特异性结合至CD3和CD123的双特异性抗体样结合蛋白的制作方法

第一代双特异性抗体是在20多年前开发的。此后，一些临床研究已经测试了针对靶向癌细胞表面抗原而设计的双特异性抗体。这组抗癌融合蛋白含有两个或更多个功能域，其将靶向的癌细胞附近的免疫效应细胞局部定位以达到抗癌活性。随着双特异性抗体技术的发展，通过仅用柔性接头(不包括fc氨基酸片段)连接两个抗体单链可变区(scfv)来产生不同的一类融合蛋白，称为双特异性t细胞衔接体(bite)，一个scfv结合靶向的细胞，另一个则结合t细胞表面上的cd3。一种具有cd19xcd3双特异性结合活性的bite，博纳吐单抗(blinatumomab)在针对具有b系急性淋巴母细胞中的微小残留病的患者的ii期临床试验中显示出有希望的结果。cd123(白细胞介素-3受体α链il-3rα)是在多种血液肿瘤中过度表达的肿瘤抗原。大多数aml细胞表达表面cd123，并且该表达不随aml的亚型变化。据报道，在诊断时cd123在aml中的较高表达与较差的预后相关。已经报道cd123在白血病干细胞(lsc)上表达。越来越多的证据表明，aml是由这些白血病干细胞(lsc)产生的，这些白细胞干细胞已被证明是静止的，并且对dna损伤化学疗法是相对抗性的。因此，与造血干细胞(hsc)相比lsc上的cd123增加的表达提供了aml-lsc的治疗性靶向的机会。已经显示针对cd123产生的单克隆抗体(mab)7g3抑制白血病细胞系和原代细胞二者的il-3介导的增殖和活化(美国专利no.6,177,078)。然而，靶向cd123是否可以在功能上损害aml-lsc仍然不清楚。如本发明人所示，使用cd123xcd3抗体样结合蛋白导致肿瘤细胞杀伤。已经在国际专利申请wo2013/173820中提出并描述了制备具有cd123xcd3双特异性结合活性的双特异性抗体样结合蛋白的想法。此外，基于来自macrogenics的分子的cd123xcd3双重亲和性重定向(dart)双特异性抗体在2014年进入i期临床试验。然而，如本发明人所示，例如，在不存在靶细胞的情况下，基于来自macrogenics的分子的cd123xcd3双重亲和性重定向(dart)双特异性抗体具有表达cd4+的t细胞的82％和表达cd8+的t细胞的83％的活化。t细胞不适当的活化可能导致严重的副作用，如细胞因子释放综合征。细胞因子释放综合征是指由活化的t细胞导致的细胞因子释放，其产生与严重感染中发现的那些类似的一类全身性炎症反应，并且特征为低血压、发热和寒颤。已经报道了由于细胞因子释放综合征导致的死亡，例如针对抗cd3抗体okt3所报道的。抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白描述于专利申请pct/ep2016/051386中，该专利申请在本专利申请的优先权日之时尚未公布(根据欧洲专利公约第54(3)条)。因此，尽管在双特异性抗体技术方面取得了进步，但是仍然需要另外的癌症治疗剂，特别是直接或间接有效靶向和杀死癌细胞的癌症治疗剂。此外，需要开发具有期望的生物活性、良好的代谢、药代动力学和安全性概貌的新的抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白，并且还可以与工业实践相容地大规模生产。因此，在本发明的上下文中，发明人成功地开发了包含突变(例如rf突变和节-入-穴(knob-into-hole)突变)的抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白的几种变体，从而降低所述抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白在表达过程中的聚集。通过减少聚集体的量，可以实现表达和纯化过程中抗体样结合蛋白的异二聚体的量的增加，从而提高纯化的抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白的产率。因此，本发明涉及包含导致在表达和/或纯化过程中聚集减少的突变的抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白。所述抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白在不存在表达cd123的靶细胞例如thp-1细胞的情况下具有低的t细胞活化能力，但是在存在表达cd123的靶细胞例如thp-1细胞的情况下具有高的t细胞活化能力。抗cd3抗体“cd3”表示作为多分子t细胞受体复合物的一部分的t细胞上表达的抗原，所述抗原由至少三种不同的链cd3ε，cd3δ和cd3γ组成。cd3δ和cd3γ与人cd3ε具有低序列同一性和/或相似性(相似性和同一性小于20％)。cd3ε和cdr3δ可以一起形成复合物，即所谓的“cd3ε/δ复合物”。cd3ε也与cdr3γ形成复合物，即所谓的“cd3ε/γ复合物”。t细胞上的cd3聚簇(例如通过固定的抗cd3抗体)导致t细胞活化，其类似于t细胞受体参与，但独立于其克隆典型特异性。“cd3ε”包含三个结构域，胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域。大多数现有技术的抗cd3抗体识别cd3ε链。这种现有技术的抗cd3抗体之一是okt3。现有技术例如使用抗体分子okt3来例示了使用抗体分子的t细胞活化事件。抗cd3抗体及其变体已经在现有技术(us4,361,549；us4,361,549；us5,885,573；us5,929,212；和wo98/52975或us5,955,358)中有描述。okt3已被进一步用作临床移植治疗同种异体移植排斥反应的有效免疫抑制剂(thistlethwaite1984,transplantation38,695-701；woodle1991,transplantation51,1207-1212；choi2001,eur.j.immunol.31(1),94-106)。该疗法的主要缺点是由于t细胞与携带fcγr的细胞和人抗小鼠抗体(hama)反应之间的交联而在细胞因子释放中表现出t细胞活化。几篇出版物已经描述了改变，例如okt3的人源化，以减少这些副作用：us5,929,212；us5,885,573等。另一方面，okt3或其他抗cd3抗体可用作免疫增强剂以刺激t细胞活化和增殖(us6,406,696bluestone；us6,143,297bluestone；us6,113,901bluestone；yannelly1990,j.immunol.meth.1,91-100)。抗cd3抗体也被描述为与抗cd28抗体组合用于诱导t细胞增殖的试剂(us6,352,694)。okt3本身或作为靶向细胞毒性t细胞到肿瘤细胞或病毒感染细胞的双特异性抗体的组分进一步使用(nitta1990,lancet335,368-376；sanna1995,bio/technology13,1221-1224；wo99/54440)。迄今为止使用抗体作为招募t细胞的药物的方法受到若干发现的阻碍。首先，对t细胞具有高结合亲和力的天然或工程化抗体通常不会激活它们所结合的t细胞。第二，与t细胞结合亲和力低的天然或工程化抗体在引发t细胞介导的细胞裂解的能力方面往往是无效的。包括信号肽的全长人cd3ε蛋白的参考序列可从uniprot数据库获得，登录号为p07766(2014年12月12日可获得)，在此包含在seqidno:1中。包括信号肽的全长食蟹猴(macacafascicularis)cd3ε蛋白的参考序列可从uniprot数据库获得，登录号为q95li5(2014年12月12日可获得)，在此包含在seqidno:2中。由发明人从基因组dna克隆的成熟人cd3εhis标记的fc融合蛋白的序列公开在seqidno:3中。所述成熟人cd3εhis标记的fc融合蛋白包含全长人cd3ε蛋白的氨基酸23至126，因此包含人cd3ε的胞外结构域。由发明人从基因组dna克隆的成熟食蟹猴cd3εfc融合蛋白的序列公开在seqidno:4中。所述成熟的食蟹猴cd3εfc融合蛋白包含全长食蟹猴cd3ε蛋白的氨基酸23至117并且因此包含人或食蟹猴cd3ε的胞外结构域，其与野生型序列的氨基酸位置57相比，在氨基酸位置35处含有一个由丙氨酸至缬氨酸的交换。人和食蟹猴cd3ε的结构域组织如下(基于uniprotp07766序列(人)和uniprotq95li5序列(食蟹猴))：因此，人cd3ε的胞外结构域由seqidno:1的位置23-126的氨基酸组成，食蟹猴的胞外结构域由ε-seqidno:2的位置22-117的氨基酸组成。在“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的上下文中使用其重链和轻链可变域的序列的人源化抗cd3抗体“hz20g6”包含-由如下序列组成的重链可变域包含序列seqidno:5的cdr1-h，序列seqidno:6的cdr2-h和序列seqidno:7的cdr3-h的(seqidno:9，cdr以粗体字表示)，和-由如下序列组成的轻链可变域包含序列seqidno:11的cdr1-h，序列“kvs”的cdr2-h和序列seqidno:8的cdr3-h的(seqidno:10，cdr以粗体字表示)。在本发明的上下文中使用的人源化抗cd3抗体“hz20g6”显示出对人和食蟹猴cd3蛋白二者的高亲和性，但是在不存在靶细胞的情况下具有低t细胞活化。抗cd3抗体“hz20g6”特定结合人cd3或人和食蟹猴cd3的胞外结构域。更具体地，所述抗体结合cd3ε。更具体地，抗cd3抗体结合人和食蟹猴的cd3ε的胞外结构域。当以复合物如cd3ε/δ复合物的形式存在时，或当作为单一蛋白存在时，抗cd3抗体与cd3ε结合，无论是否以分离形式表达或存在于可溶性胞外结构域或全长膜-锚定的cd3ε中(如例如存在于t细胞中)，都是无差别的。本发明上下文中使用的抗cd3抗体“hz20g6”特异性针对表面人cd3蛋白，或人和食蟹猴cd3蛋白特别是cd3ε。具体地，抗体不与上述人和食蟹猴cd3γ和/或cd3δ蛋白的胞外结构域结合或不显著交叉反应。本发明上下文中使用的抗cd3抗体“hz20g6”是抗cd3抗体“20g6”的人源化形式。抗cd3抗体“20g6”与人cd3ε/δ复合物的ka值为3,5*104(1/ms)，kd为2,7*10-4(1/s)，导致kd为7,7*10-9(m)，与食蟹猴cd3ε/δ复合物的ka为2,7*104(1/ms)，kd为2,2*10-4(1/s)，导致kd为8,2*10-9(m)，均由biacore测量(数据未显示)。因此抗cd3抗体“20g6”对食蟹猴cd3的亲和力对人cd3的亲和力之比(kd(食蟹猴)/kd(人))为1。因此，抗cd3抗体“20g6”和从其衍生的抗体样结合蛋白可用于在猴子中进行的毒理学研究中，用在猴中观察到的相关毒性概貌来预期人中潜在的不良反应。因此，本抗体样结合蛋白的上下文中使用的抗cd3抗体“20g6”对于人cd3或食蟹猴cd3或两者均具有≤10nm的亲和力(kd)。抗cd123抗体“cd123”(分化簇123)也称为“白细胞介素3受体，α(il3ra)”或“il3r”，“il3rx”，“il3ry”，“il3ray”，“hil-3ra”，且表示异二聚体细胞因子受体的白细胞介素3特异性亚基。功能性白介素3受体是包含与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和白细胞介素5(il-5)的受体共有的特异性α链(il-3a；cd123)和il-3受体β链(β0；cd131)的异二聚体。cd123是一种i型整合的跨膜蛋白，其推导的分子量约43kda，其含有参与il-3结合的胞外结构域，跨膜结构域和约50个氨基酸的短胞质尾部。胞外结构域由两个区域组成：约100个氨基酸的n-末端区域，其序列显示与gm-csf和il-5受体α链的等同区域的相似性；以及接近跨膜结构域的区域，其包含四个保守的半胱氨酸残基和wsxws基序，其是与该细胞因子受体家族的其他成员共有的。il-3结合域包含由两个ig样折叠结构域组成的约200个氨基酸残基的细胞因子受体基序(crm)。cd123的细胞外结构域是高度糖基化的，n-糖基化对于配体结合和受体信号传导均是必需的。蛋白质家族聚集了三个成员：il3ra(cd123a)，csf2ra和il5ra。三个成员之间的总体结构是充分保守的，但序列同源性非常低。迄今为止已经发现了cd123的一个300个氨基酸长的同种型，但仅处于rna水平，其getentry数据库中可以登录号acm24116.1访问。包括信号肽的全长人cd123蛋白的参考序列可从ncbi数据库以登录号np_002174.1和uniprot登录号p26951获得，并且在本文公开于seqidno:12(于2014年12月14日可获得)中。包括信号肽的全长食蟹猴cd123蛋白的参考序列可从genbank数据库以登录号ehh61867.1和uniprot登录号g8f3k3获得，并且在本文公开于seqidno:13(于2014年12月14日可获得)中。由发明人从基因组dna克隆的成熟人cd123his-ii标记的fc-融合蛋白的序列公开在seqidno:14中。所述成熟人cd123fc融合蛋白包含全长人cd123蛋白的氨基酸19至305，因此包含人cd123的胞外结构域。seqidno:15中公开了由发明人克隆的成熟食蟹猴cd123his-ii标记的fc融合蛋白的序列。所述成熟食蟹猴cd123fc融合蛋白包含全长食蟹猴cd123蛋白的氨基酸19至305，因此包含食蟹猴cd123的胞外结构域。人和食蟹猴cd123的结构域组织如下(基于在ncbi数据库中可以登录号np_002174.1访问的人cd123序列(seqidno:12)，以及基于可在uniprot数据库中以登录号g8f3k3访问的食蟹猴cd123序列，seqidno:13)：因此，人cd123的胞外结构域由seqidno:12的位置19-305的氨基酸组成。cd123(白细胞介素-3受体α链il-3rα)是在各种血液肿瘤中过表达的肿瘤抗原。大多数aml原始细胞(blasts)表达cd123，并且该表达不随aml的亚型变化。据报道，cd123在aml诊断中的较高表达与较差的预后相关。cd123表达已在其他血液恶性肿瘤中被报道，包括骨髓增生异常、全身性肥大细胞增多症、胚芽状(blastic)浆细胞样树突状细胞肿瘤(bpdcn)、all和毛细胞白血病。cd123在aml白血病干细胞上表达，并且生长证据表明aml来自这些lsc，其已被证明是静止的，并且对dna损伤型化疗是相对抗性的。假设lsc的持续性加强了初次缓解后的复发，因此根除lsc可被认为是治愈的要求，也是重要的治疗目标。已显示针对cd123产生的单克隆抗体(mab)7g3抑制il-3介导的白血病细胞系和原代细胞的增殖和活化(美国专利no.6,177,078)。具体地，美国专利号6,177,078公开了抗il-3受体α链(il-3rα，cd123)单克隆抗体7g3，和7g3与il-3rα的n-末端结构域(特别是氨基酸残基19-49)结合的能力。美国专利no.6,733,743公开了通过如下步骤来损害表达cd123但不显著表达cd131的血液癌祖细胞的方法：使细胞与抗体和细胞毒性剂(选自化疗剂、毒素或α发射放射性同位素)的组合物接触，由此组合物以有效引起细胞死亡的量选择性地结合cd123。然而，靶向cd123是否可在功能上损害aml-lsc尚未明确。“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的上下文中使用了其重链和轻链可变域的序列的人源化抗cd123抗体“hz7g3”包含-包含如下序列的重链可变域包含序列seqidno:50的cdr1-h，序列seqidno:53的cdr2-h和序列seqidno:51的(cdr3-h的seqidno:52，其cdr以粗体字表示)，和-包含如下序列的轻链可变域包含序列seqidno:48的cdr1-l，序列“was”的cdr2-l和序列seqidno:49的cdr3-l的(seqidno:54，其cdr以粗体字表示)。人源化抗cd123抗体“hz7g3”在seqidno:52的位置55处含有n到s的突变，以避免存在潜在的脱酰胺化。如本领域技术人员已知的，已知抗体中脱酰胺位点的存在导致抗体样品的异质性，因此优选为避免的。定义在整个即时应用中，术语“和/或”是语法连接词，其解释为涵盖其连接的一个或多个情况可能发生。例如，术语“这样的天然序列蛋白可以使用标准重组和/或合成方法制备”表示天然序列蛋白质可以使用标准重组和合成方法制备，或天然序列蛋白可以使用标准重组方法制备或天然序列蛋白可以使用合成方法制备。此外，在整个本申请中，术语“包含/包括(comprising)”解释为涵盖所有具体提到的特征以及任选的、额外的、未指定的特征。如本文所使用的，术语“包含/包括”的使用还公开了其中不存在除具体提及的特征之外的特征(即“由...组成”)的实施方案。此外，不定冠词“a”或“an”不排除多个。在相互不同的从属权利要求中仅记载某些措施的情形并不表示不能采用这些措施的组合。“抗体”，也称为“免疫球蛋白”，可以是天然的或常规的抗体，其中两个重链通过二硫键彼此连接，并且每个重链通过二硫键连接到轻链。存在两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链类型(或同种型)：igm，igd，igg，iga和ige，其绝对抗体分子的功能活性。每条链含有不同的序列结构域。轻链包括两个域或区，可变域(vl)和恒定域(cl)。