn参与了t细胞的活化过程。然而，lck缺陷小鼠和fyn缺陷小鼠的研究均显示，这些激酶在发育过程中的作用有限22-24。lck缺陷t细胞系(jcam1)的研究证实，在特定酪氨酸残基上，tcr仍可以是磷酸化的，这促进了zap-70激酶的募集。相比之下，tcr的磷酸化模式发生了改变，并且zap-70的活化出现了缺陷。在此过程中，分子标记物cd69的表达水平升高，而nfat活化和白细胞介素-2的生成则显著减少。这些结果表明，fyn可以在无lck存在的情况下催化itam的磷酸化，但却无法在很大程度上补偿lck的缺失。此外，tcr信号转导的结果可以根据用src家族的哪种激酶成员来启动信号级联反应的选择来确定25。
在fyn和lck启动tcr信号通路的过程中，豆蔻酸化和棕榈酸化双重脂肪酰化过程很关键。2-溴棕榈酸可以有效阻断fyn的棕榈酰化。在jurkatt细胞中，2-溴棕榈酸阻断了内源性棕榈酰化fyn和lck在抗去垢剂膜的定位，继而抑制了tcr信号通路和t细胞活化26。此外，还发现不饱和脂肪酸(pufas)，尤其是n-3系列也可以抑制fyn的脂肪酰化26,27，在临床上用作免疫抑制剂。糖皮质激素(gc)是一种有效的免疫抑制剂，其可以迅速地抑制fyn和lck向t细胞受体复合物的募集。这些结果明确了lck和fyn激酶作为通过gc受体依赖性通路介导的gc的分子靶点28。同时抑制fyn和lck可以抑制自身免疫性疾病。
b细胞清除疗法(bcdt)的成功，如利妥昔单抗(mabthera/rituxan；biogenidec/genentech)在治疗类风湿性关节炎中的临床应用提示了b细胞在某些自身免疫性疾病中的重要作用29。tec家族激酶btk仅局限在b细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞中表达，在t细胞或自然杀伤(nk)细胞中则未发现其表达。btk是b细胞发育、活化、发出信号和存活的关键调节子。b细胞受体(bcr)参与后的b细胞活化尤其需要btk30。在bcr的刺激下，btk被上游的src家族激酶blk、lyn和fyn活化。活化的btk继而使磷脂酶cγ2(plcγ2)磷酸化和活化，plcγ2催化dag和ip3的生成，导致了下游信号分子，如转录因子nf-κb和nfat的刺激。btk功能性突变在小鼠引起了特征为血清ig水平下降的x连锁免疫缺陷(x-linkedimmunodeficiency，xid)31。btk功能性无义突变在人类导致了外周b细胞缺乏和血清免疫球蛋白(ig)水平极低的原发性免疫缺陷性疾病。
一些靶向btk中特定残基(cys481)的共价结合物，如伊布替尼(pci-32765)和avl-292在建立的cia小鼠模型中显示出了ic50低于0.5nm的高结合亲和力和口服有效性，这意味着对临床关节炎评分和抗胶原蛋白自身抗体生成的剂量依赖性抑制6。此外，在mrl-fas(lpr)狼疮模型中，pci-32765还抑制自身抗体生成和肾病发展6。另一种btk抑制剂rn486(ic50＝4.0nm)可以完全阻止nzb×nzw系统性红斑狼疮(sle)小鼠模型的疾病进展。rn486给药能显著抑制pca(i型过敏)或rpca(iii型过敏)小鼠模型的炎症反应。对于ra模型，rn486口服给药可以通过抑制关节及全身炎症来减少足肿胀和炎症标志物32。
除了上述参与tcr和bcr近端信号通路的激酶以外，累积研究还提示，p38mapk在数种免疫介导疾病，包括类风湿性关节炎(ra)、干燥综合征、系统性红斑狼疮(sle)、炎症性肠病(ibd)和银屑病的发病机理中起重要作用。在tcr和bcr信号通路中，mapk级联由vav激活。作为下游效应子，rac1起到mapkk激酶(mapkkk)的作用，并位于p38mapk上游。p38mapk活化后，通过转录和转录后机制调节肿瘤坏死因子(tnf)α、干扰素(ifn)γ和其他细胞因子，如il-1、tl-6和il-17的表达33,34。抗体疗法的成功提示了细胞因子和p38mapk在自身免疫性疾病发展中的关键作用。一些小的p38抑制剂在临床前及早期临床研究中均表现出了有前途的反馈结果。然而，接下来的临床试验却大多数都失败了，原因或者是有效性差，或者是毒性严重。占据atp囊的p38mapk抑制剂vx-745在适应症为ra的ii期临床试验中尽管得到了有前途的试验结果，但却因为肝毒性而中止了试验35。在硫酸葡聚糖钠盐(dss)诱导的大肠炎模型中，sb203580处理通过减少体内促炎性细胞因子的mrna水平，改善了临床评分36。另外，一些高选择性非atp竞争性抑制剂，如vx-702、scio469、birb796也表现出对促炎性疾病标志物的短暂抑制作用，以及不能够完全控制疾病恶化或进展37。
临床试验中不可接受的毒性和低有效性提示p38mapk抑制剂给药可能不是抗炎治疗的最好解决方法。扩展研究提示p38mapk在调节除炎症之外的许多细胞过程中具有多方面作用。功能的多样性是产生高毒性和强抑制作用的原因。而且，存在的补偿机制看起来似乎进一步削弱了治疗的有效性。这些研究都强调了开发新的同时靶向更多病理机制相关性上游激酶的药剂的必要性。就有限的毒性和持续的临床反应而言，具有多靶向性质以及中度但却平衡的亲和力的抑制剂代表了更好的治疗选择。
发明概述
本发明提供了式i的化合物：
r1–r5各自独立地为h、卤素、羟基、甲基、三氟甲基或甲氧基，尤其是，其中r1和r5各自独立地为卤素、羟基、甲基、三氟甲基；以及
r6是任选被取代的cn环烃基，其中n＝3-18，并且包含最多n-1个各自独立地选自n、o、s和p的杂原子，尤其是，其中所述烃基选自环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；
或其立体异构体或药学上可接受的盐。
在特定实施方案中：
–n是3、4、5、6、8、9或10；或者n是3、5、6或9；
-r6是取代或未取代的5或6元同素环或杂环，或9或10元双环芳基；
-r6是任选被取代的：环丙基；选自吡咯、唑(例如，吡唑、咪唑、三唑、四唑、五唑、噁唑、异噁唑、噻唑或异噻唑)、呋喃、间二氧杂环戊烯噻吩、二硫杂环戊二烯或氧硫杂环戊二烯及其还原形式(例如，二氢呋喃，二氢咪唑)的5元芳基；优选为2-取代部分，如2-唑、2-吡咯、2-唑(例如，2-吡唑、2-咪唑、2-噁唑、2-异噁唑、2-噻唑或2-异噻唑)、2-呋喃、2-噻吩、2-氧杂环戊二烯、间二氧杂环戊烯或2-硫杂环戊二烯(2-噻吩)；选自苯基和吡啶的6元芳基；或者9元芳基是苯并咪唑；
-r6是苯基、3-取代苯基、3,4-取代苯基、3,4,5-取代苯基；
-r6的取代基选自：卤素、-or'、-oc(o)r'、-nr'r"、-sr'、-r'、-cn、-no2、-co2r'、-conr'r"、-c(o)r'、-oc(o)nr'r"、-nr"c(o)r'、-nr"co2r'、-nr'-c(o)nr"r'"、-nr'-so2nr"r'"、-nh-c(nh2)＝nh、-nr'c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr'、-s(o)r'、-so2r'、-so2nr'r"、-nr"so2r、-n3、-ch(ph)2、全氟代(c1-c4)烷氧基和全氟代(c1-c4)烷基，取代基的个数为0至芳环系统上的开放化合价的总数；其中r'、r"和r'"各自独立地选自氢、(c1-c8)烷基和杂烷基、未取代芳基和杂芳基、(未取代芳基)-(c1-c4)烷基和(未取代芳基)氧基-(c1-c4)烷基；
-r2-r4为h，并且r1和r5中至少有一个为卤素、羟基、甲基、三氟甲基或甲氧基；
-r2-r4为h，r1和r5是卤素、羟基、甲基、三氟甲基或甲氧基；
–其所有组合，如，其中：
r2-r4为h，r1和r5是卤素、羟基、甲基、三氟甲基或甲氧基；
r6是取代或未取代的5元或6元同素环或杂环，或9或10元双环芳基；以及
r6的取代基选自：卤素、-or'、-oc(o)r'、-nr'r"、-sr'、-r'、-cn、-no2、-co2r'、-conr'r"、-c(o)r'、-oc(o)nr'r"、-nr"c(o)r'、-nr"co2r'、-nr'-c(o)nr"r'"、-nr'-so2nr"r'"、-nh-c(nh2)＝nh、-nr'c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr'、-s(o)r'、-so2r'、-so2nr'r"、-nr"so2r、-n3、-ch(ph)2、全氟代(c1-c4)烷氧基和全氟代(c1-c4)烷基，取代基的个数为0至芳环系统上的开放化合价总数；其中r'、r"和r'"各自独立地选自氢、(c1-c8)烷基和杂烷基、未取代芳基和杂芳基、(未取代芳基)-(c1-c4)烷基和(未取代芳基)氧基-(c1-c4)烷基；和/或
-这些化合物在激酶活性分析试验中具有相当于ic50为10um或以下的lck或btk抑制活性。
代表性、示例性的化合物包括以下结构，或其立体异构体，或其药学上可接受的盐：
本发明提供了包含主题化合物的药物组合物。在一些方面，本发明提供了包含治疗有效量的单位剂量形式的主题化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些方面，本发明提供了组合物，该组合物包含治疗有效量的主题化合物和对自身免疫性和/或炎症性疾病或癌症具有治疗活性的不同治疗剂。
本发明还提供了制造和使用主题化合物的方法，包括抑制激酶活性的方法。在一些方面，本发明提供了治疗与非期望激酶活性相关疾病的方法，包括向需要其的人给予有效量的主题化合物或其前药，其中所述疾病为过敏性疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或癌症，其中所述方法可以进一步包括先行的诊断疾病或癌症的步骤，或者随后的检测疾病或癌症改善情况的步骤。
本发明包含了本发明所述特定实施方案的所有组合。
发明具体实施方案描述
以下以说明而不是限制的方式对特定实施方案和实施例进行了描述。本领域技术人员将会很容易地识别出多种非关键参数，变更或修饰这些参数可以产生基本相似的结果。本发明提供了无数实施方案。
本发明包含所有可能的组合，就像各自被明确列举似的；因此，本发明的方面和实施方案包括，例如，其中r1为取代或未取代苯基；r2为h、羟基、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，r3是h或甲基，并且r4是1-二甲基丙基的组合。
除非显示出不当或另有注解，在这些描述以及整个说明书中，不定冠词表示一个或多个，术语“或”表示和/或，多聚核苷酸序列应理解为包含反向链和本文所述其他替代骨架。此外，本说明书以简写方式描述种类，以列举该种类的所有成员，例如，简写为(c1-c3)烷基的叙述表示列举了所有c1-c3烷基：甲基、乙基和丙基，包括其异构体。
除非所应用的上下文中另有说明，以下单词、短语和符号通常意在表示下述含义。
本发明所用术语“杂原子”通常指的是除碳或氢以外的任何原子。优选杂原子包括氧(o)、磷(p)、硫(s)、氮(n)和卤素，优选杂原子官能团为卤代甲酰基、羟基、醛基、胺基、偶氮基、羧基、氰基、硫氰酰基(thiocyanyl)、羰基、卤素、氢过氧基(hydroperoxyl)、亚胺基、醛亚胺基、异腈基(isocyanide)、异氰酸基(iscyante)、硝酸基、腈基、亚硝酸基、硝基、亚硝基、磷酸基、膦酰基、硫、磺酰基、磺基和巯基。
除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分，表示完全饱和的，含有指定数量碳原子(即，c1-c8表示1-8个碳原子)的直链或支链，或环状烃基，或其组合。烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、同系物和异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。
术语“烯基”本身或作为另一取代基的一部分，表示单不饱和或多不饱和的，含有指定数量的碳原子(即，c2-c8表示2-8个碳原子)和一个或多个双键的直链或支链，或环状烃基，或其组合物。烯基的例子包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)及其高级同系物和异构体。
术语“炔基”本身或作为另一取代基的一部分，表示单不饱和或多不饱和的，含有指定数量的碳原子(即，c2-c8表示2-8个碳原子)和一个或多个三键的直链或支链烃基，或其组合。炔基的例子包括乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基及其高级同系物和异构体。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分，表示以-ch2-ch2-ch2-ch2-为例，由烷基衍生而来的二价基。通常，烷基(或亚烷)基具有1-24个碳原子，本发明优选具有10个或以下碳原子的基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是链较短的烷基或亚烷基，其通常具有8个或8个以下碳原子。
术语“烷氧基”、“烷胺基”和“烷硫基(alkylthio)”(或硫代烷氧基(thioalkoxy))以其常规意义使用，指的是那些烷基分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的剩余部分相连。
除非另有说明，术语“杂烷基”本身或与另一术语组合时，表示由所述数量的碳原子和1至3个选自o、n、p、si和s的杂原子组成的稳定的直链或支链，或环状烃基，或其组合，其中氮、硫和磷原子可以任选地被氧化，氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子o、n、p和s可以位于杂烷基内部的任何位置。杂原子si可以位于杂烷基的任何位置，包括烷基与分子剩余部分相连的位置。例子包括-ch2-ch2-o-ch3、-ch2-ch2-nh-ch3、-ch2-ch2-n(ch3)-ch3、-ch2-s-ch2-ch3、-ch2-ch2、-s(o)-ch3、-ch2-ch2-s(o)2-ch3、-ch＝ch-o-ch3、-si(ch3)3、-ch2-ch＝n-och3和-ch＝ch-n(ch3)2。多达2个杂原子可以是连续的，如，例如，-ch2-nh-och3和-ch2-o-si(ch3)3。