重链包括四个结构域，一个可变域(vh)和三个恒定域(ch1，ch2和ch3，统称为ch)。轻链(vl)和重链(vh)二者的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(cl)和重链(ch)二者的恒定区域赋予重要的生物学特性，例如抗体链缔合、分泌、跨胎盘迁移、补体结合和与fc受体(fcr)的结合。fv片段是免疫球蛋白fab片段的n末端部分，由一个轻链和一个重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点与抗原决定簇之间的结构互补性。抗体组合位点由主要来自高变区或互补决定区(cdr)的残基组成。有时，非高变区或框架区(fr)的残基影响整个结构域结构，从而影响结合位点。互补决定区或cdr是指共同定义天然免疫球蛋白结合位点的天然fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个cdr，分别称为cdr1-l，cdr2-l，cdr3-l和cdr1-h，cdr2-h，cdr3-h。因此，常规的抗体抗原结合位点包括六个cdr，其包含来自重链和轻链v区各自的cdr组。在本发明的上下文中，抗体或免疫球蛋白是igm，igd，igg，iga和ige。“框架区”(fr)是指介于cdr之间的氨基酸序列，即在单一物种中不同免疫球蛋白之间相对保守的免疫球蛋白轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链分别具有四个fr，分别命名为fr1-l，fr2-l，fr3-l，fr4-l和fr1-h，fr2-h，fr3-h，fr4-h。因此，轻链可变域可命名为(fr1-l)-(cdr1-l)-(fr2-l)-(cdr2-l)-(fr3-l)-(cdr3-l)-(fr4-l)，而重链可变域可命名为(fr1-h)-(cdr1-h)-(fr2-h)-(cdr2-h)-(fr3-h)-(cdr3-h)-(fr4-h)。了解本领域技术人员的氨基酸序列可以容易地确定框架区fr1-l，fr2-l，fr3-l，fr4-l和/或fr1-h，fr2-h，fr3-h，fr4-h。如本文所用，“人框架区”是与天然形成的人抗体的框架区域基本相同(约85％或更多，特别是90％，95％，97％，99％或100％)的框架区。在本发明的上下文中，基于imgt定义来确定免疫球蛋白轻链或重链中的cdr/fr定义(lefranc等dev.comp.immunol.,2003,27(1):55-77；www.imgt.org)。如本文所用，术语“抗体”表示常规抗体及其片段，以及单域抗体及其片段，特别是单域抗体的可变重链，以及嵌合抗体，人源化抗体，双特异性抗体或多特异性抗体。术语“人源化抗体”是指全部或部分为非人来源的抗体，其被修饰以置换某些氨基酸，特别是在重链和轻链的框架区中，以避免或最小化人的免疫反应。人源化抗体的恒定域大部分是人ch和cl域。用于人源化抗体序列的许多方法是本领域已知的；参见例如almagro&fransson(2008)frontbiosci.13:1619-1633的综述。一种常用的方法是cdr移植或抗体整形，其涉及将供体抗体(通常为小鼠抗体)的cdr序列移植到不同特异性的人抗体的框架骨架中。由于cdr移植可以降低移植了cdr的非人抗体的结合特异性和亲和力，并因此降低其生物学活性，所以可以在移植有cdr的抗体的选定位置引入回复突变，以便保持亲本抗体的结合特异性和亲和力。使用文献和抗体数据库中可获得的信息来确定可能的回复突变的位置。作为回复突变的候选物的氨基酸残基通常是位于抗体分子表面的氨基酸残基，而被掩埋或具有低表面暴露程度的残基通常不会改变。cdr移植和回复突变的可供选择的人源化技术是表面重塑(resurfacing)，其中保留了非人来源的非表面暴露残基，而表面残基被改变为人残基。另一种可供选择的技术被称为“引导选择”(jespers等(1994)biotechnology12,899)，并且可用于从例如鼠或大鼠抗体衍生出完全人抗体，其保有亲本抗体的表位和结合特征。人源化的另一种方法是所谓4d人源化。在专利申请us20110027266a1(wo2009032661a1)中描述了4d人源化方案，并且在以下将4d人源化应用于将大鼠抗体可变轻链(vl)和重链(vh)结构域人源化的示例中进行了示例。在一个实例中，使用pdb结构(berman等,nucleicacidsresearch,2000,28:235-242)，通常使用moe软件(v.2011.10-chemicalcomputinggroup,quebec,canada)进行大鼠抗体同源性模型作为模板，随后使用moe中实施的标准程序进行能量最小化。然后对大鼠抗体的最小化的3d同源性模型(用moe软件进行)进行分子动力学(md)模拟，并与例如由lgcr/sdi设计并且在moe内可用的来源于七种代表性轻链(vk1，vk2，vk3，vk4，vλ1，vλ2，vλ3)和七种代表性重链(vh1a，vh1b，vh2，vh3，vh4，vh5，vh6)的49种人模型相比。例如，对于“4d人源化”，已经选择了具有最佳疏水性，静电组分和cdr之外的序列同一性的一个链对(vkx-vhx)模型。对于大鼠抗体可变域和所选模型之间的成对关联，通常基于相应同源性模型的α碳的最佳3d叠加来对序列进行比对。然后考虑并突变不想要的基序。最后，将所得到的人源化序列与例如iedb数据库(http://www.immuneepitope.org；版本2012/01/30本地可获取)进行序列相似性的blast比对，以确保没有一个序列含有任何已知的列出的b细胞或t细胞表位。对于嵌合抗体，人源化通常涉及可变区序列的框架区的修饰。作为cdr的一部分的氨基酸残基通常不会与人源化相关地改变，尽管在某些情况下可能需要改变单个cdr氨基酸残基，例如去除糖基化位点，脱酰胺位点或不需要的半胱氨酸残基。通过将寡糖链连接到三肽序列asn-x-ser或asn-x-thr中的天冬酰胺残基而发生n-连接的糖基化，其中x可以是pro以外的任何氨基酸。通过将asn或ser/thr残基突变成不同的残基，特别是通过保守取代，来实现n-糖基化位点的去除。天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺可以根据ph和表面暴露等因素而发生。天门冬酰胺残基特别易于脱酰胺化，其主要是当存在于asn-gly序列中时，以及在较小程度上存在于其它二肽序列如asn-ala中时。因此当这样的脱酰氨基化位点(特别是asn-gly)存在于cdr序列中时，去除该位点是合意的，其通常通过保守取代进行，以去除涉及的残基之一。在cdr序列中进行取代以去除涉及的残基之一也意在涵盖于本发明中。(常规)抗体的“片段”包含完整抗体的一部分，特别是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括由抗体片段形成的fv，fab，f(ab')2，fab'，dsfv，(dsfv)2，scfv，sc(fv)2，双抗体，双特异性和多特异性抗体。常规抗体的片段也可以是单域抗体，例如重链抗体或vhh。术语“fab”表示具有50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中约一半的h链和整个l链的n-末端侧(连同用木瓜蛋白酶处理igg得到的其他片段)通过二硫键结合在一起。本发明上下文中使用的术语“fc域”包括天然的fc和fc变体以及如上定义的序列。与fc变体和天然fc分子一样，术语“fc域”包括单体或多聚体形式的分子，无论其是从完全抗体消化还是通过其他方式产生。本文所用的术语“天然fc”是指包含由抗体消化或由其他方式产生的非抗原结合片段的序列的分子，无论其是单体形式还是多聚体形式，并且可包含铰链区。天然fc的原始免疫球蛋白来源是特别是人源，并且可以是任何免疫球蛋白，尽管igg1和igg2是优选的。天然fc分子由可通过共价(即二硫键)和非共价缔合连接成二聚或多聚体形式的单体多肽组成。天然fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目根据类别(例如igg，iga和ige)或亚类(例如igg1，igg2，igg3，iga1和igga2)其范围为1至4。天然fc的一个实例是由igg的木瓜蛋白酶消化产生的二硫键连接的二聚体。本文所用的术语“天然fc”是单体，二聚和多聚体形式的通称。本文所用的术语“fc变体”是指从天然fc修饰但仍包含补救受体fcrn(新生儿fc受体)的结合位点的分子或序列。示例性fc变体及其与补救受体的相互作用是本领域已知的。因此，术语“fc变体”可以包含从非人天然fc人源化的分子或序列。此外，天然fc包含可以被去除的区域，因为所述区域提供本发明的抗体样结合蛋白所不需要的结构特征或生物学活性。因此，术语“fc变体”缺乏影响或涉及如下的一个或多个天然fc位点或残基的分子或序列，或其中影响或涉及如下的一个或多个fc位点或残基被修饰的分子或序列：(1)二硫键形成，(2)与所选择的宿主细胞不相容性，(3)在选择的宿主细胞中表达时的n端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)与除补救受体外的fc受体的结合，或(7)抗体依赖性细胞毒性(adcc)。术语“双特异性抗体”或“bsab”通常表示在单个分子内组合了两种抗体的抗原结合位点的抗体。因此，bsab能够同时结合两种不同的抗原。遗传工程以增加的频率被用于设计，修饰和产生抗体或抗体衍生物，所述抗体或抗体衍生物具有例如ep2050764a1中所述的结合性质和效应功能的所需集合。本文中的术语“抗体样结合蛋白”是指能够同时结合两种不同抗原的多肽或结合蛋白(如双特异性抗体)。然而，与本文定义的常规抗体不同，抗体样结合蛋白包含多于6个cdr。本发明的抗体样结合蛋白为本文下文定义的codv形式，如下文“抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白”一节中所进一步定义的。本发明上下文中的“codv形式”是指双特异性抗体或多特异性抗体的交叉双重可变(codv)构型。codv形式允许可变域的互换性并保留折叠和最终结合亲和力。codv形式已描述于此前在国际专利申请wo2012/135345和steinmetz等中(mabs.2016jul；8(5):867-78)。本文所用的术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域之间的一个或多个氨基酸残基，其为轻链和重链的结构域提供足够的机动性以折叠成交叉双重可变区免疫球蛋白。在一些实施方案中，接头由0个氨基酸组成，意指不存在接头。接头在序列水平上插入到可变域之间的过渡处或分别插入可变域与恒定域之间的过渡处。可以鉴定结构域之间的过渡，因为充分理解免疫球蛋白结构域的近似大小。可以通过定位不形成次级结构元件如β-折叠或α-螺旋的肽段来确定结构域过渡的精确位置，如通过实验数据所证明的，或者可以通过建模或二级结构预测技术来假设。在本发明的上下文中描述的接头是接头l1，l2，l3，l4和l5。l1位于n端vd1域和vd2域之间；l2位于vd2和c端cl域之间。接头l3和l4位于根据抗体样蛋白的[iii]式定义的多肽上。更准确地说，l3位于n端vd3和vd4域之间，l4位于vd4和c端ch1-fc域之间。l5位于cl和n末端fc2之间。接头l1，l2，l3，l4和l5是独立的，但在一些实施方案中，它们具有相同的序列和/或长度。接头l1，l2，l3，l4和l5如上文在本发明的抗体样结合蛋白的上下文中所定义。在本发明的抗体样结合蛋白的变体中可能出现的可选接头进一步描述于“抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白的变体”一节中。“rf突变”通常是指在fc域的ch3域中的氨基酸hy变为rf的突变，例如由jendeberg,l.等描述的ch3域中的突变h435r和y436f(1997,j.immunologicalmeth.,201:25-34)，并且被描述为利于纯化目的，因为其消除与蛋白a的结合。在本发明的上下文中，rf突变例如指的是seqidno:67，68，71或70的位置x6和x7，其中当x6是氨基酸r而x7是氨基f时存在rf突变。在一个实例中，rf突变是指seqidno:69的fc段(fc3)中的位置215-216处的氨基酸hy被取代为rf(抗体样结合蛋白codv-fab-ol1-节x穴-rf的fc3)或在序列seqidno:79的fc区220-221位的hy突变为rf(抗体样结合蛋白codv-fab-tl1-节x穴-rf的fc区)，如下文“抗体样结合蛋白”一节中进一步描述的。“节-入-穴”或称为“节-入-穴”技术是指在ch3-ch3接口中的突变y349c，t366s，l368a和y407v(穴)和s354c和t366w(节)，以促进异多聚体形成，这已经描述于专利us5731168和us8216805中，具体地，其通过提述并入本文。在本发明的上下文中，“节”突变例如指的是例如seqidno:66或62的位置x2和x3的突变，其中当x2为c且x3为w时存在节突变。在一个实例中，节突变是指seqidno:66的fc(抗体样结合蛋白codv-fab-ol1a“hz20g6xhz7g3”和codv-fab-ol1-节x穴-rf的fc)中的取代s139c和t151w。在本发明的上下文中，“穴”突变指的是例如seqidno:75的x1，x3，x4和x5的突变，其中当x1为c，x3为s，x4为a，x5为v时存在“穴”突变。在一个实例中，穴突变是指seqidno:75的fc(抗体样结合蛋白codv-fab-tl1节-rfx穴和codv-fab-tl1-节x穴的fc)中的取代y134c，t151s，l153a，y192v。“lala突变”是指消除fc效应功能的双突变l234a和l235a。fc双突变体l234a和l235a不结合fcγr或c1q，且igg1亚类的fc域的adcc和cdc功能二者都被消除(hezareh,m.等，jvirol.2001dec；75(24)：12161-12168)。然而，在本发明的上下文中，当提及双突变l234a和l235a时，如本文所定义的fc域中的对应位置可能不同。然而，本领域技术人员可以容易地鉴定fc域中的对应位置(即式[iii]中的fc，式[iv]中的fc2和/或fc3)。在一个实例中，双突变l234a和l235a对应于序列seqidno:60的fc的双突变l19a和l20a，或者换言之对应于seqidno:59的codv-fab-tl1-rf的式[iv]的多肽中的突变l359a和l358a。“纯化的”和“分离的”是指当提及多肽(即本发明的抗体)或核苷酸序列时，所指的分子在基本上不存在相同类型的其它生物大分子的情况下存在。本文所用的术语“纯化”具体是指存在相同类型的生物大分子的至少75％，85％，95％或98％的重量。编码特定多肽的“分离的”核酸分子是指基本上不含不编码主题多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，分子可以包括一些额外的碱基或部分，其不会有害地影响组合物的基本特征。本文所用的术语“抗原”或“靶抗原”是指能够被抗体或抗体样结合蛋白结合的分子或分子的一部分。该术语还指能够用于动物以产生能够结合该抗原表位的抗体的分子或一部分分子。靶抗原可以具有一个或多个表位。关于由抗体或由抗体样结合蛋白识别的每个靶抗原，抗体样结合蛋白能够与识别靶抗原的完整抗体竞争。“亲和力”在理论上被定义为完全抗体与抗原之间的平衡缔合。亲和力可以例如表示为半最大有效浓度(ec50)或平衡解离常数(kd)。“半最大有效浓度”也称为“ec50”是指在指定的暴露时间后，引起基线和最大值之间中点响应的药物、抗体或毒物的浓度。ec50与亲和力是负相关的，ec50值越低抗体的亲和力越高。“kd”是平衡解离常数，是抗体与其抗原之间的k脱离/k结合(koff/kon)之比。kd和亲和力是负相关的。kd值与抗体的浓度有关，kd值越低，抗体的亲和力越高。亲和力可以通过各种已知方法进行实验评估，例如在免疫化学测定(elisa，流式细胞术)中测量表面等离子体共振或测量ec50的缔合和解离速率。酶联免疫吸附测定(elisa)是一种生物化学测定法，其使用固相酶免疫分析法检测液体样品或湿样品中物质(通常为抗原)的存在。来自样品的抗原附着于表面。然后，在表面上涂覆另外的特异性抗体，使其能够结合抗原。将该抗体与酶连接，并且在最终步骤中加入含有酶底物的物质。随后的反应产生可检测的信号，最常见的是底物中的颜色变化。流式细胞术提供了一种基于特定的光散射和荧光特征或每个细胞的特定荧光标记分析单细胞水平上的生物细胞的异质混合物的方法。在这些测定中，ec50是在一定浓度的通过elisa(酶联免疫吸附测定)的抗原或通过流式细胞术的表达抗原的细胞上一定的特定的暴露时间后诱导基线和最大值之间中点响应的抗体的浓度。表面等离子体共振是一种无标记的方法，其中直接测量可溶性相中的分子(“分析物”)的结合到固定在传感器表面上的“配体”分子。在传感器装置中，通过称为表面等离子体的光学现象监测配体的结合。具体而言，当“分析物”分子从“配体”分子解离时，观察到spr信号的降低(以共振单位ru表示)。从缔合和解离期间获得的信号获得缔合(‘结合速率’，ka)和解离速率(‘脱离速率’，kd)，并且可从其计算平衡解离常数(‘结合常数’，kd)。以共振单位(ru)给出的信号取决于分析物中存在的配体的大小，然而在实验条件相同的情况下，即在相同条件下配体是相同的分子，所获得的ru可表示亲和力，其中ru中获得的信号越高，结合越高。当两个抗原的ec50在相似范围内时，与抗原1(ag1)结合的单克隆抗体与抗原2(ag2)“交叉反应”。在本申请中，当ag2的亲和力与ag1的亲和力的比例等于或小于10(特别是5，2，1或0.5)时，与ag1结合的单克隆抗体与ag2交叉反应，对于两种抗原其亲和力用相同的方法测量。当两种抗原的亲和力非常不同时，与ag1结合的单克隆抗体与ag2“不显著交叉反应”。如果结合反应太低，ag2的亲和力可能无法测量。在本申请中，在相同实验条件下和相同抗体浓度处，当单克隆抗体对ag2的结合反应低于同一单克隆抗体对ag1的结合反应的5％时，则结合ag1的单克隆抗体与ag2不显著交叉反应。实际上，使用的抗体浓度可以是达到用ag1获得的饱和稳定水平所需的ec50或浓度。如本文所用，“特异性”表示抗体区分其结合的靶肽序列(“表位”)与密切相关的高度同源的肽序列的能力。当不与ag2显著交叉反应时，单克隆抗体“特异性地”结合ag1。术语“t细胞的活化”或“t细胞活化”是指引发涉及细胞毒性颗粒融合，瞬时细胞因子释放和增殖的cd3信号传输。本发明的抗体样结合蛋白靶向cd3ε并在靶细胞存在下活化t细胞；该活性也称为“t细胞接合效应”。t细胞接合效应诱导靶细胞中的细胞毒性。如本领域技术人员已知的，t细胞的激活诱导表面标志物如cd69和cd25的表达。因此，可以通过检测和测量cd4+/cd25+，cd4+/cd69+，cd8+/cd25+，或cd8+/cd69+t细胞的表达来测量t细胞的活化。测量t细胞活化的方法是本领域技术人员已知的。在实施例部分(实施例2.9)中进一步公开了测量t细胞活化的方法。因此，在本发明的上下文中，t细胞活化以如下测量：总细胞数％中表达cd69的细胞的百分数，或总细胞数％中表达cd4和cd69的细胞的百分数，或总细胞数％中表达cd8和cd69的细胞的百分数。本发明的抗体样结合蛋白的上下文中的“低t细胞活化”是指小于20％，小于18％，小于16％，小于14％，小于12％，小于10％的t细胞活化。本文中的“靶细胞”是指表达第二抗原的细胞，在一个实例中，本文中的靶细胞是指表达cd123的细胞例如thp-1细胞。“高t细胞活化”是指高于50％，高于55％，高于60％，高于62％，高于64％，高于66％，高于68％，高于70％的t细胞活化。本文中的“细胞毒性”是指化合物(如本发明的抗体样结合蛋白)对细胞有毒性的性质。可以通过不同的作用机制诱导细胞毒性，因此可以分为细胞介导的细胞毒性，凋亡，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指细胞介导的免疫防御的机制，其中免疫系统的效应细胞主动地裂解靶细胞，所述靶细胞的膜表面抗原已被特异性抗体或本发明的抗体样结合蛋白结合。在本发明的上下文中，“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指在补体系统蛋白存在下对靶细胞的裂解。“细胞介导的细胞毒性”是指效应淋巴细胞如细胞毒性t淋巴细胞或天然杀伤细胞对靶细胞的细胞裂解，因此可以区分为t细胞介导的细胞毒性和nk细胞细胞毒性。“结构域”可以是蛋白质的任何区域，通常基于序列同源性定义并且通常与特定结构或功能实体有关。“重组”分子是通过重组方法制备，表达，产生或分离的分子。术语“基因”是指编码或对应于包含一种或多种蛋白质或酶的全部或部分的具体氨基酸序列的dna序列，并且可以包括或可以不包括调节性dna序列，例如启动子序列，其决定例如基因表达的条件。一些不是结构基因的基因可能从dna转录成rna，但不能翻译成氨基酸序列。其他基因可以作为结构基因的调节元件或作为dna转录的调节元件发挥作用。具体地，术语“基因”可以用于指编码蛋白质的基因组序列，即包含调节元件，启动子，内含子和外显子序列的序列。“与参考序列至少85％相同的”序列是其全长与参考序列全长具有85％或更多，特别是90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列。在本申请的上下文中，使用全局配对比对(即两个序列在其全长上进行比较)来计算“同一性百分比”。用于比较两个或多个序列的同一性的方法是本领域公知的。可例如使用“针(needle)”程序，其使用needleman-wunsch全局比对算法(needleman和wunsch，1970j.mol.biol.48：443-453)以在考虑两个序列的全长时找到它们的最佳比对(包括缺口)。针程序例如可在万维网ebi.ac.uk上找到。根据本发明，两个多肽之间的同一性的百分比使用emboss：针(全局)程序和blosum62矩阵计算，其中“缺口开放”参数等于10.0，“缺口延伸”参数等于0.5。与参考序列相比，由与参考序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的“氨基酸序列”组成的蛋白可能包含突变，如缺失，插入和/或取代。在取代的情况下，由与参考序列的至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的氨基酸序列组成的蛋白可以对应于来源于与参考序列不同的另一个物种的同源序列。“氨基酸取代”可以是保守的或非保守的。优选地，取代是保守取代，其中一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。取代优选地对应于如下表所示的保守取代。保守取代氨基酸类型ala,val,leu,lle,met,pro,phe,trp具有脂族疏水侧链的氨基酸ser,tyr,asn,gln,cys具有不带电荷但有极性的侧链的氨基酸asp,glu具有酸性侧链的氨基酸lys,arg,his具有碱性侧链的氨基酸gly中性侧链术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指将dna或rna序列(例如外来基因)引入宿主细胞的载体，以便转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)。术语“转化”是指向宿主细胞引入“外源”(即外源性)基因，dna或rna序列，使得宿主细胞表达引入的基因或序列以产生所需物质，通常为由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接收并表达引入的dna或rna的宿主细胞被“转化”。术语“表达系统”是指在合适条件下的宿主细胞和相容的载体，例如用于表达由载体携带并引入宿主细胞的外源dna编码的蛋白。本文所用的术语“药物组合物”或“治疗组合物”是指在适当施用于患者时能够诱导所需治疗效果的化合物或组合物。“药学上可接受的”或“药学上可接受的”是指在适当地施用于哺乳动物(特别是人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。“药学上可接受的载剂”或赋形剂是指任何类型的无毒固体，半固体或液体填充剂，稀释剂，包封材料或制剂助剂。如本文所用，术语“受试者”表示哺乳动物，例如啮齿动物，猫科动物，犬科动物和灵长类动物。具体地，根据本发明的受试者是人。术语“受试者”或“个体”可互换使用，并且可以是例如人或非人哺乳动物。例如，受试者是蝙蝠；白鼬；兔子；猫科动物(猫)；犬科动物(狗)；灵长类动物(猴)，马科动物(马)；人，包括男人，女人和儿童。在本发明的上下文中，术语“治疗”或“治疗”是指治疗用途(即针对具有给定疾病的受试者)，并且意指逆转，减轻，抑制此类病症或病状的一种或多种症状的进展。因此，治疗不仅指导致疾病完全治愈的治疗，而且还涉及减缓疾病进展和/或延长受试者存活的治疗。“预防”是指预防用途(即针对易于患上给定疾病的受试者)。术语“需要治疗”是指已经患有疾病的受试者以及要预防疾病的受试者。术语“治疗有效量”的抗体样结合蛋白或其药物组合物是指以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比治疗所述癌症的足够的抗体样结合蛋白的量。然而，应当理解，本发明的多肽和组合物的总日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用的特异性多肽的活性；使用的具体组合物，患者的年龄，体重，一般健康状况，性别和饮食；施用时间，施用途径和所用具体多肽的排出速率；治疗的持续时间；与所使用的具体多肽组合使用的药物或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。例如，本领域技术人员众所周知的是以低于实现所需治疗效果所需的水平开始化合物的给药，并逐渐增加剂量直到达到期望的效果。“复发”定义为完全缓解后aml复发。“完全缓解”或“cr”定义如下：正常值的嗜中性粒细胞(>1.0*109/l)，血红蛋白水平为10g/dl和血小板计数(>100*109/l)且不需要红细胞输血；胚细胞少于5％，无胚细胞聚簇或聚集，并且在骨髓检查中不存在auer杆(rods)；和血细胞正常成熟(形态学，骨髓瘤)和无髓外白血病。“白血病干细胞(lsc)”是具有与正常干细胞相关的特征的癌细胞，即自我更新的性质和发展多种谱系的能力。提出这样的细胞在血液学癌症例如aml中以不同群体持续存在。aml患者的lcs被称为“aml-lcs”。“急性骨髓性白血病(aml)”是一种临床表现为异种和未分化骨髓成髓细胞增殖增加的克隆性疾病。白血病分层(hierarchy)由少量的lsc(aml-lcs)维持，其具有独立的自我更新能力，并且能够分化为白血病祖细胞。这些祖细胞在诊断和复发的患者中产生大量易发现的白血病细胞(leukemicblasts)，最终导致死亡。通常将aml-lsc报告为静止细胞，与快速分裂的克隆形成型祖细胞相反。aml-lsc的这一特性使靶向增殖细胞的常规化学治疗药物效果较差，这潜在解释了当前经验，即高比例的aml患者进入完全缓解，但几乎总是复发，而<30％的成年人存活超过4年。此外，微小残留病的发生和生存率差归因于aml患者在诊断时的lsc频率高。因此，长期管理aml(类似地以及其他上述血液癌症病症)，必须开发出新的治疗方案来专门消除lsc。已经报道cd123对于aml母细胞和对于cd34+/cd38aml-lsc相对于正常造血细胞的过表达。抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白出于简要目的，在本申请全文中，“抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白”或“本发明的抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白”可以称为“抗体样结合蛋白”或“本发明的抗体样结合蛋白”。这些抗体样结合蛋白具有codv设计。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白呈codv形式，如此前在国际专利申请wo2012/135345中描述的那样，其通过提述并入本文。在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白是如此前在国际专利申请wo2012/135345中所述的codv形式，其中轻链用另外的fc域延长。每条轻链和重链都包含一个fc域。本发明的抗体样结合蛋白是codv-fab-tl1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白。在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白是如此前在国际专利申请wo2012/135345中所述的codv形式，其中存在额外的fc域。重链包含fc域，但轻链不包含。本发明的抗体样结合蛋白是codv-fab-ol1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合人cd3ε和人cd123的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中一条多肽链具有如式[i]所示的结构：vd1-l1-vd2-l2-cl[i]而一条多肽链具有如式[iii]所示的结构：vd3-l3-vd4-l4-ch1-fc[iii]其中：a)一个式[i]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:55，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，序列seqidno:18的cl，或与seqidno:55至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr是不变的；且b)一个式[iii]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:67，其包含序列seqidno:9的vd3，由0个氨基酸组成的l3，序列seqidno:52的vd4，由0个氨基酸组成的l4，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:68的fc，其中x1是y或c，x2是s或c，x3是t，s或w，x4是a或l，x5是v或y，x6是h或r，且x7是y或f，或与seqidno:67至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr是不变的，且seqidno:67的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上文中定义，且其中式[i]的多肽和式[iii]的多肽形成交叉轻链-重链对。在一个实施方案中，本文如上定义的抗体样结合蛋白不包括这样的抗体样结合蛋白，其中式[iii]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:67，其包含序列seqidno:9的vd3，由0个氨基酸组成的l3，序列seqidno:52的vd4，由0个氨基酸组成的l4，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:68的fc，其中x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y，x6是h，且x7是y，和/或本文如上定义的抗体样结合蛋白不包括这样的抗体样结合蛋白，其中式[iii]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:67，其包含序列seqidno:9的vd3，由0个氨基酸组成的l3，序列seqidno:52的vd4，由0个氨基酸组成的l4，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:68的fc，其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y，x6是h且x7是y，或x6是r且x7是f。因此，在一个实施方案中，本文如上定义的抗体样结合蛋白不包括这样的抗体样结合蛋白，其中式[iii]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:59，和/或本文如上定义的抗体样结合蛋白不包括这样的抗体样结合蛋白，其中式[iii]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:61或seqidno:65。在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白不包含：a)一个式[iv]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:57组成；和一个式[iii]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:59组成；和/或b)一个式[i]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:55组成；和一个式[iii]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:61，以及seqidno:63的多肽fc段(fc3)组成；和/或c)一个式[i]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:55组成；和一个式[iii]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:65，以及seqidno:64的多肽fc段(fc3)组成。抗体样结合蛋白被称为“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白，因为多肽[i]包含分别为人源化抗cd123抗体“7g3”(也称为“hz7g3”)和人源化抗cd3抗体“20g6”(也称为“hz20g6”)的轻链的可变域的vd1和vd2，多肽[iii]包含分别为人源化抗cd3抗体“20g6”(也称为“hz20g6”)和人源化抗cd123抗体“7g3”(也称为“hz7g3”)的重链可变域的vd3和vd4。