类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分，表示以-ch2-ch2-s-ch2-ch2-和-ch2-s-ch2-ch2-nh-ch2-为例，由杂烷基衍生而来的二价基。对于杂亚烷基而言，杂原子还可以占据链端之一或两个链端(例如，亚烷氧基(alkyleneoxy)、亚烷二氧基(alkylenedioxy)、亚烷氨基(alkyleneamino)、亚烷二氨基(alkylenediamino)等)。更进一步地，对于亚烷基和杂亚烷基的连接基团而言，并未暗示连接基团的取向。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合时，分别代表的是环状形式的“烷基”和“杂烷基”。因此，环烷基具有指定数量的碳原子(即，c3-c8表示3-8个碳)，还可以含有一个或两个双键。杂环烷基具有指定数量的碳原子和1-3个选自o、n、si和s的杂原子，其中氮和硫原子可以任选地被氧化，氮杂原子可以任选地被季铵化。此外，对于杂环烷基而言，杂原子可以占据杂环与分子剩余部分相连的位置。环烷基的例子包括环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的例子包括1-(1,2,5,6-四氢吡啶-基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有说明，术语“卤代”和“卤素”本身或作为另一取代基的一部分时，表示氟、氯、溴或碘原子。此外，术语如“卤代烷基”意在包括被1至(2m'+1)个可以相同或不同的卤素原子取代的烷基，其中m'是烷基中的碳原子总数。例如，术语“卤代(c1-c4)烷基”意在包括三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。因此，术语“卤代烷基”包括一卤代烷基(被一个卤素原子取代的烷基)和多卤代烷基(被2至(2m'+1)个卤素原子取代的烷基，其中m'是烷基中的碳原子总数)。除非另有说明，术语“全卤代烷基”表示被(2m'+1)个卤素原子取代的烷基，其中m'是烷基中的碳原子总数。例如术语“全卤代(c1-c4)烷基”意在包括三氟甲基、五氯乙基、1,1,1-三氟-2-溴-2-氯乙基等。
术语“酰基”指的是将有机酸去除酸的羟基部分后得到的那些基团。因此，酰基意指包括，例如，乙酰基、丙酰基、丁酰基、癸酰基、特戊酰基、苯甲酰基等。
除非另有说明，术语“芳基”的意思是多不饱和烃类取代基，通常为芳香烃类取代基，其可以是单环，或是稠合在一起的或以共价键连接的多环(多至3个环)。芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基和1,2,3,4-四氢萘。
术语“杂芳基”指的是含有0-4个选自n、o和s的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选地被氧化，氮杂原子任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子与分子的剩余部分连接。杂芳基的非限制性例子包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。
为简洁起见，术语“芳基”与其他术语组合使用时(例如，芳氧基、芳硫基(arylthioxy)、芳烷基)，包括上述芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”意指包括芳基与烷基相连的那些基团(例如，苯基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(例如，亚甲基)被例如，氧原子替代的那些烷基(例如，苯氧甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
上述各个术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)均意味着包括所述基团的取代和未取代形式。下文提供了每种类型的基团的优选取代基。
烷基和杂烷基(以及被称作亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是多种多样基团，选自：-or'、＝o、＝nr'、＝n-or'、-nr'r"、-sr'、卤素、-sir'r"r'"、-oc(o)r'、-c(o)r'、-co2r'、-conr'r"、-oc(o)nr'r"、-nr"c(o)r'、-nr'-c(o)nr"r'"、-nr'-so2nr'"、-nr"co2r'、-nh-c(nh2)＝nh、-nr'c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr'、-s(o)r'、-so2r'、-so2nr'r"、-nr"so2r、-cn和-no2，取代基的个数为0-3个，具有0、1或2个取代基的那些基团是尤其优选的。r'、r"和r'"各自独立地指氢、未取代(c1-c8)烷基和杂烷基、未取代芳基、被1-3个卤素取代的芳基、未取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基-(c1-c4)烷基。当r'和r"与同一氮原子相连时，其可以与氮原子结合形成5、6或7元环。例如，-nr'r"意指包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。通常，烷基或杂烷基具有0-3个取代基，具有2个或以下取代基的那些基团是本发明优选的。更优选的是，烷基或杂烷基是未取代或单取代的。最优选的是，烷基或杂烷基未被取代。从上述关于取代基的讨论中，本领域技术人员将理解到，术语“烷基”意指包括如三卤代烷基(例如，-cf3和-ch2cf3)的基团。
烷基和杂烷基的优选取代基选自：-or'、＝o、-nr'r"、-sr'、卤素、-sir'r"r'"、-oc(o)r'、-c(o)r'、-co2r'、-conr'r"、-oc(o)nr'r"、-nr"c(o)r'、-nr"co2r'、-nr'-so2nr"r'"、-s(o)r'、-so2r'、-so2nr'r"、-nr"so2r、-cn和-no2，其中r'和r"的定义如上。进一步优选的取代基选自：-or'、＝o、-nr'r"、卤素、-oc(o)r'、-co2r'、-conr'r"、-oc(o)nr'r"、-nr"c(o)r'、-nr"co2r'、-nr'-so2nr"r'"、-so2r'、-so2nr'r"、-nr"so2r、-cn和-no2。
类似地，芳基和杂芳基的取代基也是各种各样的，其选自：卤素、-or'、-oc(o)r',-nr'r",-sr'、-r'、-cn、-no2、-co2r'、-conr'r"、-c(o)r'、-oc(o)nr'r"、-nr"c(o)r'、-nr"co2r'、-nr'-c(o)nr"r'"、-nr'-so2nr"r'"、-nh-c(nh2)＝nh、-nr'c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr'、-s(o)r'、-so2r'、-so2nr'r"、-nr"so2r、-n3、-ch(ph)2、全氟代(c1-c4)烷氧基和全氟代(c1-c4)烷基，取代基的个数为0到芳香环系统的开放化合价(openvalences)的总数；其中r'、r"和r'"各自独立地选自氢、(c1-c8)烷基和杂烷基、未取代芳基和杂芳基、(未取代芳基)-(c1-c4)烷基和(未取代芳基)氧基-(c1-c4)烷基。当芳基为1,2,3,4-四氢萘时，其可以被取代或未取代的(c3-c7)螺环烷基取代。(c3-c7)螺环烷基可以如本发明所定义的“环烷基”那样以同样的方式被取代。通常，芳基或杂芳基具有0-3个取代基，具有2个或以下取代基的那些基团是本发明优选的。在本发明的一个实施方案中，芳基或杂芳基是未取代或单取代的。在另一实施方案中，芳基或杂芳基未被取代。
芳基和杂芳基的优选取代基选自：卤素、-or'、-oc(o)r'、-nr'r"、-sr'、-r'、-cn、-no2、-co2r'、-conr'r"、-c(o)r'、-oc(o)nr'r"、-nr"c(o)r'、-s(o)r'、-so2r'、-so2nr'r"、-nr"so2r、-n3、-ch(ph)2、全氟代(c1-c4)烷氧基和全氟代(c1-c4)烷基，其中r'和r"的定义如上。进一步优选的取代基选自：卤素、-or'、-oc(o)r'、-nr'r"、-r'、-cn、-no2、-co2r'、-conr'r"、-nr"c(o)r'、-so2r'、-so2nr'r"、-nr"so2r、全氟代(c1-c4)烷氧基和全氟代(c1-c4)烷基。
本发明所用的取代基-co2h包括其生物电子等排置换；参见，例如，thepracticeofmedicinalchemistry；wermuth,c.g.,ed.；academicpress:newyork,1996；p.203。
在芳环或杂芳环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-t-c(o)-(ch2)q-u-的取代基置换，其中t和u各自独立地为-nh-、-o-、-ch2-或单键，q是0到2的整数。或者，在芳环或杂芳环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-a-(ch2)r-b-的取代基置换，其中a和b各自独立地为-ch2-、-o-、-nh-、-s-、-s(o)-、-s(o)2-、-s(o)2nr'-或单键，r是1到3的整数。这样形成的新环的一个单键可以任选地被双键替代。或者，在芳环或杂芳环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-(ch2)s-x-(ch2)t-的取代基置换，其中s和t各自独立地为0到3的整数，x是-o-、-nr'-、-s-、-s(o)-、-s(o)2-或-s(o)2nr'-。-nr'-和-s(o)2nr'-中的取代基r'选自氢或未取代(c1-c6)烷基。
本发明公开了优选取代基，并在表格、结构、实施例和权利要求书中对优选取代基进行了举例说明，优选取代基可以交叉应用于本发明的不同化合物，即，任何指定化合物的取代基都可以与其他化合物组合使用。
在特定实施方案中，适用的取代基各自独立地为取代或未取代的杂原子、取代或未取代的含0-3个杂原子的c1-c6烷基、取代或未取代的含0-3个杂原子的c2-c6烯基、取代或未取代的含0-3个杂原子的c2-c6炔基或取代或未取代的含0-3个杂原子的c6-c14芳基，其中各个杂原子独立地为氧、磷、硫或氮。
在更具体的实施方案中，适用的取代基各自独立地为醛基、醛亚胺基、烷酰氧基、烷氧基、烷氧基羰基、烷氧基、烷基、胺基、偶氮基、卤素、氨甲酰基、羰基、甲酰胺基、羧基、氰基、酯基、卤素、卤代甲酰基、氢过氧基(hydroperoxyl)、羟基、亚胺基、异腈基(isocyanide)、异氰酸基(iscyante)、n-叔丁氧羰基、硝酸基、腈基、亚硝酸基、硝基、亚硝基、磷酸基、膦酰基、硫化物(sulfide)、磺酰基、磺基、巯基、硫醇基(thiol)、硫氰基、三氟甲基或三氟甲氧基(trifluromethylether，ocf3)。
术语“药学上可接受的盐”意在包括根据本发明所述化合物的特定取代基，用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，可以通过将中性形式的该化合物与足量的纯的或在适当惰性溶剂中的预期碱接触来获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的例子包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机胺盐或镁盐，或类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能团时，可以通过将中性形式的该化合物与足量的纯的或在适当惰性溶剂中的预期酸接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的例子包括由无机酸，如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸(monohydrogencarbonic)、磷酸、一氢磷酸(monohydrogenphosphoric)、二氢磷酸(dihydrogenphosphoric)、硫酸、一氢硫酸(monohydrogensulfuric)、氢碘酸或亚磷酸等衍生而来的盐，以及由相对无毒的有机酸，如乙酸、丙酸、异丁酸、草酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等衍生而来的盐。还包括氨基酸，如精氨酸等的盐，以及有机酸，如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸(galactunoricacids)等的盐。本发明的某些具体化合物同时含有碱性和酸性官能团，这使得这些化合物可以转化为碱或酸加成盐。
中性形式的化合物可以通过以下方法再生：先使盐与碱或酸接触，然后以常规方法分离出母体化合物。母体形式的化合物与各种盐形式的化合物在某些物理性质，如在极性溶剂中的溶解度方面有所不同，然而在其他方面，对于本发明的目的而言，这些盐却等同于母体形式的化合物。
除了盐形式以外，本发明还提供了前药形式的化合物。本发明所述化合物的前药是在生理条件下经历化学变化后提供本发明的化合物的那些化合物。此外，在体外环境中，前药可以通过化学或生物化学方法转化为本发明的化合物。例如，与适当的酶或化学试剂一起放置于透皮贴剂的储库中时，前药可以缓慢地转化为本发明的化合物。前药通常是有用的，因为在一些情况下，前药可以比母体药物更容易给药。例如，口服给药时，前药可以具有比母体药物更高的生物利用度。前药还可以具有比母体药物更高的在药理组合物中的溶解度。多种多样的前药衍生物是本领域已知的，如依赖于前药的水解裂解或氧化活化的那些。前药的非限制性例子是以酯(“前药”)给药，然后水解代谢为活性实体羧酸的本发明的化合物。其他例子包括本发明的化合物的肽基衍生物。
本发明的某些化合物可以非溶剂化形式和溶剂化形式，包括水合形式存在。一般而言，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，其被包含在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以多晶或无定形的形式存在。通常，对于本发明所涵盖的用途而言，所有物理形式都是等同的，都包含在本发明的范围内。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单独的异构体个体都包含在本发明的范围内。
非对映异构体混合物可以根据理化性质上的差异，通过本领域技术人员所熟知的方法，如色谱法和/或分离结晶法分离出非对映异构体个体。对映异构体可以通过以下方法分离：先使对映异构体混合物与适当的光学活性化合物(例如，手性助剂，如手性醇或mosher酸氯化物(mosher'sacidchloride))反应，将其转化为非对映异构体混合物，然后分离出非对映异构体，再将各个非对映异构体转化(例如，水解)为相应的纯对映异构体。对映异构体还可以用手性hplc柱分离。