更具体地，抗体样结合蛋白被称为“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白，因为具有由式[i]表示的结构的多肽链包含序列seqidno:54的vd1，其为人源化抗cd123抗体“7g3”(也称为“hz7g3”)的轻链可变域，和序列seqidno:10的vd2，其是人源化抗cd3抗体“20g6”的轻链可变域氨基酸序列vl1c，而具有由式[iii]表示的结构的多肽链包含序列seqidno:9的vd3，其是人源化抗cd3抗体“20g6”的重链可变域变体，以及序列seqidno:52的vd4，其是人源化抗cd123抗体“7g3”(也称为“hz7g3”)的变体重链可变域。如上文定义的，具有如式[iii]所示结构的多肽链包含序列seqidno:68的fc，其中x1是y或c，x2是s或c，x3是t，s或w，x4是a或l，x5是v或y，x6是h或r且x7是y或f。本领域技术人员会理解，seqidno:68的fc序列-其中x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y且x6是h且x7是y是seqidno:60的所谓的野生型fc序列，且-其中x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y且x6是r且x7是f是包含rf突变的fc序列，且-其中x1是c，x2是s，x3是s，x4是a，x5是v且x6是h且x7是y是包含如本文上文“定义”一节所定义的穴突变的fc序列且产生seqidno:75的fc域，且-其中x1是c，x2是s，x3是s，x4是a，x5是v且x6是r且x7是f是包含穴突变和rf突变的fc序列，如本文上文所定义的，且产生seqidno:79的fc域，且-其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y且x6是h且x7是y是包含节突变的fc序列，如本文上文“定义”一节所定义的，且产生seqidno:66的fc域，且-其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y且x6是r且x7是f是包含节突变和rf突变的fc序列，如本文上文“定义”一节所定义的，且产生seqidno:62的fc域。进一步理解的是，根据一般定义在任何fc域(即seqidno:68的fc和seqidno:70的fc和fc2域(seqidno:70的fc2域在下文进行介绍))中x1是y或c，x2是s或c，x3是t,s或w，x4是a或l，x5是v或y，x6是h或r且x7是y或f，该一般定义在所有实施方案中可以用另一定义替换，其中x1是y或c，x2是s或c，x3是t，s或w，x4是a或l，x5是v或y，x6是h或r且x7是y或f，根据所述另一定义：-x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y(对应于野生型)，或-x1是c，x2是s，x3是s，x4是a，x5是v(对应于“穴”突变)，或-x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y(对应于“节”突变)，且-x6是h且x7是y(对应于野生型)，或-x6是r且x7是f(对应于“rf”突变)。因此，为了进一步例示，在一个实施方案中，本发明是指特异性结合至人cd3ε和cd123的人抗体样结合蛋白，其包含形成2个抗原结合位点的2条多肽链，其中一条多肽链具有如式[i]所示的结构：vd1-l1-vd2-l2-cl[i]而一条多肽链具有如式[iii]所示的结构：vd3-l3-vd4-l4-ch1-fc[iii]其中a)一个式[i]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:55，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，序列seqidno:18的cl，或与seqidno:55至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr是不变的；且b)一个式[iii]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:67，其包含序列seqidno:9的vd3，由0个氨基酸组成的l3，序列seqidno:52的vd4，由0个氨基酸组成的l4，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:68的fc，其中x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y，或x1是c，x2是s，x3是s，x4是a，x5是v，或x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y，且x6是h且x7是y，或x6是r且x7是f，或与seqidno:67至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr是不变的，且seqidno:67的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上文中定义，且其中式[i]的多肽和式[iii]的多肽形成交叉轻链-重链对。在进一步的实施方案中，向所述抗体样结合蛋白codv-fab的式[i]的多肽添加第二fc域(称为fc2)。因此，在一个实施方案中，式[i]的多肽进一步包含fc域(fc2)。在相同的实施方案中，在式[i]的多肽链的fc2域和cl之间存在接头l5，产生式[iv]的多肽链。在一个具体实施方案中，式[i]的多肽进一步包含seqidno:70的fc2域，其中x1是y或c，x2是s或c，x3是t，s或w，x4是a或l，x5是v或y，x6是h或r且x7是y或f。因此，本发明进一步是指抗体样结合蛋白，其包含形成2个抗原结合位点的2条多肽链，其中一条多肽链具有如式[iv]所示的结构：vd1-l1-vd2-l2-cl-l5-fc2[iv]且一条多肽链具有如式[iii]所示的结构：vd3-l3-vd4-l4-ch1-fc[iii]其中：a)一个式[iv]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:71，其包含如上文针对式[i]所示多肽所定义的vd1，l1，vd2，l2，cl，以及由0个氨基酸组成的l5，和由序列seqidno:70组成的fc2，其中x1是y或c，x2是s或c，x3是t，s或w，x4是a或l，x5是v或y，x6是h或r且x7是y或f，或与seqidno:71至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr是不变的，且所述如式[iv]所示的多肽链中的所述seqidno:71中的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上文所定义；b)一个式[iii]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:67，其包含序列seqidno:9的vd3，由0个氨基酸组成的l3，序列seqidno:52的vd4，由0个氨基酸组成的l4，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:68的fc，其中x1是y或c，x2是s或c，x3是t，s或w，x4是a或l，x5是v或y，x6是h或r，且x7是y或f，或与seqidno:67至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr是不变的，且所述seqidno:67的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上文所定义，且其中式[iv]的多肽和式[iii]的多肽形成交叉轻链-重链对。由式[iii]和[iv]表示的多肽链通过它们各自的fc2和fc区进行二聚化的这种codv格式在本文中称为codv-fab-tl。在相关的实施方案中，本文如上定义的抗体样结合蛋白不包含抗体样结合蛋白，其中a)式[iv]的多肽由氨基酸序列seqidno:71组成，其包含如上文针对式[i]所示的多肽链定义的vd1，l1，vd2，l2和cl，以及由0个氨基酸组成的l5，和序列seqidno:70的fc2，其中x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y，x6是r且x7是f，且b)式[iii]的多肽由氨基酸序列seqidno:67组成，其包含序列seqidno:9的vd3，由0个氨基酸组成的l3，序列seqidno:52的vd4，由0个氨基酸组成的l4，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:68的fc，其中x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y，x6是h，且x7是y。因此，在一个实施方案中，本文如上定义的抗体样结合蛋白不包括这样的抗体样结合蛋白，其中a)式[iv]的多肽由氨基酸序列seqidno:57组成，且b)式[iii]的多肽由氨基酸序列eqidno:59组成。在进一步的相关实施方案中，本发明涉及特异性结合人cd3ε和人cd123的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中一条多肽链具有如式[vi]所示的结构：vd1-l1-vd2-l2-cl-l5-fc2[iv]而一条多肽链具有如式[iii]所示的结构：vd3-l3-vd4-l4-ch1-fc[iii]其中：a)所述式[iv]的多肽由如下组成：(i)氨基酸序列seqidno:71，其包含：·序列seqidno:54的vd1，·序列seqidno:56的l1，·序列seqidno:10的vd2，·序列seqidno:56的l2，·序列seqidno:18的cl，·l5由0个氨基酸组成，且·fc2由序列seqidno:70组成·其中x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y且x6是h且x7是y，或·其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y且x6是h且x7是y，或·其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y且x6是r且x7是f，或(ii)与seqidno:71至少85％相同的序列，其中·序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr是不变的，且·序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr是不变的，且·seqidno:71中的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上述a)(i)中定义；b)所述式[iii]的多肽由如下组成：(i)氨基酸序列seqidno:67，其包含：·序列seqidno:9的vd3，·由0个氨基酸组成的l3，·序列seqidno:52的vd4，·由0个氨基酸组成的l4，·序列seqidno:19的ch1，和·由序列seqidno:68组成的fc，其中x1是y或c，x2是s或c，x3是t，s或w，x4是a或l，x5是v或y，x6是h或r，且x7是y或f，或(ii)与seqidno:67至少85％相同的序列，其中·序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr是不变的，且·序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr是不变的，且·seqidno:67的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上述b)(i)中定义，且其中式[iv]的多肽和式[iii]的多肽形成交叉轻链-重链对。在进一步的相关实施方案中，本发明涉及抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中一条多肽链具有如式[vi]所示的结构：vd1-l1-vd2-l2-cl-l5-fc2[iv]而一条多肽链具有如式[iii]所示的结构：vd3-l3-vd4-l4-ch1-fc[iii]其中：a)一个式[iv]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:71，其包含如上文针对式[i]所示多肽所定义的vd1，l1，vd2，l2，和cl，以及由0个氨基酸组成的l5，和序列seqidno:70的fc2，其中其中x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y且x6是h且x7是y，或其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y且x6是h且x7是y，或其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y且x6是r且x7是f，与seqidno:71至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr是不变的，且所述如式[iv]所示的多肽链中的所述seqidno:71中的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上文所定义；b)一个式[iii]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:67，其包含序列seqidno:9的vd3，由0个氨基酸组成的l3，序列seqidno:52的vd4，由0个氨基酸组成的l4，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:68的fc，其中x1是y或c，x2是s或c，x3是t，s或w，x4是a或l，x5是v或y，x6是h或r，且x7是y或f，或与seqidno:67至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr是不变的，且所述seqidno:67的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上文所定义，且其中式[iv]的多肽和式[iii]的多肽形成交叉轻链-重链对。本领域技术人员会理解，当fc域为野生型序列或携带节突变时，其他fc域是野生型的或是携带穴突变的。因此，在一个进一步地相关实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白包含a)一个式[iv]的多肽，其由如下组成：氨基酸序列seqidno:71，其包含如上文定义的vd1，l1，vd2，l2，和cl，以及由0个氨基酸组成的l5，和序列seqidno:70的fc2，其中其中x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y且x6是h且x7是y，或其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y且x6是h且x7是y，或其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y且x6是r且x7是f，和b)一个式[iii]的多肽，其由如下组成：氨基酸序列seqidno:67，其包含序列seqidno:9的vd3，由0个氨基酸组成的l3，序列seqidno:52的vd4，由0个氨基酸组成的l4，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:68的fc，其中x1是y，x2是s，x3是t，x4是l，x5是y，或x1是c，x2是s，x3是s，x4是a，x5是v，且x6是h且x7是y，或x6是r且x7是f。因此，在一个具体实施方案中，本发明进一步涉及抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中一条多肽链具有如式[vi]所示的结构：vd1-l1-vd2-l2-cl-l5-fc2[iv]而一条多肽链具有如式[iii]所示的结构：vd3-l3-vd4-l4-ch1-fc[iii]其中：a)一个式[iv]的多肽，其由如下组成：氨基酸序列seqidno:71，其包含如上文定义的vd1，l1，vd2，l2，和cl，以及由0个氨基酸组成的l5，和序列seqidno:70的fc2，其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y，且x6是h且x7是y，或x6是r且x7是f，或与seqidno:71至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr是不变的，且所述如式[iv]所示的多肽链中的所述seqidno:71中的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上文所定义；b)一个式[iii]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:67，其包含序列seqidno:9的vd3，由0个氨基酸组成的l3，序列seqidno:52的vd4，由0个氨基酸组成的l4，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:68的fc，其中x1是c，x2是s，x3是s，x4是a，x5是v，且x6是h且x7是y，或x6是r且x7是f，或与seqidno:67至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr是不变的，且所述seqidno:67的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上文所定义，且其中式[iv]的多肽和式[iii]的多肽形成交叉轻链-重链对。