单个立体异构体，例如，基本上纯的对映异构体可以通过采用如用光学活性拆分剂形成非对映异构体的方法，拆分外消旋混合物来获得(eliel,e.和wilen,s.stereochemistryoforganiccompounds.newyork:johnwiley&sons,inc.,1994；lochmuller,c.h.,etal."chromatographicresolutionofenantiomers:selectivereview."j.chromatogr.,113(3)(1975):pp.283-302)。本发明的手性化合物的外消旋混合物可以通过任何适宜的方法分离和离析，包括：(1)与手性化合物形成非对映异构体离子盐，然后通过分离结晶或其他方法分离，(2)与手性衍生试剂形成非对映异构体化合物，将非对映异构体分离，再转化为纯的立体异构体，以及(3)直接在手性条件下分离基本上纯或富集的立体异构体。参见：wainer,irvingw.,ed.drugstereochemistry:analyticalmethodsandpharmacology.newyork:marceldekker,inc.,1993。
本发明的化合物还可以在构成这些化合物的一个或多个原子上含有非天然同位素原子部分。例如，化合物可以用放射性同位素，如，例如氚(3h)、碘125(125i)或碳14(14c)进行放射性标记。本发明的化合物的所有同位素变体不管是否具有放射活性，都包含在本发明的范围内。
术语“治疗有效量”指的是由研究者、兽医、医生或其他临床医师探索得出的将在某种显著程度上引起组织、全身、动物或人类的生物或医学反应的主题化合物的量，如，给药后足以在某种程度上阻止被治疗疾病或病症的一种或多种症状的发展或减轻被治疗疾病或病症的一种或多种症状的量。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重度，以及待治疗哺乳动物的年龄、体重等的不同而发生变化。
本发明还提供包括主题化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，尤其是包括单位剂量的主题化合物的这些组合物，尤其是与描述组合物治疗适用疾病或病症的用途(本发明)的说明书一起包装的这些组合物。
用来给药的组合物可以采用散装液体溶液或混悬液，或散装粉末的形式。然而，更为常见的是，组合物以单位剂量形式呈现，以方便精确给药。术语“单位剂量形式”指的是物理上离散的，适合作为用于人类受试者或其他哺乳动物的单一剂量的单位，每个单位均含有经计算能产生预期治疗效应的预定量的活性物质，以及适当的药用赋形剂。代表性的单位剂量形式包括液体组合物的预填充、预定量安瓿或注射器，或固体组合物的丸剂、片剂、胶囊剂、糖锭剂(losenges)等。在这些组合物中，化合物常常为微量成分(以重量计约0.1％至约50％，或优选以重量计约1％至约40％)，剩余部分为各种介质或载体及有助于形成预期给药形式的加工助剂。
适当的赋形剂或载体，以及制备可给药组合物的方法是本领域技术人员所公知或显而易见的，在出版物如remington'spharmaceuticalscience,mackpublishingco,nj(1991)中对此有更详细的描述。此外，化合物还可以有利地与本发明所述的，或本领域所公知的其他治疗剂，尤其是其他抗自身免疫剂共同使用。因此，组合物可以单独、联合或组合在单一剂量单位中给药。
给药量取决于化合物的制剂、给药途径等，其通常是在常规试验中根据实际经验确定的，并且有必要根据给药目标、宿主和途径等的不同而发生改变。通常，单位剂量制剂中的活性化合物的量可以根据特定应用在约1、3、10或30至约30、100、300或1000mg内变化或调整。在一特定实施方案中，单位剂量形式用适合于顺序使用的合装包进行包装，如，包括了含至少6、9或12个单位剂量形式的泡罩板的泡罩包装。实际使用剂量可以根据患者的需求和被治疗病症的严重度的不同而改变。特定情形下的正确剂量的确定在本领域技术范围内。通常，治疗的初始剂量是较小剂量，小于化合物的最优剂量。之后，逐步少量地增加剂量，直至达到这种情况下的最佳效应。为方便起见，如果需要，可以将每日的总剂量分开成数份后于一天内给药。
化合物可以通过各种方法给药，包括但不限于肠胃外、表面、口服或局部给药，如通过气溶胶或以透皮方式给药，用于预防性和/或治疗性处理。并且，治疗方案(例如，给药剂量和次数)也可以按照熟练临床医生的认知，基于所观察到的给药治疗剂对患者的效果，以及所观察到的疾病对给药治疗剂的响应情况的不同而进行变更。
为治疗患者，在有效治疗方案的过程中，本发明的治疗剂可以治疗上有效的剂量和量给药。尽管最优剂量对于每个化合物而言都是化合物特异性的，其通常根据实际经验来确定，然而，对于更有效的化合物，每公斤患者微克(μg)的量已经足够，例如，在约1、10或100ug/kg至约0.01、0.1、1、10或100mg/kg患者体重的范围内。
一般而言，临床试验中的常规实验将确定每个治疗剂、每个给药方案的最优治疗效应的具体范围，对具体患者的给药也会根据患者的状况和对初始给药的反应而调整到有效且安全的范围内。然而，最终给药方案将根据参与试验的临床医生基于因素，如患者的年龄、状况和大小，以及化合物效价、被治疗疾病的严重度而做出的判断进行调整。例如，化合物的给药方案可以是分2至4次(优选2次)口服给予10mg至2000mg/天，优选10至1000mg/天，更优选50至600mg/天。也可以采用间歇疗法(例如，每三周中的一周，或每四周中的三周进行治疗)。
本发明为t细胞和b细胞介导的自身免疫性疾病和癌症提供了新的解决方法。某些自身免疫性疾病，如炎症性疾病(例如，炎性肠病、类风湿性关节炎、肾小球肾炎和肺纤维化、银屑病、皮肤过敏反应、动脉粥样硬化、再狭窄、过敏性哮喘、多发性硬化病和1型糖尿病)与t细胞活化不当有关(j.h.hankeetal.,inflamm.res.,1995,357)。此外，移植器官的急性排异反应以及异基因骨髓和干细胞移植后的移植物抗宿主病(gvhd)也可以解释为t细胞活化不当的结果。b淋巴细胞活化失当是许多自身免疫性疾病的标志，如桥本甲状腺炎、自身免疫性溶血性贫血、引起恶性贫血的自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性睾丸炎、goodpasture病、包括特发性血小板减少性紫癜的自身免疫性血小板减少，交感性眼炎、重症肌无力、graves病、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎、溃疡性大肠炎和膜性肾病，那些被指明与系统性自身免疫性病症相关的疾病，例如系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、干燥综合征、reiter综合征、多发性肌炎与皮肌炎、系统性硬化病、结节性多动脉炎、多发性硬化病和大疱性类天疱疮。本发明还可以用来治疗基于b细胞(体液)或基于t细胞的其他自身免疫性疾病，包括cogan综合征、强直性脊柱炎、wegener肉芽肿病、自身免疫性脱发、i型或幼发型糖尿病和甲状腺炎。t细胞和b细胞功能失调在其中起重要作用的其他疾病是恶性肿瘤，如消化道/胃肠道癌、结肠癌、肝癌、皮肤癌，包括肥大细胞瘤和鳞状细胞癌、乳腺癌(breastandmammarycancer)、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤和白血病(包括但不限于急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、非霍奇金(nhl)b细胞淋巴瘤(例如，前体b-all、边缘区b细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、burkitt淋巴瘤、纵膈大b细胞淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤、自然杀伤和t细胞淋巴瘤；骨髓瘤(包括多发性骨髓瘤)、骨髓增殖性病症、肾癌、肺癌、肌肉癌、骨癌、膀胱癌、脑癌、黑色素瘤(包括口腔黑色素瘤和转移性黑色素瘤)、kaposi肉瘤、增殖型糖尿病视网膜病变和血管生成相关病症(包括实体瘤)和胰腺癌[limetal,haematologica,95(2010)pp135-143]。我们通过聚焦于一批与上述适应症相关的已有明确定论并且具有高度相关性的激酶靶点，包括但不限于lck、fyn、btk、p38mapk，提供了一系列多靶向小分子激酶抑制剂。
应该理解的是，本发明所述实施例和实施方案仅出于说明性的目的，根据其进行的各种修饰或改变将暗示给本领域技术人员，并且将包含在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围内。为了所有目的，本发明所引用的所有出版物、专利和专利申请，包括其中的引文，都以其全文并入本发明作为参考。
实施例
试剂和化学品
用于蛋白质纯化的色谱柱：ni-nta-琼脂糖,monoqhp色谱柱和superdex75购自gehealthcare。用于结晶的试剂获自hamptonresearch。编码人丝裂原活化蛋白激酶14(hmapk14)和人丝裂原活化蛋白激酶激酶6(mkk6)的dna序列购自openbiosystems。除非另有说明，所有反应都在惰性氮气或氩气中进行。dmf、dmso(99.9％，极干燥)按收到时那样直接使用。除非另有说明，其他所有试剂都从市场购买，并且按收到时的那样直接使用。nmr光谱用bruker光谱仪记录。1h(400mhz)和nmr化学位移以相对于tms内标(δ＝0.00ppm)或残余质子化溶剂(protiatedsolvent)的值报告。数据按以下方式呈现：化学位移(ppm)，多重性(s＝单重峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，sept＝七重峰，m＝多重峰，br＝宽峰)，耦合常数j(hz)和积分。
合成：
i)氨基胍硝酸盐，naoh，h2o，回流；
ii)a)2-氯-6-氟苯甲醛，甲苯，回流；b)nabh3cn，乙酸，室温。
步骤1：3-(呋喃-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1)的合成：
将氨基胍硝酸盐(22.0g,160.5mmol)在乙腈(200ml)中的悬浮液冷却至0℃，分次加入naoh(20.0g,500.0mmol)，所得混合物在室温下搅拌3h。然后，在0℃逐滴加入2-呋喃甲酰氯(20.0g,153.2mmol)。加料完成后，所得混合物在室温下搅拌6h。接着再通过旋转蒸发去除溶剂，所得残留物溶解在水(200ml)中，并加热回流5h。减压去除溶剂，得到的粗品经柱层析纯化(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)，得到为白色固体的3-(呋喃-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1)(8.5g，收率37％)。质谱(esi)m/zc6h6n4o[m+h]+计算值151.05，实测值151.10。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ(ppm)12.07(s,1h),7.68(s,1h),6.71-6.61(m,1h),6.54(s,1h),6.08(s,2h)。
步骤2：n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(呋喃-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(a)的合成：
将3-(呋喃-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1)(8.5g,56.6mmol)与2-氯-6-氟苯甲醛(17g,107.2mmol)在无水甲苯(100ml)中的混合物加热回流8h。冷却至室温后，加入nabh3cn(5.0g,79.6mmol)和乙酸(20ml)。然后，所得混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物用水(10ml)淬灭，再减压去除溶剂。残留物通过反向快速柱层析(c18)纯化，得到为白色固体的n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(呋喃-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(a)(3.2g，收率19.3％)。质谱(esi)m/zc13h10clfn4o[m+h]+计算值293.05，295.05，实测值293.2，295.3。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ12.22(s,1h),7.70(s,1h),7.37(dd,j＝20.6,7.3hz,2h),7.24(t,j＝8.7hz,1h),6.94(s,1h),6.73(s,1h),6.55(s,1h),4.50(s,2h)。
步骤2：n-(2-氯-6-甲基苯甲基)-3-(呋喃-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(b)的合成：
将3-(呋喃-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1)(50mg,0.33mmol)与2-氯-6-甲基苯甲醛(97.3mg,0.63mmol)在无水甲苯(5ml)中的混合物加热回流8h。冷却至室温后，加入nabh3cn(29.5mg,0.47mmol)和乙酸(0.5ml)。然后，所得混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物用水(1ml)淬灭，再减压去除溶剂。残留物通过反向快速柱层析(c18)纯化，得到作为白色固体的n-(2-氯-6-甲基苯甲基)-3-(呋喃-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(b)(12mg，收率12.3％)。质谱(esi)m/zc14h13clfn4o[m+h]+计算值289.08，291.07，实测值289.40,291.40。1hnmr(400mhz,d6-dmso/甲醇)δ12.17(s,1h),7.70(s,1h),7.31(d,j＝7.5hz,1h),7.22(dd,j＝17.4,7.1hz,2h),6.82(s,1h),6.73(s,1h),6.56(s,1h),4.48(d,j＝4.9hz,2h),2.44(s,3h)。
步骤1：3-(5-氨基-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯酚(中间体1)的合成：