因此，在一个实施方案中，抗体样结合蛋白包含：a)式[iv]的多肽包含seqidno:81的fc域(fc2)或与seqidno:81至少85％相同的序列的fc域(fc2)，且式[iii]的多肽包含seqidno:60的fc域或与seqidno:60至少85％相同的序列的fc域，或b)式[iv]的多肽包含seqidno:73的fc域(fc2)或与seqidno:73至少85％相同的序列的fc域(fc2)，且式[iii]的多肽包含seqidno:75的fc域或与seqidno:75至少85％相同的序列的fc域，或c)式[iv]的多肽包含seqidno:77的fc域(fc2)或与seqidno:77至少85％相同的序列的fc域(fc2)，且式[iii]的多肽包含seqidno:75的fc域或与seqidno:75至少85％相同的序列的fc域，或d)式[iv]的多肽包含seqidno:77的fc域(fc2)或与seqidno:77至少85％相同的序列的fc域(fc2)，且式[iii]的多肽包含seqidno:79的fc域或与seqidno:79至少85％相同的序列的fc域。因此，在一个进一步的实施方案中，抗体样结合蛋白包含：i)式[iv]的多肽包含seqidno:73的fc域(fc2)或与seqidno:73至少85％相同的序列的fc域(fc2)，且式[iii]的多肽包含seqidno:75的fc域或与seqidno:75至少85％相同的序列的fc域，或ii)式[iv]的多肽包含seqidno:77的fc域(fc2)或与seqidno:77至少85％相同的序列的fc域(fc2)，且式[iii]的多肽包含seqidno:79的fc域或与seqidno:79至少85％相同的序列的fc域。在进一步的实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白选自下组的抗体样结合蛋白，其中：a)式[iv]的多肽包含seqidno:81的fc域(fc2)，且式[iii]的多肽包含seqidno:60的fc域，或b)式[iv]的多肽包含seqidno:73的fc域，且式[iii]的多肽包含seqidno:75的fc域，或c)式[iv]的多肽包含seqidno:77的fc域，且式[iii]的多肽包含seqidno:75的fc域，或d)式[iv]的多肽包含seqidno:77的fc域，且式[iii]的多肽包含seqidno:79的fc域。在进一步的实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白选自下组的抗体样结合蛋白，其中：i)式[iv]的多肽包含seqidno:73的fc域，且式[iii]的多肽包含seqidno:75的fc域，或ii)式[iv]的多肽包含seqidno:77的fc域，且式[iii]的多肽包含seqidno:79的fc域。在进一步的实施方案中，抗体样结合分子包含：a)一个式[iv]的多肽，其由如下组成：氨基酸序列seqidno:80，或与seqidno:80至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr及seqidno:80的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不变的；和一个式[iii]的多肽，其由如下氨基酸序列组成：seqidno:59，或与seqidno:59至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr及seqidno:59的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不变的；或b)一个式[iv]的多肽，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列seqidno:72，或与seqidno:72至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr及seqidno:72的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不变的；和一个式[iii]的多肽，其由如下氨基酸序列组成：seqidno:74，或与seqidno:74至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr及seqidno:74的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不变的；或c)一个式[iv]的多肽，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列seqidno:76，或与seqidno:76至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr及seqidno:76的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不变的；和一个式[iii]的多肽，其由如下氨基酸序列组成：seqidno:74，或与seqidno:74至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr及seqidno:74的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不变的；或d)一个式[iv]的多肽，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列seqidno:76，或与seqidno:76至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr及seqidno:76的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不变的；和一个式[iii]的多肽，其由如下氨基酸序列组成：seqidno:78，或与seqidno:78至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr及seqidno:78的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不变的。在进一步的实施方案中，抗体样结合蛋白包含：i)一个式[iv]的多肽，其由如下组成：氨基酸序列seqidno:72，或与seqidno:72至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr及seqidno:72的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不变的；和一个式[iii]的多肽，其由如下氨基酸序列组成：seqidno:74，或与seqidno:74至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr及seqidno:74的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不变的；或ii)一个式[iv]的多肽，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列seqidno:76，或与seqidno:76至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr及seqidno:76的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不变的；和一个式[iii]的多肽，其由如下氨基酸序列组成：seqidno:78，或与seqidno:78至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr及seqidno:78的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不变的。在进一步的实施方案中，抗体样结合蛋白包含：i)一个式[iv]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:80组成；和一个式[iii]的多肽，其由如下氨基酸序列seqidno:59组成；ii)一个式[iv]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:72组成；和一个式[iii]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:74组成；iii)一个式[iv]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:76组成；和一个式[iii]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:74组成；和iv)一个式[iv]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:76组成；和一个式[iii]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:78组成。在进一步的实施方案中，抗体样结合蛋白包含：a)一个式[iv]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:72组成；和一个式[iii]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:74组成；b)一个式[iv]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:76组成；和一个式[iii]的多肽，其由氨基酸序列seqidno:78组成。在一个实施方案中，如上文所定义的包含具有由式[i]表示的结构的一个多肽链和具有式[iii]所示结构的一个多肽链的抗体样结合蛋白还包含第三多肽链，其包含fc域(称为fc3)。本领域技术人员会理解，所述fc3域可被称为第二fc域，因为具有由式[iii]表示的结构的第二多肽包含第一fc域。因此，在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合人cd3ε和人cd123的抗体样结合蛋白，其包含形成2个抗原结合位点的3条多肽链，其中第一多肽链具有如式[i]所示的结构vd1-l1-vd2-l2-cl[i]且第二多肽链具有如式[iii]所示的结构：vd3-l3-vd4-l4-ch1-fc[iii]且第三多肽链是免疫球蛋白铰链区及免疫球蛋白的ch2，ch3免疫球蛋白重链恒定区；其中a)所述式[i]的多肽由如下组成：(i)氨基酸序列seqidno:55，其包含·序列seqidno:54的vd1，·序列seqidno:56的l1，·序列seqidno:10的vd2，·序列seqidno:56的l2，·序列seqidno:18的cl，或(ii)与seqidno:55至少85％相同的序列，其中·序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr是不变的，且·序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr是不变的；b)所述式[iii]的多肽由如下组成：(i)氨基酸序列seqidno:67，其包含·序列seqidno:9的vd3，·由0个氨基酸组成的l3，·序列seqidno:52的vd4，·由0个氨基酸组成的l4，·序列seqidno:19的ch1，和·序列seqidno:68的fc，其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y，且x6是h且x7是y，或x6是r且x7是f，或(ii)与seqidno:67至少85％相同的序列，其中·序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr是不变的，且·序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr是不变的，且·氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上述b)(i)中定义，且其中-式[i]的多肽和式[iii]的多肽形成交叉轻链-重链对，-式[iii]的多肽与第三多肽经由其fc域形成异二聚体-所述第三多肽fc3由seqidno:69组成或由seqidno:69至少85％相同的序列组成，其中seqidno:69的氨基酸位置129、146、148、187、215、216是不变的。因此，在一个实施方案中，本发明涉及抗体样结合蛋白，其包含形成2个抗原结合位点的3条多肽链，其中第一多肽链具有如式[i]所示的结构vd1-l1-vd2-l2-cl[i]且第二多肽链具有如式[iii]所示的结构：vd3-l3-vd4-l4-ch1-fc[iii]且第三多肽fc3(也称为“fc段”)是免疫球蛋白铰链区及免疫球蛋白的ch2，ch3免疫球蛋白重链恒定区；其中a)所述式[i]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:55，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，序列seqidno:18的cl，或与seqidno:55至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr是不变的；且b)一个式[iii]的多肽由如下组成：氨基酸序列seqidno:67，其包含序列seqidno:9的vd3，由0个氨基酸组成的l3，序列seqidno:52的vd4，由0个氨基酸组成的l4，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:68的fc，其中x1是y，x2是c，x3是w，x4是l，x5是y，x6是h且x7是y，或x6是r且x7是f，或与seqidno:67至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr是不变的，且所述氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7如上文中定义，且其中式[i]的多肽和式[iii]的多肽形成交叉轻链-重链对，且其中式[iii]的多肽与第三多肽经由其fc域形成异二聚体。因此，在所述实施方案中，所谓的“fc段”(fc3)与式[iii]的多肽的fc区异二聚化。该codv形式在此称为codv-fab-ol。该构造避免了codv-fab形式聚集。因此，在一个具体实施方案中，如上定义的抗体样结合蛋白的fc3域由seqidno:69组成。在相关实施方案中，根据本发明的抗体样结合蛋白包含-式[i]的多肽，其由如下组成：seqidno:55，或与seqidno:55至少85％相同的序列，其中序列seqidno:54的vd1的序列seqidno:48，‘was’和seqidno:49的3个cdr，以及序列seqidno:10的vd2的序列seqidno:11，‘kvs’和seqidno:8的3个cdr是不变的；和式[iii]的多肽，其包含序列seqidno:66的fc域，或与seqidno:59至少85％相同的序列，其中序列seqidno:52的vd4的序列seqidno:50，seqidno:53，和seqidno:51的3个cdr，以及序列seqidno:9的vd3的序列seqidno:5，seqidno:6，和seqidno:7的3个cdr及seqidno:66的氨基酸位置473、492、531、539、560、478、490是不变的；和-fc段(fc3)，其由如下组成：seqidno:69，或与seqidno:69至少85％相同的序列，其中seqidno:69的氨基酸位置129、146、148、187、215、216是不变的。在进一步的相关实施方案中，抗体样结合蛋白包含-一个由seqidno:55组成的式[i]的多肽，-一个由seqidno:65组成的式[iii]的多肽，和-fc段(fc3)，其由如下组成：seqidno:69，或与seqidno:69至少85％相同的序列，其中seqidno:69的氨基酸位置129、146、148、187、215、216是不变的。在进一步的相关实施方案中，抗体样结合蛋白包含-一个由seqidno:55组成的式[i]的多肽，-一个由seqidno:65组成的式[iii]的多肽，和-fc段(fc3)，其由seqidno:69或与seqidno:69至少85％相同的序列组成。