氨基胍硝酸盐(5.46g,39.82mmol)与k2co3(5.5g,39.82mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(50ml)中的悬浮液在室温下搅拌1h。3-羟基苯甲酸(5.0g,36.2mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(30ml)中的溶液在0℃用n,n'-羰基二咪唑(cdi)(6.46g,39.82mmol)处理。之后，所得溶液在室温下搅拌1h。然后，将该溶液逐滴加入到悬浮液中。加料完成后，反应混合物在室温下搅拌3h。再将混合物加热至100℃并保持5h。冷却至室温后，过滤，减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为白色固体的3-(5-氨基-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯酚(1)(2.67g，收率41.9％)。质谱(esi)m/zc8h8n4o[m-h]-计算值175.07，实测值175.10。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ12.06(s,1h),9.47(s,1h),7.36-7.29(m,2h),7.17(t,j＝8.0hz,1h),6.77-6.67(m,1h),6.00(s,2h)。
步骤2：3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯酚的合成：
将3-(5-氨基-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯酚(1)(5.0g,28.38mmol)、2-氯-6-氟苯甲醛(5.0g,31.53mmol)与对甲苯磺酸(500mg,2.90mmol)在异丙醇(50ml)中的混合物加热回流过夜。将溶液冷却至室温，再加入nabh3cn(4.0g,63.65mmol)和乙酸(2ml)。然后，所得混合物在室温下搅拌10h，用水淬灭。减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为白色固体的3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯酚(1.2g，收率13.3％)，并回收化合物31(1.8g)。质谱(esi)m/zc15h12clfn4o[m+h]+计算值319.07，321.07，实测值319.40，321.20。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ12.15(s,1h),9.43(s,1h),7.35(s,4h),7.13-7.27(m,2h),6.90(s,1h),6.75(s,1h),4.51(s,2h)。
(i)a)氨基胍硝酸盐，naoh，dmf，0℃；b)cdi，dmf，0℃至室温；c)h2o，回流；
(ii)a)2-氯-6-氟苯甲醛，甲苯，回流；b)nabh3cn，乙酸，室温；
(iii)bbr3，环己烯，dcm，0℃。
步骤1：3-(3,5-二甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)的合成：
将氨基胍硝酸盐(824.7mg,6.02mmol)与naoh(240.6mg,6.02mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(10ml)中的悬浮液冷却至0℃。3,5-二甲氧基苯甲酸(1.0g,5.49mmol)和n,n-二异丙基乙胺(dipea)(780mg,6.03mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(10ml)中的溶液在0℃用n,n'-羰基二咪唑(cdi)(890mg,5.49mmol)处理。之后，将所得溶液室温搅拌3h。然后，将此溶液逐滴加入到悬浮液中。加料完成后，所得反应混合物在室温下搅拌3h。再通过旋转蒸发去除溶剂，将所得残留物溶解于水(70ml)中，并加热回流18h。冷却至室温后，过滤，所得固体用甲醇重结晶，得到为米白色固体的3-(3,5-二甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)(260mg，收率21.5％)。质谱(esi)m/zc10h12n4o2[m+h]+计算值221.10，实测值221.40。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ12.08(s,1h),7.05(dd,j＝10.8,2.3hz,2h),6.46(s,1h),6.08(s,2h),3.71(s,6h)。
步骤2：n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(3,5-二甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(12)的合成：
将3-(3,5-二甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)(50mg,0.23mmol)与2-氯-6-氟苯甲醛(36mg,0.23mmol)在无水甲苯(10ml)/dmso(0.1ml)中的混合物加热回流3h。使溶液冷却至室温，加入nabh3cn(42.8mg,0.68mmol)和乙酸(1ml)。然后，所得混合物室温搅拌10h，用水淬灭。减压去除溶剂。残留物用水(25ml)洗涤，所得固体用乙酸乙酯/石油醚溶液重结晶，得到为白色固体的n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(3,5-二甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(12)(30mg，收率36.4％)。质谱(esi)m/zc17h16clfn4o2[m+h]+计算值363.09，365.09，实测值363.20，365.20。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ7.97(s,1h),7.51(d,j＝8.0hz,1h),7.41(t,j＝8.0hz,1h),7.31(d,j＝8.2hz,1h),7.12(s,2h),6.57(s,1h),4.67(s,2h),3.80(s,6h)。
步骤3：5-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(9)的合成：
将化合物12(18mg,0.05mmol)与环己烯(2ml)在二氯甲烷(dcm)(10ml)中的混合物冷却至0℃。向混合物中逐滴加入bbr3(220mg,0.88mmol)在二氯甲烷(dcm)(1ml)中的溶液。加料完成后，所得反应混合物在0℃搅拌18h。然后通过旋转蒸发去除溶剂，残留物经反相hplc(c18)纯化，得到为白色固体的5-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(9)(3mg，收率18.1％)。质谱(esi)m/zc15h12clfn4o2[m+h]+计算值335.06，337.06，实测值335.05，337.10。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.32(dt,j＝11.3,8.1hz,2h),7.12(t,j＝8.6hz,1h),6.85(s,2h),6.32(s,1h),4.64(s,2h)。
(i)a)氨基胍硝酸盐，naoh，甲醇，0℃；b)cdi，dmf，0℃至室温；c)h2o，
回流；
(ii)a)2-氯-6-氟苯甲醛，甲苯，回流；b)nabh3cn，乙酸，室温。
步骤1：3-(3,4-二甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)的合成：
将氨基胍硝酸盐(13.55g,98.83mmol)和naoh(240.6mg,6.02mmol)在甲醇(100ml)中的悬浮液室温搅拌3h，蒸发去除溶剂，残留物用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(100ml)重新溶解。将3,4-二甲氧基苯甲酸(15.0g,82.34mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(150ml)中的溶液在0℃用n,n'-羰基二咪唑(cdi)(14.69g,90.59mmol)处理。之后，将溶液室温搅拌3h。然后将溶液逐滴加入到悬浮液中。加料完成后，反应混合物在室温搅拌3h。然后，通过旋转蒸发去除溶剂；将残留物溶解在水(150ml)中，并加热回流18h。冷却至室温后，过滤，所得固体用甲醇重结晶，得到为米白色固体的3-(3,4-二甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)(9.38g，收率51.7％)。质谱(esi)m/zc10h12n4o2[m+h]+计算值221.10，实测值221.40。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ11.95(s,1h),7.46–7.39(m,2h),6.98(d,j＝8.8hz,1h),5.93(s,2h),3.77(d,j＝3.4hz,6h)。
步骤2：n-(2-氯-6-氟苯基)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(11)的合成：
将3-(3,4-二甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)(8g,36.33mmol)、2-氯-6-氟苯甲醛(8g,50.46mmol)和对甲苯磺酸(625.5mg,3.63mmol)在异丙醇(40ml)中的混合物加热回流过夜。使溶液冷却至室温后，加入nabh3cn(5.0g,79.56mmol)和乙酸(1ml)。然后，所得混合物室温搅拌5h，再用水淬灭。减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)纯化，得到为白色固体的n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(11)(4.5g，收率34.1％)。质谱(esi)m/zc17h16clfn4o2[m+h]+计算值363.09，365.09，实测值363.40，365.40.1hnmr(400mhz,d6-dmso，旋转异构体2:1混合物)δ13.13(s,0.5h),12.06(s,1h),7.50-7.41(m,3h),7.40-7.29(m,3h),7.28–7.15(m,2h),7.05(d,j＝8.2hz,0.5h),6.98(d,j＝8.8hz,1h),6.87(t,j＝5.4hz,1h),6.12(t,j＝6hz,0.5h),4.53(d,j＝4.9hz,2h),4.45(d,j＝5.2hz,1h),3.78(d,j＝6.9hz,9h)。
步骤1：3-(3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)的合成：
将氨基胍硝酸盐(2.58g,18.82mmol)和naoh(789.79mg,19.75mmol)在甲醇(30ml)中的悬浮液室温搅拌3h，蒸发掉溶剂，残留物用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(30ml)重新溶解。3-硝基苯甲酸(3.0g,17.95mmol)和n,n-二异丙基乙胺(dipea)(2.55g,19.73mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(30ml)中的溶液在0℃用n,n'-羰基二咪唑(cdi)(3.2g,19.73mmol)处理。将所得溶液室温搅拌3h。然后将溶液逐滴加入到悬浮液中。加料完成后，反应混合物在室温搅拌3h。通过旋转蒸发去除溶剂，将残留物溶解在水(100ml)中，并加热回流18h。冷却至室温后，过滤，所得固体用甲醇重结晶，得到为黄色固体的3-(3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1)(3.0g，收率81.5％)。质谱(esi)m/zc8h7n5o2[m+h]+计算值206.06，实测值206.20。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ12.38(s,1h),8.65–8.60(m,1h),8.28(d,j＝7.8hz,1h),8.22–8.16(m,1h),7.71(t,j＝8.0hz,1h),6.22(s,2h)。
步骤2：n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(13)的合成：
将3-(3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1)(300mg,1.46mmol)和2-氯-6-氟苯甲醛(300mg,1.89mmol)在无水甲苯(10ml)/dmso(0.1ml)中的混合物加热回流15h。使溶液冷却至室温后，加入nabh3cn(200mg,3.18mmol)和乙酸(1ml)。然后，所得混合物室温搅拌3h，再用水淬灭。减压去除溶剂，残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)纯化，得到为淡黄色固体的n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(2a)(150mg，收率29.5％)。质谱(esi)m/zc15h11clfn5o2[m+h]+计算值348.06，350.06，实测值348.10，350.10。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.82(s,1h),8.34(d,j＝7.8hz,1h),8.29–8.22(m,1h),7.69(t,j＝8.0hz,1h),7.40–7.27(m,2h),7.14(t,j＝8.8hz,1h),4.70(s,2h)。
步骤3：3-(3-氨基苯基)-n-(2-氯-6-氟苯甲基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(16)的合成：
将n-(2-氯-6-氟苯基)-3-(3-硝基苯甲基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(2a)(50mg,0.14mmol)和水合肼(0.5ml,80％水溶液)在乙醇(10ml)中的混合物加热至60℃。然后加入raney-ni(10mg)。所得混合物在此温度下搅拌3h。冷却至室温后，过滤，减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)纯化，得到为白色固体的3-(3-氨基苯基)-n-(2-氯-6-氟苯甲基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(3a)(36mg，收率78.8％)。质谱(esi)m/zc15h13clfn5[m+h]+计算值318.08，320.08，实测值318.10，320.10。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.33(ddd,j＝19.0,9.5,6.9hz,2h),7.27–7.19(m,2h),7.19–7.08(m,2h),6.78(d,j＝7.8hz,1h),4.64(s,2h)。
n-(2-氯-6-甲基苯甲基)-3-(3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(15)的合成
向搅拌的3-(3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1)(100mg,0.49mmol)和2-氯-6-甲基苯甲醛(150.69mg,0.97mmol)在无水甲苯(6ml)/乙醇(0.5ml)中的混合物加热回流15h。冷却至室温后，在0℃加入nabh3cn(100mg,1.59mmol)和乙酸(1ml)。然后，所得混合物在室温下搅拌3h。减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)纯化，得到为淡黄色固体的n-(2-氯-6-甲基苯甲基)-3-(3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(2b)(34mg，收率20.3％)，并回收3-(3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1)(40mg)。质谱(esi)m/zc16h14cln5o2[m+h]+计算值344.08，346.08，实测值344.40，346.40。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.84–8.81(m,1h),8.37–8.33(m,1h),8.29–8.24(m,1h),7.70(t,j＝8.0hz,1h),7.30(m,1h),7.22–7.19(m,2h),4.68(s,2h),2.52(s,3h)。
步骤3：3-(3-氨基苯基)-n-(2-氯-6-甲基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(19)的合成
将化合物n-(2-氯-6-甲基苯甲基)-3-(3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(2b)(30mg,0.087mmol)和水合肼(0.3ml,80％水溶液)在乙醇(5ml)中的混合物加热至60℃。然后加入raney-ni(10mg)。所得混合物在此温度搅拌3h。冷却至室温后，过滤，减压去除溶剂。残留物通过反向快速柱层析(c18)纯化，得到为白色固体的3-(3-氨基苯基)-n-(2-氯-6–甲基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(3b)(20mg，收率73％)。质谱(esi)m/zc16h16cln5[m+h]+计算值314.11，316.11，实测值314.40，316.40。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.28(m,3h),7.19(m,3h),6.79(s,1h),4.62(s,2h),2.50(s,3h)。
步骤4：n-(3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)丙烯酰胺(17)的合成：
将化合物3a(12.0mg,0.038mmol)和三乙胺(5.0mg,0.049mmol)在四氢呋喃(thf)(0.5ml)中的混合物冷却至0℃，加入丙烯酰氯(3.45mg,0.038mmol)。然后将所得混合物室温搅拌3h，再用水淬灭。减压去除溶剂，残留物经反相hplc(c18)纯化，得到为白色固体的n-(3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)丙烯酰胺(a)(2.6mg，收率18.5％)。质谱(esi)m/zc18h15clfn5o[m+h]+计算值372.09，374.09，实测值372.30，374.20。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.12(s,1h),7.77(s,1h),7.73–7.63(m,1h),7.40(s,1h),7.37–7.27(m,2h),7.14(t,j＝8.1hz,1h),6.46(dd,j＝17.0,9.6hz,1h),6.38(dd,j＝17.0,2.3hz,1h),5.79(dd,j＝9.6,2.3hz,1h),4.67(s,2h)。
步骤4：n-(3-(5-((2-氯-6-甲基苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)丙烯酰胺(20)的合成：
将化合物3b(4.0mg,0.013mmol)和三乙胺(30.0mg,0.3mmol)在四氢呋喃(thf)(0.5ml)中的混合物冷却至0℃，加入丙烯酰氯(2.0mg,0.022mmol)。然后，将所得混合物室温搅拌3h，再用水淬灭。减压去除溶剂。残留物经反相hplc(c18)纯化，得到为白色固体的n-(3-(5-((2-氯-6-甲基苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)丙烯酰胺(b(3.1mg，收率66.1％)。质谱(esi)m/zc19h18cln5o[m+h]+计算值368.12，370.12，实测值368.40，370.40。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ10.25(s,1h),8.19(s,1h),7.75(d,j＝9.0hz,1h),7.62(d,j＝7.9hz,1h),7.36(d,j＝7.9hz,1h),7.32(dd,j＝6.8,4.8hz,1h),7.22(dd,j＝12.1,4.7hz,2h),6.46(dd,j＝17.0,10.1hz,1h),6.27(dd,j＝17.0,2.0hz,1h),5.76(dd,j＝10.1,2.0hz,1h),4.52(d,j＝5.4hz,2h),2.48(s,3h)。
步骤4：n-(3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-2-氰基-4,4-二甲基戊-2-烯酰胺(42)的合成：
将新戊醛(pivalaldehyde)(202.5mg,1.79mmol,75％在正丁醇中的溶液)、2-氰基乙酸(150.0mg,1.74mmol)和koh(200.0mg,3.56mmol)在甲醇(2ml)中的悬浮液加热至40℃5h。待tlc分析显示起始原料被消耗后，用3mhcl调节混合物的ph值至3～4，用乙酸乙酯(50ml)萃取。所得乙酸乙酯溶液干燥，浓缩，得到为白色固体的2-氰基-4,4-二甲基戊-2-烯酸(100mg，收率37.3％)。质谱(esi)m/zc8h11no2[m-h]-计算值152.08，实测值152.20。1hnmr(400mhz,cdcl3)(z)-2-氰基-4,4-二甲基戊-2-烯酸δ4.35(s,1h),0.90(s,9h)；(e)-2-氰基-4,4-二甲基戊-2-烯酸δ7.73(s,1h),1.33(s,9h)。
将化合物3a(30.0mg,0.094mmol)、2-氰基-4,4-二甲基戊-2-烯酸(15.0mg,0.098mmol)和n,n-二甲基吡啶-4-胺(dmap)(2mg,0.016mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(2ml)中的混合物冷却至0℃，加入edci(40.0mg,0.209mmol)。然后将所得混合物室温搅拌20h，再用水淬灭。减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)纯化，得到为白色固体的n-(3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-2-氰基-4,4-二甲基戊-2-烯酰胺(c)(14mg,收率32.7％)。质谱(esi)m/zc23h22clfn6o[m+h]+计算值453.15，455.15，实测值453.20，455.30。
步骤4：n-(3-(5-((2-氯-6-甲基苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-2-氰基-4,4-二甲基戊-2-烯酰胺(23)的合成：
将化合物3b(10.0mg,0.032mmol)、2-氰基-4,4-二甲基戊-2-烯酸(5.0mg,0.033mmol)和n,n-二甲基吡啶-4-胺(dmap)(0.4mg,0.0032mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(2ml)中的混合物冷却至0℃，加入edci(15.0mg,0.078mmol)。然后将所得混合物室温搅拌20h，再用水淬灭。减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)纯化，得到为白色固体的n-(3-(5-((2-氯-6-甲基苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-2-氰基-4,4-二甲基戊-2-烯酰胺(d)(5.0mg，收率35％)。质谱(esi)m/zc24h25cln6o[m+h]+计算值449.18，451.18，实测值449.50，451.30。1hnmr(400mhz,cdcl3,旋转异构体混合物)δ7.94(s,1h),7.84(d,j＝7.7hz,1h),7.79(s,0.2h),7.42(t,j＝7.8hz,1h),7.32(d,j＝8.7hz,1h),7.23(d,j＝7.3hz,1h),7.15–7.09(m,2h),5.05(s,1h),4.67(s,2h),4.35(d,j＝2.8hz,1h),3.81(d,j＝2.9hz,1h),2.51(s,3h),1.33(s,1.3h),1.03(s,9h)。
步骤4：n-(3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)丁-2-炔酰胺(37)的合成：
将化合物3a(15.0mg,0.047mmol)、2-丁炔酸(10.0mg,0.118mmol)和n,n-二甲基吡啶-4-胺(dmap)(2mg,0.016mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(2ml)中的混合物冷却至0℃，加入edci(40.0mg,0.209mmol)。然后将所得混合物室温搅拌20h，再用水淬灭。减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)纯化，得到为白色固体的n-(3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)丁-2-炔酰胺(5mg，收率27.6％)。质谱(esi)m/zc19h15clfn5o[m+h]+计算值384.09，386.09，实测值384.30，86.43。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.05(s,1h),7.68-7.66(m,2h),7.38-7.29(m,3h),7.20-7.13(m,1h),4.67(s,2h),2.04(s,3h)。
步骤1：3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯甲酸(中间体1)的合成：
将3-氨基苯甲酸(500mg,3.65mmol)和三乙胺(1.11g,10.97mmol)在甲醇(6ml)中的混合物冷却至0℃，加入二碳酸二叔丁酯(880mg,4.03mmol)。然后将所得混合物室温搅拌10h，再用水淬灭。减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为白色固体的3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯甲酸(1)(800mg，收率92.5％)。质谱(esi)m/zc12h15no4[m-h]-计算值236.10，实测值236.10。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ12.90(s,1h),9.55(s,1h),8.14(s,1h),7.62(d,j＝8.5hz,1h),7.53(d,j＝7.8hz,1h),7.36(t,j＝7.9hz,1h),1.48(s,9h)。
步骤2：3-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)苯甲酸(中间体2)的合成：
将3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯甲酸(1)(1.0g,4.21mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(10ml)中的混合物冷却至0℃，加入氢化钠(505.7mg,12.64mmol,60％,分散在矿物油中)。混合物在此温度下搅拌1h，加入碘甲烷(1.26g,8.80mmol)。将所得混合物室温搅拌5h，再用水淬灭。减压去除溶剂，残留物用甲醇(10ml)/水(1ml)溶解，加入氢氧化钠(337.2mg,8.43mmol)。待tlc分析显示起始原料被消耗后，用3mhcl调节混合物的ph值至3～4，再用乙酸乙酯(50ml)萃取。将所得乙酸乙酯溶液干燥，浓缩，得到为白色固体的3-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)苯甲酸(2)(950mg，收率89.7％)。质谱(esi)m/zc13h17no4[m-h]-计算值250.12，实测值250.10。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ13.06(s,1h),7.83(t,j＝1.8hz,1h),7.75–7.72(m,1h),7.53(ddd,j＝8.0,2.3,1.2hz,1h),7.49–7.43(m,1h),3.20(s,3h),1.40(s,9h)。