在一些实施方案中，当抗体样结合蛋白含有两个fc域时，即在codv-fab-tl1抗体样结合蛋白(fc和fc2)，以及codv-fab-ol1抗体样结合蛋白(fc和fc3)中时，两个fc域属于相同的免疫球蛋白同种型或同种型亚型。因此，在一些实施方案中，codv-fab-tl1的fc和fc2二者，或codv-fab-ol1的fc和fc3二者均是igg1亚类，或igg2亚类，或igg3亚类，或igg4亚类。在codv-fab-tl1“hz20g6x7g3”抗体样结合蛋白中，fc序列和fc2序列来自igg1主链。那些codv-fab-tl1变体包含一个式[iv]的多肽和一个式[iii]的多肽或由其组成。如本文所述的所有抗体样结合蛋白都没有效应功能。这意味着当抗体样结合蛋白含有igg1亚类的一个或多个fc域(即式[iii]中的fc，式[iv]中的fc2时，和/或fc3)时，所述igg1主链的一个或多个fc域含有双重突变l234a和l235a(所谓的“lala突变”)，其消除fc效应功能。如上所述，本发明的抗体样蛋白的所有fc域均含有双重突变l234a和l235a，因此所述突变在本发明的抗体样蛋白的上下文中未被进一步提及，也未在本发明的抗体样蛋白的序列中进一步示出。在一些实施方案中，fc区还包含如上文所定义的rf和/或“节-入-穴”突变。根据本发明的一个实施方案，式[i]的多肽或式[iv]的vd1和vd2都是轻链的可变域，或重链的可变域，并且多肽[iii]的vd3和vd4都是重链的可变域或轻链的可变域。这种可互换性也称为“可交换性”，因此确定了本发明的抗体样结合蛋白的交叉双重变量(codv)构型。根据上述定义，vd1和vd4是第一免疫球蛋白的重链或轻链的可变域，vd2和vd3是第二免疫球蛋白的重链或轻链的可变域，因此vd1和vd4被认为是同类结构域，vd2和vd3亦然。因此，术语“交叉”涉及式[i]或式[iv]的多肽的vd1或vd2相对于式[iii]的多肽的同类可变域vd4或vd3的交换排列。在一个具体实施方案中，vd1和vd2是轻链可变域，而vd3和vd4是重链可变域。在本发明的上下文中，已经产生了几种抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白，所谓的“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白，具体是：codv-fab-tl1-节-rfx穴,codv-fab-tl1-节x穴-rf,codv-fab-tl1,codv-fab-tl1-节x穴,codv-fab-ol1-节x穴-rf无gs。在一个具体实施方案中，本发明涉及codv-fab-tl1抗体样结合蛋白codv-fab-tl1-节-rfx穴，codv-fab-tl1-节x穴-rf和codv-fab-tl1-节x穴，更具体地涉及codv-fab-tl1-节-rfx穴，codv-fab-tl1-节x穴-rf。那些抗体样结合蛋白都包含节-入-穴突变，其中节突变位于轻链的fc区，即多肽iv，而穴突变位于重链上，即在多肽iii上。所述抗体样结合蛋白可进一步包含rf突变。如上所述，节-入-穴突变增加了抗体样结合蛋白的异源二聚体的量。所谓codv-fab-tl1-节-rfx穴“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白包含：-一个式[iv]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:72，接头以粗体和下划线表示)，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，序列seqidno:18的cl，含有0个氨基酸的l5，和序列seqidno:73的fc2(带下划线)，及-一个式[iii]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:74)其包含序列seqidno:9的vd3，l3为0个氨基酸，序列seqidno:52的vd4(以斜体表示)，l4为0个氨基酸，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:75的fc(带下划线)。所述抗体样结合蛋白呈codv-fab-tl形式，即其含有一个式[iv]的多肽和一个式[iii]的多肽或由其组成。序列seqidno:58的所述式[iv]的多肽的fc2序列在氨基酸位置116和117处含有rf突变(上文以粗体表示)。此外，其fc和fc2序列已经根据“节-入-穴”技术工程化，并且fc2域还包含seqidno:73中的s134c和t146w突变(如粗体所示)，其先前描述为knob突变，而fc进一步含有seqidno:75中的y134c，t151s，l153a，y192v，其先前描述为穴突变。所谓的codv-fab-tl1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白包含-一个式[iv]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:76，接头以粗体和下划线表示)，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，序列seqidno:18的cl，含有0个氨基酸的l5，和序列seqidno:77的fc2(带下划线)；及-一个式[iii]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:78)，其包含序列seqidno:9的vd3，l3为0个氨基酸，序列seqidno:52的vd4(以斜体显示)，l4为0个氨基酸，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:79的fc(带下划线)。式[iv]的多肽的fc2序列在其序列seqidno:77中包含s134c和t146w突变。式[iii]的多肽的fc序列在其序列seqidno:79中包含突变y134c，t151s，l153a，y192v(穴突变)和rf突变。所谓的codv-fab-tl1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白包含：-一个式[iv]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:80，接头以粗体和下划线表示)，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，序列seqidno:18的cl，含有0个氨基酸的l5，和序列seqidno:81的fc2(带下划线)；及-一个式[iii]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:59)，其包含序列seqidno:9的vd3，l3为0个氨基酸，序列seqidno:52(以斜体显示)的vd4，l4为0个氨基酸，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:60的fc(带下划线)。所谓的codv-fab-tl1-节x穴“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白包含：-一个式[iv]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:76，接头以粗体和下划线表示)，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，序列seqidno:18的cl，含有0个氨基酸的l5，和序列seqidno:77的fc2(带下划线)；及-一个式[iii]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:74)，其包含序列seqidno:9的vd3，l3为0个氨基酸，序列seqidno:52(以斜体显示)的vd4，l4为0个氨基酸，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:75的fc(带下划线)。式[iv]的多肽的fc2序列在其序列seqidno:77中含有s134c和t146w突变。多肽iii的fc域在seqidno:75中含有的穴突变y134c，t151s，l153a，y192v。与codv-fab-ol1a相比，新开发的不含gs(wogs)的分子codv-fab-ol1-节x穴-rf不包含位于fc段(fc3)的n末端的氨基酸“gs”。不含gs(wogs)的蛋白codv-fab-ol1-节x穴-rf易于纯化，并且在蛋白a纯化后具有高量的异源二聚体(即图4中所示的88％异源二聚体)。所谓的没有gs的codv-fab-ol1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白包含：-一个式[i]的多肽，其氨基酸序列如下divmtqspdslavslgeratincessqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppkpliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndysypytfgqgtkleikggsgssgsggdivmtqtplslsvtpgqpasisckssqslvhnnantylswylqkpgqspqsliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycgqgtqypftfgsgtkveikggsgssgsggrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:55)，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，和序列seqidno:18的cl；-一个式[iii]的多肽，其氨基酸序列如下：(seqidno:65)，其包含序列seqidno:9的vd3，l3为0个氨基酸，序列seqidno:52的vd4(以斜体和下划线显示)，l4为0个氨基酸，ch1of序列seqidno:19，和序列seqidno:66的fc(带下划线)；-且其中所谓的没有gs的codv-fab-ol1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白进一步包含氨基酸序列如下的fc段(fc3)：(seqidno:69)，其与式[iii]的多肽的fc区异二聚化。序列seqidno:66的fc包含位置220-221处的hy残基(上文粗体部分)和节突变s139c和t151w，而序列seqidno:69的fc段包含位置217-218处的rf残基(上文粗体部分)和穴突变y131c，t148s，l150a和y189v。抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白，所谓的“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白：codv-fab-tl1-rf,codv-fab-ol1和codv-fab-ol1a描述于专利申请pct/ep2016/051386中，该专利申请在本专利申请的优先权日之时尚未公开(根据欧洲专利公约的第54(3)条)。所谓的codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白此前在专利申请pct/ep2016/051386中以名称codv-fab-tl1描述，其在本专利申请的优先权日之时尚未公开(根据欧洲专利公约的第54(3)条)。-一个式[iv]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:57，接头以粗体和下划线表示)，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，序列seqidno:18的cl，含有0个氨基酸的l5，和序列seqidno:58的fc2(带下划线)；和-一个式[iii]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:59)，其包含序列seqidno:9的vd3，l3为0个氨基酸，序列seqidno:52的vd4(以斜体显示)，l4为0个氨基酸，序列seqidno:19的ch1，以及序列seqidno:60的fc(带下划线)。所述抗体样结合蛋白是codv-fab-tl形式，即它包含一个式[iv]的多肽和一个式[iii]的多肽或由其组成。序列seqidno:58的所述式[iv]的多肽的fc2序列已被进一步设计为在位置116和117(上文粗体部分)含有rf残基，而不是hy残基，否则其会存在于fc区的这些位置。hy>rf突变(即如jendeberg,l等.1997,j.immunologicalmeth.,201:25-34所述的ch3域中的h435r和y436f)对于纯化目的是有利的，因为它消除了与蛋白a的结合。所述的codv-fab-ol1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白此前已描述于专利申请pct/ep2016/051386中，其在本专利申请的优先权日之时尚未公开(根据欧洲专利公约的第54(3)条)，且包含：-一个式[i]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:55，接头以粗体和下划线表示)，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，和序列seqidno:18的cl；及-一个式[iii]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:61)，其包含序列seqidno:9的vd3，l3为0个氨基酸，序列seqidno:52的vd4(以斜体和下划线显示)，l4为0个氨基酸，ch1of序列seqidno:19，和序列seqidno:62的fc(带下划线)；且其中所谓的codv-fab-ol1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白进一步包含fc段(fc3)，所述fc段氨基酸序列如下：(seqidno：63）且其与式[iii]的多肽的fc去异二聚化。所述抗体样结合蛋白是codv-fab-ol形式，即它包含一个[i]的多肽，一个式[iii]的多肽和一个fc段或由其组成。其fc和fc3序列已经根据“节-入-穴”技术进行了工程改造，fc域还包含seqidno:62中的s139c和t151w突变(粗体显示)，前述为节突变，fc3进一步含有先前描述为穴突变的seqidno:63中的y131c，t148s，l150a和y189v。序列seqidno:62的fc序列已被进一步设计为在220-221位置含有rf突变(上文粗体部分)。所谓的codv-fab-ol1a“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白前已描述于专利申请pct/ep2016/051386中，其在本专利申请的优先权日之时尚未公开(根据欧洲专利公约的第54(3)条)，且包含：-一个式[i]的多肽，其氨基酸序列如下(seqidno:55)，其包含序列seqidno:54的vd1，序列seqidno:56的l1，序列seqidno:10的vd2，序列seqidno:56的l2，和序列seqidno:310的cl；-一个式[iii]的多肽，其氨基酸序列如下:(seqidno:65)，其包含序列seqidno:9的vd3，l3为0个氨基酸，序列seqidno:52的vd4(以斜体和下划线显示)，l4为0个氨基酸，序列seqidno:19的ch1，和序列seqidno:66的fc(带下划线)；-且其中所谓的codv-fab-ol1a“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白还包含fc段(fc3)，所述fc段氨基酸序列如下：(seqidno:64)其与式[iii]的多肽的fc区异二聚化。序列seqidno:66的fc包含在位置220-221的hy残基(上文粗体部分)和节突变s139c和t151w(而序列seqidno:64的fc段包含在位置217-218的rf残基(上文粗体部分)和穴突变y131c，t148s，l150a和y189v。本发明开发了抗体样结合蛋白codv-fab-tl1-rf的一些替代的分子，如codv-fab-tl1-节-rfx穴，codv-fab-tl1-节x穴-rf，codv-fab-tl1和codv-fab-tl1-节x穴。此外，发明人开发了抗体样结合蛋白codv-fab-ol1-节x穴-rf作为抗体样结合蛋白codv-fab-ol1和codv-fab-ol1a的替代。这些codv-fab-tl1变体含有节-入-穴突变和/或rf突变，以便简化纯化过程、减少聚集从而增加本发明的抗体样结合蛋白的异二聚体的产率。蛋白a纯化后获得的抗体样结合蛋白含有例如52％的异二聚体(对于codv-fab-tl1-rf)，72-85％的异二聚体(对于codv-fab-tl1-节-rfx穴)，55％的异二聚体(对于codv-fab-tl1-节x穴-rf)，和88％的异二聚体(对于codv-fab-ol1-节x穴-rf)。