步骤3：(3-(5-氨基-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(中间体3)的合成：
将氨基胍硝酸盐(360mg,2.63mmol)和k2co3(660mg,4.78mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(3ml)中的悬浮液室温搅拌1h。3-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)苯甲酸(2)(600mg,2.39mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(30ml)中的溶液在0℃用n,n'-羰基二咪唑(cdi)(426mg,2.63mmol)处理。将溶液室温搅拌1h。然后加入到悬浮液中。所得混合物室温搅拌3h，然后加热至100℃并维持3h。使混合物冷却至室温，过滤，浓缩。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为黄色油状物的(3-(5-氨基-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(3)(220g，收率31.8％)。质谱(esi)m/zc14h19n5o2[m+h]+计算值290.15，实测值290.20。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.85–7.80(m,1h),7.73–7.67(m,1h),7.61(s,1h),7.29(t,j＝7.9hz,1h),7.23–7.18(m,1h),7.04(s,2h),3.23(s,3h),1.46(s,9h)。
步骤4：(3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(中间体4)的合成：
将(3-(5-氨基-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(3)(200mg,0.69mmol)、2-氯-6-氟苯甲醛(200mg,1.26mmol)和对甲苯磺酸(11.9mg,0.069mmol)在异丙醇(5ml)中的混合物加热回流过夜。使溶液冷却至室温后，加入nabh3cn(120mg,1.91mmol)和乙酸(0.5ml)。然后将所得混合物室温搅拌5h，再用水淬灭。减压去除溶剂。(3-(5-((2-氯-6-氟苯基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(4)粗品未进一步纯化而直接使用。
步骤5：n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(3-(甲基氨基)苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(18)的合成：
将(3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(4)(100mg)粗品在四氢呋喃(thf)(5ml)中的混合物冷却至0℃，加入三氟乙酸(10ml)。然后将所得混合物室温搅拌5h。减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为白色固体的n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(3-(甲基氨基)苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(5)(45mg，收率19.6％，两步)。质谱(esi)m/zc16h15clfn5[m+h]+计算值332.10，334.10，实测值332.40，334.30。1hnmr(400mhz,d6-dmso,旋转异构体2:1混合物)δ13.17(s,0.5h),12.07(s,1h),7.35(s,3h),7.23(s,1.5h),7.12(s,4.5h),6.85(s,1h),6.48-6.52(m,1.5h),6.13(s,0.6h),5.71-5.75(m,1.5h),4.51(s,3h),2.69(s,4.5h)。
步骤6：n-(3-(5-((2-氯-6-氟苯基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-n-甲基丙烯酰胺(21)的合成
将化合物29(32mg,0.096mmol)和n-乙基-n-异丙基-2-丙胺(dipea)(50mg,0.39mmol)在四氢呋喃(thf)(0.5ml)中的混合物冷却至0℃，加入丙烯酰氯(20mg,0.22mmol)。然后将所得混合物室温搅拌3h。减压去除溶剂。残留物用甲醇(2ml)/水(0.5ml)溶解，加入naoh(10mg,0.25mmol)，反应混合物在室温搅拌5h，浓缩。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为白色固体的n-(3-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-n-甲基丙烯酰胺(6.3mg，收率17％)。质谱(esi)m/zc19h17clfn5o[m+h]+计算值386.11，388.11，实测值386.50，388.40。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.95(d,j＝7.9hz,1h),7.83(t,j＝1.7hz,1h),7.43(t,j＝7.8hz,1h),7.25–7.19(m,2h),7.18–7.14(m,1h),7.00-7.05(m,1h),6.34(dd,j＝16.8,1.9hz,1h),6.09(dd,j＝16.5,10.3hz,1h),5.50(dd,j＝10.3,1.6hz,1h),5.37(s,1h),4.68(d,j＝5.3hz,2h),3.36(s,3h)。
步骤1：3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)的合成：
将氨基胍硝酸盐(139mg,1.01mmol)和koh(57mg,1.02mmol)在甲醇(2ml)中的悬浮液室温搅拌1.5h，浓缩。残留物用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(2ml)稀释。4-甲氧基-3-硝基苯甲酸(197mg,1.0mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(5ml)中的溶液用n,n'-羰基二咪唑(cdi)(190mg,1.17mmol)在0℃处理。溶液室温搅拌1.5h。然后逐滴加入到悬浮液中。加料完成后，反应混合物在室温搅拌2h。通过旋转蒸发去除溶剂，残留物用水(50ml)，溶解，并加热回流5h。冷却至室温后，过滤，所得固体用甲醇重结晶，得到为淡黄色固体的3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1)(110mg，收率46.8％)。质谱(esi)m/zc9h9n5o3[m+h]+计算值236.07，实测值236.20。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ12.15(s,1h),8.26(d,j＝1.4hz,1h),8.11(dd,j＝8.8,2.1hz,1h),7.42(d,j＝8.9hz,1h),6.14(s,2h),3.95(s,3h)。
步骤2：n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体2)的合成：
将3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1)(100mg,0.43mmol)和2-氯-6-氟苯甲醛(150mg,0.95mmol)在无水甲苯(10ml)中的混合物加热回流15h。使溶液冷却至室温后，加入nabh3cn(45mg,0.72mmol)和乙酸(1ml)。然后将所得混合物室温搅拌3h，再用水淬灭。减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)纯化，得到为淡黄色固体的n-(2-氯-6-氟苯基)-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(2)(70mg，收率43.6％)，其直接用于下一个步骤。质谱(esi)m/zc16h13clfn5o3[m+h]+计算值378.07，380.07，实测值378.30，380.30。
步骤3：3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-n-(2-氯-6-氟苯甲基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(24)的合成：
将n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(2)(70mg,0.19mmol)和水合肼(1.0ml,80％水溶液)在乙醇(10ml)中的混合物加热至60℃。然后加入raney-ni(10mg)。所得混合物室温搅拌3h。冷却至室温后，过滤，减压去除溶剂。残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)纯化，得到为白色固体的3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-n-(2-氯-6-氟苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(3)(50mg，收率77.6％)。质谱(esi)m/zc16h15clfn5o[m+h]+计算值348.09，350.09，实测值348.50，350.60。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.36–7.23(m,4h),7.11(t,j＝8.3hz,1h),6.89(d,j＝8.2hz,1h),4.63(s,2h),3.88(s,3h)。
步骤4：n-(5-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)-2-甲氧基苯基)丙烯酰胺(22)的合成：
将化合物3(8.0mg,0.023mmol)和n-乙基-n-异丙基-2-丙胺(dipea)(12.0mg,0.093mmol)在四氢呋喃(thf)(0.5ml)中的混合物冷却至0℃后，加入丙烯酰氯(5.0mg,0.055mmol)。所得混合物室温搅拌30min，再用水淬灭。减压去除溶剂。残留物用甲醇(2ml)/水(0.5ml)溶解，然后加入naoh(5.0mg,0.13mmol)，反应混合物在室温搅拌1h。浓缩，残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为白色固体的n-(5-(5-((2-氯-6-氟苯甲基)氨基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)-2-甲氧基苯基)-丙烯酰胺(5.1mg，收率55.2％)。质谱(esi)m/zc19h17clfn5o2[m-h]-计算值400.11,401.11，实测值400.40,402.40。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.94(s,1h),7.91(s,1h),7.73(dd,j＝8.5,2.1hz,1h),7.21-7.16(m,2h),7.03-6.97(m,1h),6.94(d,j＝8.6hz,1h),6.42(dd,j＝16.9,1.4hz,1h),6.30(dd,j＝16.9,10.1hz,1h),5.77(dd,j＝10.0,1.4hz,1h),5.09(s,1h),4.68(d,j＝5.0hz,2h),3.94(s,3h)。
步骤1：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)的合成：
将氨基胍硝酸盐(137mg,1.0mmol)和k2co3(276mg,2.0mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(3ml)中的悬浮液室温搅拌1h。3,4,5-三甲氧基苯甲酸(212mg,1.0mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(5ml)中的溶液用n,n'-羰基二咪唑(cdi)(162mg,1.0mmol)在0℃处理。溶液室温搅拌1h。然后加入到悬浮液中。所得混合物室温搅拌3h，再加热至100℃并维持3h。混合物冷却至室温，过滤，浓缩，得到为白色固体的3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)粗品(180mg)，直接用于下一个步骤。质谱(esi)m/zc11h14n4o3[m+h]+计算值251.11，实测值241.20。
步骤2：n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(36)的合成：
将3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)(180mg,0.72mmol)、2-氯-6-氟苯甲醛(180mg,1.14mmol)和对甲苯磺酸(20.00mg,0.12mmol)在异丙醇(5ml)中的混合物加热回流过夜。使溶液冷却至室温后，加入nabh3cn(180mg,2.86mmol)和乙酸(1.5ml)。然后，所得混合物室温搅拌5h，再用水淬灭。减压去除溶剂，残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为白色固体的n-(2-氯-6-氟苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(65mg，收率16.6％，2步)。质谱(esi)m/zc18h18clfn4o3[m+h]+计算值393.11,395.11，实测值393.33,395.27。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.96(s,1h),7.25-7.22(m,1h),7.18(s,2h),7.15-7.11(m,1h),7.06-7.02(m,1h),5.22(t,j＝5.6hz,1h),4.65(d,j＝5.6hz,2h),3.89(s,6h),3.87(s,3h).