进一步地，发现抗体样结合蛋白的熔点在56-57℃处非常相似(实施例2.7.1)。如上所述，本发明的抗体样结合蛋白结合cd3和cd123。因此，在本发明的一个方面，本发明的抗体样结合蛋白与人cd3结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白还与食蟹猴cd3结合。具体地，本发明的抗体样结合蛋白结合人cd3的胞外结构域或人与食蟹猴cd3的胞外结构域。更具体地，抗体结合cd3ε。更具体地，抗体样结合蛋白结合人或人与食蟹猴细胞的cd3ε外结构域。当以复合物如cd3ε/δ复合物的形式存在时，或当作为单一蛋白存在时，抗cd3抗体与cd3ε结合，无论是否以分离形式表达或存在于可溶性胞外结构域或全长膜-锚定的cd3ε中(如例如存在于t细胞中)，都是无差别的。根据本发明的抗体样结合蛋白特异性针对表面人cd3蛋白或人与食蟹猴cd3蛋白(特别是cd3ε)。根据本发明的抗体样结合蛋白对食蟹猴cd3的亲和性比对人cd3的亲和性的比率(kd(食蟹猴)/kd(人)为≤10，具体为≤6，≤5，≤4，≤3，≤2，≤1或≤0.5。因此，根据本发明的抗体样结合蛋白可用于在猴中进行的毒性研究，猴中观察到的相关毒性概貌预期人中的潜在不良反应。此外，根据本发明的抗体样结合蛋白对人cd3或食蟹猴cd3或二者具有亲和力(kd)，所述亲和力为≤50nm，≤40nm，或≤30nm，例如≤20nm例如亲和力为0.1nm至30nm，具体为0.4nm至25nm，或是10nm至25nm。在本发明的另一方面，抗体样结合蛋白与人cd123结合。在另一个实施方案中，抗体样结合蛋白还与食蟹猴cd123结合。具体地，本发明的抗体样结合蛋白结合人cd123或人和食蟹猴cd123两者的胞外结构域。更具体地，抗体样结合蛋白结合cd123的远端部分，例如结合氨基酸序列seqidno:12的人cd123的位置19至49的氨基酸。抗体样结合蛋白结合cd123，无论是以分离形式表达，还是存在于可溶性胞外结构域或全长膜锚定cd123中(其存在于表达cd123的细胞如aml细胞或转染了cd123细胞中)，都是无差别的。根据本发明的抗体样结合蛋白特异性针对在其表面上表达人或人与食蟹猴cd123蛋白的细胞，例如表达cd123的癌细胞。因此，根据本发明的抗体样结合蛋白对人cd123或食蟹猴cd123或二者具有亲和力(kd)，所述亲和力为≤20nm，≤15nm，或≤10nm，例如≤5nm，例如亲和力为0.01nm至5nm，具体为0.01nm至2nm，更具体为0.05nm至2nm。在一个实施方案中，抗体样结合蛋白能够意指cd123的功能。在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白的热变性温度为50至70℃，优选为50至65℃，更优选为55至60℃。测量热变性温度的方法是本领域技术人员已知的，并且包括差示扫描荧光测定法(dsf)。如本领域技术人员所知，用于那些实验的实验条件，例如使用的缓冲液，蛋白质的浓度，可以强烈影响结果。因此，在一个实例中，50-70℃，优选50-65℃，更优选55-60℃的变性温度是指抗体样结合蛋白通常稀释于d-pbs缓冲液(invitrogen)中至例如为0.2μg/μl的终浓度，通常包括sypro-orange染料的4x浓缩溶液(invitrogen，5000x储液于dmso中)在d-pbs中，例如白色半裙边(semi-skirt)96孔板(biorad)，如实施例中例示的(实施例2.7.1)。在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白在不存在靶细胞的情况下具有小于20％，小于18％，小于16％，小于14％，小于12％，小于10％的t细胞活化。在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白在存在靶细胞的情况下具有高于55％，高于60％，高于62％，高于64％，高于66％，高于68％，高于70％的t细胞活化。本发明的抗体样结合蛋白具有t细胞接合作用。这种t细胞接合作用在表达cd123的靶细胞中诱导细胞毒性。本发明的靶细胞抗体样结合蛋白是表达cd123的细胞，例如表达cd123的癌细胞，例如thp-1或tf-1。因此，在一个实施方案中，根据本发明的抗体样结合蛋白能够在体外接合原代t细胞并裂解靶细胞，其中(ec50)≤40pm，≤35pm，≤20pm，≤10pm，≤5pm，例如≤2pm。在一个实施方案中，本文的细胞毒性是指细胞介导的细胞毒性，例如t细胞介导的细胞毒性。此外，在一个实施方案中，细胞介导的细胞毒性是指细胞介导的t细胞的细胞毒性。因此，本发明的抗体样结合蛋白在由t细胞介导的表达cd123的靶细胞中诱导细胞介导的细胞毒性。测量细胞毒性的方法是本领域技术人员已知的，并且包括使用51-铬(cr)释放测定法，靶细胞的活/死细胞染色，包括碘化丙啶，7-aad和本领域技术人员已知的其它染色，通过流式细胞术或elisa检测由t细胞释放的溶胞分子，包括颗粒酶和穿孔素，检测从受损细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶(ldh)，作为细胞毒性和细胞溶解的生物标志物，检测细胞表面动员cd107a，膜联蛋白v(钙依赖性磷脂结合蛋白)染色凋亡靶细胞，例如检测活化的胱天蛋白酶-3(casp3)。此外，本领域技术人员可以基于所选择的测试并基于实验设置来区分不同的细胞毒性机制。在一个实例中，细胞介导的细胞毒性可以例如使用cfse测量以标记靶细胞和用7-aad测量以标记死细胞，如例如实施例1.8中所述。抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白的变体本文所述的抗体样结合蛋白的变体涵盖在内且明确的痛过使用如上文定义的抗体样结合蛋白的定义中所采取的措词“与参考序列至少85％相同”的术语来提及。如本领域技术人员会认识到的，参考序列是式[i]，[iii]或[iv]的多肽，并且具有“与参考序列至少85％相同”的变体以如下方式定义：抗体“hz20g6”和“hz7g3”的cdr以及对应于不同fc区中的rf突变、节突变和穴突变和基酸位置是不变的。本领域技术人员会进一步理解，与参考序列相比，相应的缺失，插入和/或替代可以引入框架区(fr)、cl和ch1和fc中的环区域l1，l2，l3，l4和任选的l5。框架区域(fr)如上文“定义”一节中所定义，并且是指介于cdr之间的氨基酸序列。由于定义了cdr，本领域技术人员可以容易地定位框架区域。本发明的抗体样结合蛋白的ch域可为属于人免疫球蛋白重链的任何ch区，但igg类的ch区是合适的，并且还可以使用属于igg类的任何一类，如igg1，igg2，igg3和igg4。同样，本发明的抗体样结合蛋白的cl可为属于人免疫球蛋白轻链的任何区域，可使用κ类或λ类的任何区域。本领域技术人员会理解，如上文所定义的ch或cl区可以被另一亚类的免疫球蛋白的ch或cl域取代。为了进一步指导产生如本文定义的变体，给出了接头区l1，l2，l3，l4和l5的一些实例。在一个实例中，l3的长度至少是l1长度的两倍。在另一实例中，l4的长度是l2的长度的至少两倍。在一些实例中，l1的长度是l3的长度的至少两倍。在其他实例中，l2的长度是l4长度的至少两倍。在一个实例中，接头l1，l2，l3，l4包含0-20个氨基酸。包含在一个实施方案中，l5包含0-10个氨基酸。在一些实例中，l1是3至12个氨基酸残基的长度，l2是3至14个氨基酸残基的长度，l3是1至8个氨基酸残基的长度，且l4是1至3个氨基酸残基的长度。在其他实例中，l1是5至10个氨基酸残基的长度，l2是5至8个氨基酸残基的长度，l3是1至5个氨基酸残基的长度，且l4是1至2个氨基酸残基的长度。在进一步的实例中，l1是7个氨基酸残基的长度，l2是5个氨基酸残基的长度，l3是1个氨基酸残基的长度，且l4是2个氨基酸残基的长度。在一些实例中，l1是1至3个氨基酸残基的长度，l2是1至4个氨基酸残基的长度，l3是2至15个氨基酸残基的长度，且l4是2至15个氨基酸残基的长度。在其他实例中，l1是1至2个氨基酸残基的长度，l2是1至2个氨基酸残基的长度，l3是4至12个氨基酸残基的长度，且l4是2至12个氨基酸残基的长度。在优选的实例中，l1是1个氨基酸残基的长度，l2是2个氨基酸残基的长度，l3是7个氨基酸残基的长度，且l4是5个氨基酸残基的长度。在一些实例中，l1，l3，或l4可等于0。然而，在抗体样结合蛋白中，其中l3，或l4等于0，可变区和恒定区之间或其他链上双重可变域之间的对应过渡接头可为0。在一些实例中，l1等于0且l3是2或更多个氨基酸残基，l3等于0且l1等于1或更多个氨基酸残基，或l4等于0且l2是3或更多个氨基酸残基。在一些实例中，选自下组的接头的至少一个含有至少一个半胱氨酸残基：l2，l3，和l4。可用于本发明的抗体样结合蛋白的变体的合适接头的实例包括单个甘氨酸，苏氨酸或丝氨酸残基；二肽如二甘氨肽，组氨酸-苏氨酸肽或甘氨酸-丝氨酸二肽；具有三个甘氨酸的三肽，三肽thr-his-thr，三肽gly-gly-ser；具有四个甘氨酸残基的肽；具有5个甘氨酸残基的肽；具有六个甘氨酸残基的肽；具有七个甘氨酸残基的肽；具有八个甘氨酸残基的肽。可以使用氨基酸残基的其他组合，例如肽gly-gly-gly-ser(seqidno:27)，肽gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:20)，肽ser-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:28)，肽gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:29)，肽gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:30)，肽gly-gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:31)，和肽gly-gly-gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:21)。其他合适的接头包括单个ser，和val残基；二肽arg-thr，gin-pro，ser-ser，thr-lys，和ser-leu；lys-thr-his-thr(seqidno:32)；lys-thr-his-thr-ser(seqidno:33)；asp-lys-thr-his-thr-ser(seqidno:34)；asp-lys-thr-his-thr-ser-pro(seqidno:35)；ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro(seqidno:36)；ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro(seqidno:37)；lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser(seqidno:38)；pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser(seqidno:39)；pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro(seqidno:40)；glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro(seqidno:41)；glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly(seqidno:42)；gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly(seqidno:43)；gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly(seqidno:44)；gly-gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly(seqidno:45)；gly-gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly-gly(seqidno:46)；gly-gly-gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly-gly(seqidno:47)；thr-val-ala-ala-pro(seqidno:22)，gln-pro-lys-ala-ala(seqidno:23)，gln-arg-ile-glu-gly(seqidno:24)；ala-ser-thr-lys-gly-pro-ser(seqidno:25)，arg-thr-val-ala-ala-pro-ser(seqidno:26)，gly-gln-pro-lys-ala-ala-pro(seqidno:16)，thr-lys-gly-pro-ser(seqidno:17)，his-ile-asp-ser-pro-asn-lys(seqidno:351)，和gly-gly-ser-gly-ser-ser-gly-ser-gly-gly(seqidno:56)。上述实施例不以任何方式限制本发明的范围，并且包含选自缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸的随机选择的氨基酸的接头，天冬酰胺，谷氨酰胺，甘氨酸和脯氨酸已被证明适用于本发明的抗体样结合蛋白。接头中氨基酸残基的身份和序列可以根据在接头中实现所必需的二级结构元件的类型而变化。例如，甘氨酸，丝氨酸和丙氨酸对于具有最大灵活性的接头是最好的。甘氨酸，脯氨酸，苏氨酸和丝氨酸的某些组合如果需要更刚性和延伸的接头是有用的。任何氨基酸残基可以被认为是与其它氨基酸残基组合的接头，以根据所需的性质根据需要构建更大的肽接头。在一个实例中，接头l1序列为gly-gln-pro-lys-ala-ala-pro(seqidno:16)，接头l2序列为thr-lys-gly-pro-ser(seqidno:17)，接头l3序列为‘s’，接头l4序列为‘rt’。在另一个实例中，接头l1，l2，l3，和l4的序列选自苏氨酸；二肽如组氨酸-苏氨酸肽；三肽thr-his-thr,lys-thr-his-thr(seqidno:32)；lys-thr-his-thr-ser(seqidno:33)；asp-lys-thr-his-thr-ser(seqidno:34)；asp-lys-thr-his-thr-ser-pro(seqidno:35)；ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro(seqidno:36)；ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro(seqidno:37)；lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser(seqidno:38)；pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser(seqidno:39)；pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro(seqidno:40)；glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro(seqidno:41)；glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly(seqidno:42)；gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly(seqidno:43)；gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly(seqidno:44)；gly-gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly(seqidno:45)；gly-gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly-gly(seqidno:46)和gly-gly-gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly-gly(seqidno:47)。