步骤1：3-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)的合成：
将氨基胍硝酸盐(150mg,1.09mmol)和k2co3(150mg,1.09mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(3ml)中的悬浮液室温搅拌1h。1h-苯并[d]咪唑-2-羧酸(162mg,1.0mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(5ml)中的溶液在0℃处理用n,n'-羰基二咪唑(cdi)(180mg,1.1mmol)。溶液室温搅拌1h。然后加入到悬浮液中。所得混合物室温搅拌3h，然后加热至100℃并维持3h。混合物冷却至室温，过滤，浓缩，得到为白色固体的3-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)(290mg,纯度约40％)粗品，直接用于下一个步骤。质谱(esi)m/zc9h8n6[m+h]+计算值201.08，实测值201.20。
步骤2：3-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-n-(2-氯-6-氟苯甲基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(31)的合成：
将3-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体1)(50mg,0.25mmol,40％纯度)、2-氯-6-氟苯甲醛(50mg,0.32mmol)和对甲苯磺酸(5.00mg,0.03mmol)在乙醇(5ml)中的混合物加热回流过夜。使溶液冷却至室温后，加入nabh3cn(50mg,0.80mmol)和乙酸(1.5ml)。然后，所得混合物室温搅拌5h，再用水淬灭。减压去除溶剂，残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为白色固体的3-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-n-(2-氯-6-氟苯甲基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(1.4mg)。质谱(esi)m/zc16h12clfn6[m+h]+计算值343.08,345.08，实测值343.33,345.27。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.62(s,2h),7.32-7.27(m,4h),7.20-7.14(m,1h),4.72(s,2h).
步骤1：3,4-双(2-甲氧基乙氧基)苯甲酸(中间体1)的合成：
将3,4-二羟基苯甲酸(1.0g,6.49mmol)、tbai(239.67mg,0.65mmol)和k2co3(3.59g,25.98mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(10ml)中的悬浮液加热至100℃并维持1h。使混合物冷却至50℃后，加入1-氯-2-甲氧基乙烷(2.45g,25.92mmol)。所得混合物在85℃搅拌15h，再冷却至室温。过滤，浓缩，残留物用thf(40ml)/h2o(10ml)溶解，加入koh(1.09g,19.5mmol)。所得溶液室温搅拌5h，然后用1nhcl淬灭。再用乙酸乙酯(30ml,3次)萃取，有机相用盐水(15ml)洗涤，在na2so4上干燥，过滤，浓缩，得到为澄清油状物的3,4-双(2-甲氧基乙氧基)苯甲酸(中间体1)(1.32g，收率75.33％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.48(d,j＝8.4hz,1h),7.65(s,1h),6.94(d,j＝8.4hz,1h),4.24-4.16(m,4h),3.82-3.76(m,4h),3.47(s,6h)。
步骤2：3-(3,4-双(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体2)的合成：
将氨基胍硝酸盐(737.08mg,5.38mmol)和k2co3(743.02mg,5.38mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(5ml)中的悬浮液室温搅拌1h。3,4-双(2-甲氧基乙氧基)苯甲酸(中间体1)(1.32g,4.89mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(10ml)中的溶液在0℃用n,n'-羰基二咪唑(cdi)(871.77mg,5.38mmol)处理。溶液室温搅拌1h。然后加入到悬浮液中。所得混合物室温搅拌3h，再加热至100℃并维持10h。混合物冷却至室温，过滤，浓缩。残留物通过反相hplc(c18)纯化，得到为白色固体的3-(3,4-双(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体2)(800mg，收率53.09％)。1hnmr(400mhz,d6-dmso)δ11.93(s,1h),7.43-7.40(m,2h),6.99-6.97(m,1h),6.01(s,2h),4.12-4.09(m,4h),3.69-3.64(m,4h),3.33(s,6h).
步骤3：3-(3,4-双(2-甲氧基乙氧基)苯基)-n-(2-氯-6-氟苯甲基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(34)的合成：
将3-(3,4-双(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体2)(800mg,2.59mmol)、2-氯-6-氟苯甲醛(1.03g,6.49mmol)和对甲苯磺酸(44.7mg,0.26mmol)在异丙醇(10ml)中的混合物加热回流过夜。使溶液冷却至室温后，加入nabh3cn(652.2mg,10.38mmol)和乙酸(1.5ml)。然后，所得混合物室温搅拌5h，再用水淬灭。减压去除溶剂，残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为白色固体的3-(3,4-双(2-甲氧基乙氧基)苯基)-n-(2-氯-6-氟苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(120mg，收率10.26％)。质谱(esi)m/zc21h24clfn4o4[m+h]+计算值451.15,453.15，实测值451.44,453.37。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.46(s,1h),7.45-7.43(d,j＝8hz,1h),7.25-7.22(m,2h),7.03-7.0(m,1h),6.92-6.90(d,j＝8hz,1h),5.18(t,j＝6.8hz,1h),4.65(d,j＝6.8hz,2h),4.19-4.16(m,4h),3.79-3.75(m,4h),3.44(s,6h).
步骤1：3-甲氧基-4-(3-吗啉基丙氧基)苯甲酸(中间体1)的合成：
将4-羟基-3-甲氧基苯甲酸甲酯(914.2mg,5.02mmol)、tbai(185.4mg,0.50mmol)和k2co3(763mg,5.52mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(10ml)中的悬浮液加热至100℃并维持1h。使混合物冷却至50℃后，加入4-(3-氯丙基)吗啉(903.3mg,5.52mmol)。所得混合物在85℃搅拌15h，再冷却至室温。过滤，浓缩，残留物用thf(40ml)/h2o(10ml)溶解，加入koh(1.09g,19.5mmol)。所得溶液室温搅拌5h，用1nhcl淬灭。用乙酸乙酯(30ml,3次)萃取，有机相用盐水(15ml)洗涤，在na2so4上干燥，过滤，浓缩，得到为澄清油状物的3-甲氧基-4-(3-吗啉基丙氧基)苯甲酸(中间体1)(1.30g，收率87.72％)，其未作进一步纯化而直接用于下一个步骤。
步骤2：3-(3-甲氧基-4-(3-吗啉基丙氧基)苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体2)的合成：
将氨基胍硝酸盐(1.40g,10.21mmol)和k2co3(1.41g,10.21mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(10ml)中的悬浮液室温搅拌1h。3-甲氧基-4-(3-吗啉基丙氧基)苯甲酸(中间体1)(0.90g,3.05mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(10ml)中的溶液在0℃用n,n'-羰基二咪唑(cdi)(1.10g,6.78mmol)处理。溶液室温搅拌1h。然后加入到悬浮液中。所得混合物室温搅拌3h，然后加热至100℃并维持10h。混合物冷却至室温，过滤，浓缩。残留物通过反相hplc(c18)纯化，得到为白色固体的3-(3-甲氧基-4-(3-吗啉基丙氧基)苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体2)(520mg,纯度80％)，直接用于下一个步骤。质谱(esi)m/zc16h23n5o3[m+h]+计算值334.18，实测值334.31。
步骤3：n-(2-氯-6-氟苯甲基)-3-(3-甲氧基-4-(3-吗啉基丙氧基)苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(32)的合成：
将3-(3-甲氧基-4-(3-吗啉基丙氧基)苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(中间体2)(480mg,1.15mmol,纯度80％)、2-氯-6-氟苯甲醛(913.12mg,5.76mmol)和对甲苯磺酸(19.83mg,0.12mmol)在异丙醇(10ml)中的混合物加热回流过夜。使溶液冷却至室温后，加入nabh3cn(723.81mg,11.52mmol)和乙酸(1.5ml)。然后，所得混合物室温搅拌5h，再用水淬灭。减压去除溶剂，残留物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝100:1至10:1)纯化，得到为白色固体的n-(2-氯-6-氟苯基)-3-(3-甲氧基-4-(3-吗啉基丙氧基)苯基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺(85mg，收率15.51％)。质谱(esi)m/zc23h27clfn5o3[m+h]+计算值476.18,478.18，实测值476.39,478.27。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.46(s,1h),7.45-7.43(d,j＝8.4hz,1h),7.25-7.22(m,2h),7.03-7.0(m,1h),6.92-6.90(d,j＝8.4hz,1h),5.08(brs,1h),4.65(dd,j＝6.8,1.2hz,2h),4.15-4.10(m,2h),3.90(s,3h),3.75-3.72(m,4h),2.61-2.58(m,2h),2.54(brs,4h),2.08-2.04(m,2h).
质粒构建
分别用ncoi/noti、ndei和sali限制位点将人p38mapk和mkk6克隆到pet28a载体上。然后用来自transgen的定点突变试剂盒使pet28a-hmkk6发生s207d/t211d突变。对插入基因测序，以确保序列正确。
融合蛋白的纯化
利用e.colibl21de3和lb培养基进行蛋白表达。培养物在37℃生长至od600nm为1.2，然后在18℃边振摇边冷却1h，再在16℃用0.2mmiptg诱导16h。蛋白质如前所述进行纯化。简而言之，收获细胞，用ni树脂和monoqhp柱纯化。合并的蛋白质峰流份然后进一步采用superdex-75柱，以50mmtris-hcl(ph7.4)、150mmnacl、5％甘油、10mmmgcl2、5mmdtt为洗脱剂进行纯化。所有纯化步骤都在4℃进行。
p38mapk激酶活性检测
1000ng无活性hmapk14用100ng组成性激活(constitutivelyactive)的hmkk6dd在15ul含有50umatp的反应体积中于30℃活化30min。用z’-lyte激酶活性检测试剂盒ser/thr15肽(invitrogen,carlsbad,ca)进行激酶活性检测。化合物筛选的标准反应含有100nmhmapk14、1mm肽底物、100umatp、50mmhepes(ph7.4)、10mmmgcl2、0.01％brij-35和0.5％dmso。
细胞培养
jurkatt和ramosb细胞用补充了10％fbs、每毫升100μg青霉素和链霉素的rpmi1640培养基中培养。
抗体
用于western印迹的抗btk(tyr223)、抗zap-70、抗plcγ-2、抗p-btk(y223)、抗p-plcγ-2(y1217)、抗p-zap-70(y319)和抗gapdh购买自cellsignalingtechnology(danvers,ma,usa)。
b和t细胞活化以及磷酸化免疫印迹分析(phospho-blots)
在37℃于5％二氧化碳培养箱中，在有或无不同浓度化合物的条件下培养ramosb细胞或jurkatt细胞(2×106)1.5h。然后加入羊抗人igmf(ab’)2(10μg/ml；invitrogen)或dynabeadshumant-activactorcd3/cd28，以在37℃分别刺激ramosb细胞或jurkatt细胞5min。将细胞离心，用冷的dpbs洗涤1次，再用含有磷脂酶抑制剂cocktail2和蛋白酶抑制剂cocktail(均来自sigma-aldrich)的ripa缓冲液(sigma-aldrich)在冰上溶解20min。然后样品在4℃以20,000g的转速离心20min。收集上清液，用上样缓冲液稀释5倍后，进行sds-page电泳，再进行免疫印迹分析。
化合物对一些自身免疫性疾病相关激酶靶点的抑制活性。
*n.a.：不可得。
我们还测定了用或未用化合物处理过的ramosb细胞的信号通路中的蛋白质靶点的磷酸化水平。用或未用化合物处理1.5h的ramosb细胞用igmf(ab′)2活化(+)或未活化(-)5min。对所收获细胞的裂解物进行sds-page电泳和免疫印迹分析实验。在用羊抗人igmf(ab’)2激活ramos细胞的bcr通路后，示例性化合物1、6、11、17和20显示出以剂量依赖性的方式抑制btk的自磷酸化，以及btk的生理底物(physiologicalsubstrate)plcγ的磷酸化。上述化合物的细胞活性与在酶促实验中的表现一致。
我们还测定了用或未用化合物处理过的jurkatt细胞的信号通路中的蛋白质靶点的磷酸化水平。用或未用化合物处理1.5h的jurkatt细胞用dynabeadshumant-激活剂cd3/cd28活化(+)或未活化(-)5分钟。对所收获细胞的裂解物进行sds-page电泳和免疫印迹分析实验。在用dynabeadshumant-激活剂cd3/cd28激活jurkat细胞的tcr通路后，示例性化合物1、6、11、17和20显示出以剂量依赖性的方式抑制lck的生理底物zap-70和lat的磷酸化。上述化合物的细胞活性与在酶促实验中的表现一致。
参考文献
1davidson,a.&diamond,b.autoimmunediseases.thenewenglandjournalofmedicine345,340-350(2001).
2marrack,p.,kappler,j.&kotzin,b.l.autoimmunedisease:whyandwhereitoccurs.natmed7,899-905,doi:10.1038/9093590935[pii](2001).
3lanzavecchia,a.,iezzi,g.&viola,a.fromtcrengagementtotcellactivation:akineticviewoftcellbehavior.cell96,1-4,doi:s0092-8674(00)80952-6[pii](1999).
4pierce,s.k.lipidraftsandb-cellactivation.natrevimmunol2,96-105,doi:10.1038/nri726(2002).
5flanagan,m.e.etal.discoveryofcp-690,550:apotentandselectivejanuskinase(jak)inhibitorforthetreatmentofautoimmunediseasesandorgantransplantrejection.jmedchem53,8468-8484,doi:10.1021/jm1004286(2010).
6honigberg,l.a.etal.thebrutontyrosinekinaseinhibitorpci-32765blocksb-cellactivationandisefficaciousinmodelsofautoimmunediseaseandb-cellmalignancy.procnatlacadsciusa107,13075-13080,doi:10.1073/pnas.1004594107
1004594107[pii](2010).
7abdel-magid,a.f.spleentyrosinekinaseinhibitors(syk)aspotentialtreatmentforautoimmuneandinflammatorydisorders:patenthighlight.acsmedchemlett4,18-19,doi:10.1021/ml300405d(2013).
8bhagwat,s.s.kinaseinhibitorsforthetreatmentofinflammatoryandautoimmunedisorders.purinergicsignal5,107-115,doi:10.1007/s11302-008-9117-z(2009).
9gaestel,m.,kotlyarov,a.&kracht,m.targetinginnateimmunityproteinkinasesignallingininflammation.natrevdrugdiscov8,480-499,doi:10.1038/nrd2829nrd2829[pii](2009).
10vandermerwe,p.a.&dushek,o.mechanismsfortcellreceptortriggering.natrevimmunol11,47-55,doi:10.1038/nri2887nri2887[pii](2011).
11palacios,e.h.&weiss,a.functionofthesrc-familykinases,lckandfyn,int-celldevelopmentandactivation.oncogene23,7990-8000,doi:1208074[pii]10.1038/sj.onc.1208074(2004).
12chan,a.c.etal.activationofzap-70kinaseactivitybyphosphorylationoftyrosine493isrequiredforlymphocyteantigenreceptorfunction.emboj14,2499-2508(1995).
13wang,h.etal.zap-70:anessentialkinaseint-cellsignaling.coldspringharbperspectbiol2,a002279,doi:10.1101/cshperspect.a0022792/5/a002279[pii](2010).
14seggewiss,r.etal.imatinibinhibitst-cellreceptor-mediatedt-cellproliferationandactivationinadose-dependentmanner.blood105,2473-2479,doi:2004-07-2527[pii]10.1182/blood-2004-07-2527(2005).
15stachlewitz,r.f.etal.a-770041,anovelandselectivesmall-moleculeinhibitoroflck,preventsheartallograftrejection.jpharmacolexpther315,36-41,doi:jpet.105.089169[pii]10.1124/jpet.105.089169(2005).
16burchat,a.etal.discoveryofa-770041,asrc-familyselectiveorallyactivelckinhibitorthatpreventsorganallograftrejection.bioorgmedchemlett16,118-122,doi:s0960-894x(05)01213-8[pii]10.1016/j.bmcl.2005.09.039(2006).
17won,j.etal.rosmarinicacidinhibitstcr-inducedtcellactivationandproliferationinanlck-dependentmanner.eurjimmunol33,870-879,doi:10.1002/eji.200323010(2003).
18youn,j.etal.beneficialeffectsofrosmarinicacidonsuppressionofcollageninducedarthritis.jrheumatol30,1203-1207,doi:0315162x-30-1203[pii](2003).
19developmentofthepotentanti-rheumatoidarthritiscompoundderivedfromrosmarinicacidandtheevaluationoftheactivityincollagen-inducedarthritismousemodel.248-252(2015).
20abraham,n.,miceli,m.c.,parnes,j.r.&veillette,a.enhancementoft-cellresponsivenessbythelymphocyte-specifictyrosineproteinkinasep56lck.nature350,62-66,doi:10.1038/350062a0(1991).
21cooke,m.p.,abraham,k.m.,forbush,k.a.&perlmutter,r.m.regulationoftcellreceptorsignalingbyasrcfamilyprotein-tyrosinekinase(p59fyn).cell65,281-291,doi:0092-8674(91)90162-r[pii](1991).
22appleby,m.w.etal.defectivetcellreceptorsignalinginmicelackingthethymicisoformofp59fyn.cell70,751-763,doi:0092-8674(92)90309-z[pii](1992).
23molina,t.j.etal.profoundblockinthymocytedevelopmentinmicelackingp56lck.nature357,161-164,doi:10.1038/357161a0(1992).
24groves,t.etal.fyncanpartiallysubstituteforlckintlymphocytedevelopment.immunity5,417-428,doi:s1074-7613(00)80498-7[pii](1996).
25denny,m.f.,patai,b.&straus,d.b.differentialt-cellantigenreceptorsignalingmediatedbythesrcfamilykinaseslckandfyn.molcellbiol20,1426-1435(2000).
26webb,y.,hermida-matsumoto,l.&resh,m.d.inhibitionofproteinpalmitoylation,raftlocalization,andtcellsignalingby2-bromopalmitateandpolyunsaturatedfattyacids.jbiolchem275,261-270(2000).
27vanderheide,j.j.,bilo,h.j.,donker,j.m.,wilmink,j.m.&tegzess,a.m.effectofdietaryfishoilonrenalfunctionandrejectionincyclosporine-treatedrecipientsofrenaltransplants.thenewenglandjournalofmedicine329,769-773,doi:10.1056/nejm199309093291105(1993).
28lowenberg,m.etal.rapidimmunosuppressiveeffectsofglucocorticoidsmediatedthroughlckandfyn.blood106,1703-1710,doi:2004-12-4790[pii]10.1182/blood-2004-12-4790(2005).
29edwards,j.c.etal.efficacyofb-cell-targetedtherapywithrituximabinpatientswithrheumatoidarthritis.thenewenglandjournalofmedicine350,2572-2581,doi:10.1056/nejmoa032534350/25/2572[pii](2004).
30buggy,j.j.&elias,l.brutontyrosinekinase(btk)anditsroleinb-cellmalignancy.intrevimmunol31,119-132,doi:10.3109/08830185.2012.664797(2012).
31rawlings,d.j.etal.mutationofuniqueregionofbruton'styrosinekinaseinimmunodeficientxidmice.science261,358-361(1993).
32lou,y.etal.structure-baseddrugdesignofrn486,apotentandselectivebruton'styrosinekinase(btk)inhibitor,forthetreatmentofrheumatoidarthritis.jmedchem58,512-516,doi:10.1021/jm500305p(2015).
33kotlyarov,a.etal.mapkapkinase2isessentialforlps-inducedtnf-alphabiosynthesis.natcellbiol1,94-97,doi:10.1038/10061(1999).
34brook,m.,sully,g.,clark,a.r.&saklatvala,j.regulationoftumournecrosisfactoralphamrnastabilitybythemitogen-activatedproteinkinasep38signallingcascade.febslett483,57-61,doi:s0014-5793(00)02084-6[pii](2000).
35haddad,j.j.vx-745.vertexpharmaceuticals.curropininvestigdrugs2,1070-1076(2001).
36hollenbach,e.etal.inhibitionofp38mapkinase-andrick/nf-kappab-signalingsuppressesinflammatoryboweldisease.fasebj18,1550-1552,doi:10.1096/fj.04-1642fje04-1642fje[pii](2004).
37clark,a.r.&dean,j.l.thep38mapkpathwayinrheumatoidarthritis:asidewayslook.openrheumatolj6,209-219,doi:10.2174/1874312901206010209torj-6-209[pii](2012).