在一个实例中，接头l5的序列选自下组：单丝氨酸残基，二肽如甘氨酸-丝氨酸二肽；三肽gly-gly-ser,肽gly-gly-gly-ser(seqidno:27),肽gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:20),肽ser-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:28),肽gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:29),肽gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:30),肽gly-gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:31),肽gly-gly-gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:21),和肽gly-gly-ser-gly-ser-ser-gly-ser-gly-gly(seqidno:56)。可应用于抗体样结合蛋白以产生“与参考序列至少85％相同的”序列的其它修饰描述于下文“本发明的抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白的修饰”中。本发明的抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白的修饰考虑本文所述的抗体样结合蛋白的氨基酸序列修饰。例如，可能希望提高抗体样结合蛋白的结合亲和力和/或其他生物学性质。例如，已知当通过在人抗体的vh和vl的fr中简单地仅移接来源于非人动物的抗体的vh和vl中的cdr而产生人源化抗体时，抗原结合活性可与来自非人动物的原始抗体相比是降低的。认为非人抗体的vh和vl的几个氨基酸残基不仅在cdr中而且在fr中可与抗原结合活性直接或间接相关。因此，用来源于人抗体的vh和vl的fr的不同氨基酸残基取代这些氨基酸残基会降低结合活性。为了解决这个问题，在用非人cdr移植的人抗体中，必须尝试在人抗体的vh和vl的fr的氨基酸序列之间鉴定直接与抗体结合相关的氨基酸残基，或与cdr的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基，或维持抗体的三维结构的氨基酸残基和与抗原结合直接相关的氨基酸残基。可通过用来自非人动物的原始抗体的氨基酸残基替换鉴定的氨基酸来增加降低的抗原结合活性。本发明的抗体样结合蛋白包含人源化抗体“20g6”的可变区和人源化抗体“7g3”的可变区，因此本文提及的同等同样适用于本发明的抗体样结合蛋白。可在本发明的抗体样结合蛋白的结构和编码它们的dna序列中进行修饰和改变，并且仍然产生具有所需特征的功能性抗体样结合蛋白或多肽。在进行多肽的氨基序列变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能中的重要性在本领域中是普遍理解的。人们认为，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其又限定了蛋白质与其他分子例如酶，底物，受体，dna，抗体，抗原的相互作用，等等。基于它们的疏水性和电荷特性，每个氨基酸被指定为亲水指数：这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本发明的另一个目的还包括本发明的抗体样结合蛋白的多肽的功能保守变体。例如，某些氨基酸可被蛋白质结构中的其它氨基酸取代而没有明显的活性丧失。由于蛋白质的相互作用能力和性质限定了其生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸取代，当然也可以在其dna编码序列中进行某些氨基酸置换，同时获得具有相似性质的蛋白质。因此，预期可以在本发明的抗体序列或编码所述多肽的相应dna序列中进行各种改变，而不会明显丧失其生物学活性。本领域已知某些氨基酸可被具有相似亲水指数或分数的其它氨基酸取代，并且仍然产生具有相似生物活性的蛋白质，即仍然获得生物功能等同的蛋白质。还可使用如丙氨酸扫描方法等已知技术在本发明的抗体样结合蛋白中鉴定可被取代而不显著丧失与抗原结合的所有氨基酸。这样的残基可被认定为中性的，因为它们不参与抗原结合或维持抗体的结构。这些中性位置中的一个或多个可以被丙氨酸或另一个氨基酸取代，而不改变本发明的抗体样结合蛋白的主要特征。如上所述，氨基酸取代通常因此基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性，亲水性，电荷，大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。针对效应功能修饰本发明的抗体样结合蛋白也是期望的，例如以增强或减少抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)。这可通过在抗体的fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现，在本文中也称为fc变体，其与本发明的抗体样结合蛋白相关。或者或另外，可将半胱氨酸残基引入fc区，从而允许在该区域中形成链间二硫键。由此产生的同二聚抗体可能具有改善或降低的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和/或抗体依赖性细胞毒性(adcc)(caronpc等1992；和shopesb.1992)。本发明的抗体样结合蛋白的另一种类型的氨基酸修饰可用于改变抗体样结合蛋白的原始糖基化模式，即通过删除在抗体样结合蛋白中发现的一个或多个碳水化合物部分和/或在抗体样结合蛋白中加入一个或多个不存在的糖基化位点来加以改变。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸)的存在，产生潜在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列使得其含有一个或多个上述三肽序列(用于n-连接的糖基化位点)，可方便地实现对抗体样结合蛋白的糖基化位点的添加或缺失。另一种类型的修饰涉及以计算机或实验方式去除鉴定的序列，因为可能导致抗体样结合蛋白制备物的降解产物或异质性。作为实例，天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺可根据如ph和表面暴露等因素而发生。天门冬酰胺残基特别易于脱酰胺化，主要是存在于asn-gly序列中，而在其它二肽序列如asn-ala中则较少。当这样的脱酰胺位点，特别是asn-gly存在于本发明的抗体样结合蛋白中时，通常可通过保守取代来去除位点，从而去除位点，以去除一个涉及残基。序列中用于去除一个或多个涉及残基的这种取代也意欲被本发明涵盖。另一种类型的共价修饰涉及将糖苷化学或酶促偶联至抗体样结合蛋白。这些方法的优点在于它们不需要在具有n-或o-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生抗体样结合蛋白。根据所使用的偶联方式，可以将糖连接到(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。例如，wo87/05330中描述了这些方法。存在于抗体样结合蛋白上的任何糖类部分的去除可以化学或酶学地完成。化学脱糖基化需要将抗体样结合蛋白暴露于化合物三氟甲磺酸或等价化合物。除了连接糖(n-乙酰葡糖胺或n-乙酰半乳糖胺)之外，该处理导致大部分或全部糖的切割，同时使抗体保持完整。sojahrh等(1987)和edge等(1981)描述了化学脱糖基化。抗体上糖类部分的酶切割可以通过使用如thotakura,nr等,(1987)所述的各种内切和外切糖苷酶实现。抗体样结合蛋白的另一种类型的共价修饰包括将抗体连接到多种非蛋白质聚合物之一，例如聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧乙烯，以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述方式进行。核酸、载体和重组宿主细胞本发明的另一个目的涉及包含编码如上所定义的抗体样结合合蛋白的序列或由其组成的核酸序列。通常，所述核酸是dna或rna分子，其可以包括在任何合适的载体中，例如质粒，粘粒，附加体，人工染色体，噬菌体或病毒载体。因此，本发明的另一个目的涉及包含本发明的核酸的载体。这样的载体可包含调节元件，例如启动子，增强子，终止子等，以在施用于受试者时引起或指导所述多肽的表达。在动物细胞表达载体中使用的启动子和增强子的实例包括sv40(mizukamit.等,1987)的早期启动子和增强子，moloney小鼠白血病病毒的ltr启动子和增强子(kuwanay等,1987)，免疫球蛋白h链的启动子(masonjo等,1985)和增强子(gilliessd等,1983)等。可使用动物细胞的任何表达载体，只要编码人抗体c区的基因能被插入并表达即可。合适的载体的实例包括page107(miyajih等,1990)，page103(mizukamit等1987)，phsg274(bradyg等,1984)，pkcr(o'harek等,1981)，psg1βdd2-4-(miyajih等,1990)等。质粒的其他实例包括包含复制起点的复制质粒或整合质粒，例如puc，pcdna，pbr等。病毒载体的其他实例包括腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒和aav载体。这样的重组病毒可以通过本领域已知的技术产生，例如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒的瞬时转染来产生。病毒包装细胞的典型实例包括pa317细胞，psicrip细胞，gpenv+细胞，293细胞等。用于产生这种复制缺陷型重组病毒的详细方案可以在例如wo95/14785，wo96/22378，us5,882,877，us6,013,516，us4,861,719，us5,278,056和wo94/19478。本发明的另一个目的涉及已经被根据本发明的核酸和/或载体转染，感染或转化的细胞。本发明的核酸可用于在合适的表达系统中产生本发明的重组抗体。常见的表达系统包括大肠杆菌(e.coli)宿主细胞和质粒载体，昆虫宿主细胞和杆状病毒载体以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其它实例包括但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌，克鲁维酵母属(kluyveromyces)或酵母属(saccharomyces)酵母，哺乳动物细胞系(例如vero细胞，cho细胞，3t3细胞，cos细胞等)以及原代或已建系的哺乳动物细胞培养物(例如由淋巴母细胞，成纤维细胞，胚胎细胞，上皮细胞，神经细胞，脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠sp2/0-ag14细胞(atcccrl1581)，小鼠p3x63-ag8.653细胞(atcccrl1580)，其中二氢叶酸还原酶基因(以下称为“dhfr基因”)缺陷的cho细胞(urlaubg等；1980)，大鼠yb2/3hl.p2.g11.16ag.20细胞(atcccrl1662，以下称为“yb2/0细胞”)等。yb2/0细胞是优选的，因为当在该细胞中表达时，嵌合或人源化抗体的adcc活性增强。具体是，为了表达本发明的抗体样结合蛋白，表达载体可以是其中编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于分开的载体上的类型或其中两个基因都存在于相同的载体(串联型)上的类型。关于构建抗体样结合蛋白表达载体的容易性，引入动物细胞的容易性以及动物细胞中抗体h和l链的表达水平之间的平衡，串联型的人源化抗体表达载体是优选的(shitarak等jimmunolmethods.1994jan.3；167(1-2):271-8)。串联型人源化抗体表达载体的实例包括pkantex93(wo97/10354)，pee18等。本发明还涉及根据本发明的产生表达抗体样结合蛋白的重组宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)如上文所述体外或体外将重组核酸或载体引入能胜任的宿主细胞中，(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞，(iii)任选地选择表达和/或分泌所述抗体的细胞。这样的重组宿主细胞可用于生产本发明的至少一种抗体样结合蛋白。本发明的生产抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白的方法本发明的一个实施方案提供了生产“抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白”一节中的本文如上定义的抗体样结合蛋白的方法。本发明的抗体样结合蛋白可以通过本领域已知的任何技术制备，例如但不限于任何单独或组合的化学，生物，遗传或酶技术。了解所需序列的氨基酸序列，本领域技术人员可以通过生产多肽的标准技术容易地产生所述抗体或免疫球蛋白链。例如，它们可以使用公知的固相方法，特别是使用市售的肽合成装置(例如由appliedbiosystems，fostercity，california制造)并按照制造商的说明书合成。或者，本发明的抗体、免疫球蛋白链和抗体样结合蛋白可以通过本领域众所周知的重组dna技术合成。例如，这些片段可以通过如下步骤作为dna表达产物获得：在将编码期望的(多)肽的dna序列掺入表达载体之后，将这些载体引入到将表达所需多肽的合适的真核或原核宿主中，它们随后可以从所述宿主使用公知的技术加以分离。具体地，本发明还涉及本发明的抗体样结合蛋白的生产方法，该方法包括以下步骤：(i)根据本发明培养转化的宿主细胞；(ii)表达所述抗体样结合蛋白或相应的多肽；和(iii)回收表达的抗体样结合蛋白或多肽。通过常规的免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白质a-琼脂糖凝胶，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析，适当地将本发明的抗体样结合蛋白与培养基分离。在一个实施方案中，回收表达的抗体样结合蛋白或本文中的多肽是指进行蛋白a层析，k选择层析法和/或尺寸排阻层析法，优选为蛋白a层析法和/或尺寸排阻层析法，更优选为蛋白a层析和尺寸排阻层析。本发明的抗体样结合蛋白的制备方法涉及常规的重组dna和基因转染技术是本领域公知的(参见morrisonsl等(1984)和专利文献us5,202,238；以及us5,204,244)。基于常规重组dna和基因转染技术生产人源化抗体的方法是本领域公知的(参见例如，riechmannl.等1988；neubergerms等，1985)，并且可以以类似于抗体样结合蛋白的生产那样转移。在一个实例中，如下文第2.5节所述，通常以等比例的轻链和重链质粒转染生长在例如f17血清游离悬浮培养基(invitrogen)中的freestylehek293细胞，其中codv-fab-tl1抗体样结合蛋白的抗体信息通常编码在一条轻链和一条重链上，而对于codv-fab-ol1抗体样结合蛋白如codv-fab-ol1-节x穴-rf无gs，用例如制造商所述的聚乙烯雌二醇转染试剂转染一条轻链和两条重链质粒。细胞通常在37℃处在kuhnerisf1-x振荡培养箱中以8％co2以110rpm培养。例如，培养7天后通过离心除去细胞，通常加入10％vol/vol1mtrishclph8.0，并通过例如0.2μm的瓶顶过滤器过滤上清液以除去粒子。通过在典型的蛋白a柱(hitrap蛋白ahp柱，gelifesciences)上的亲和层析纯化codv-fab-tl1抗体样结合蛋白以及codv-fab-ol1抗体样结合蛋白。在用例如0.1m柠檬酸盐(citrat)，ph3.0从柱洗脱后，codv-fab构建体通常使用例如配制在典型的pbs(gibco14190-136)中的hiprep26/10脱盐柱脱盐。为了将单体从聚合物以通常高分辨率分级分离步骤分离，例如在两种构建体的pbs(gibco14190-136)中，codv-fab-tl1抗体样结合蛋白和codv-fab-ol1抗体样结合蛋白通常使用hiloadsuperdex20026/60320ml柱(gehealthcare目录号:29-9893-36)。合并单体级分并使用vivaspin20离心柱(vs2002sartoriusstedimbiotech)将其浓缩至例如1mg/ml，并使用通常为0.22μm的膜(syringefiltersslgv033rs)过滤。药物组合物本发明的抗体样结合蛋白可以与药学上可接受的赋形剂和任选的缓释基质例如可生物降解的聚合物组合以形成治疗组合物。因此，本发明的另一个目的涉及包含本发明的抗体样结合蛋白和药学上可接受的载剂的药物组合物。本发明还涉及用作药物的根据本发明的抗体样结合蛋白。本发明还涉及用作药物的本发明的药物组合物。这种治疗剂或药物组合物可包含治疗有效量的抗体样结合蛋白或其药物偶联物，其与选择用于与施用模式适合的药学或生理上可接受的制剂剂混合。如本文所用，药学上可接受的载体包括生理上相容的任何和所有溶剂，分散介质，包衣，抗菌和抗真菌剂等。合适的载体，稀释剂和/或赋形剂的实例包括水，氨基酸，盐水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇或氯化钠，并且制剂还可以含有抗氧化剂，例如色胺和稳定剂如tween20。药物组合物的形式，施用途径，剂量和方案自然取决于待治疗的病情，疾病的严重程度，患者的年龄，体重和性别等。本发明的药物组合物可配制用于局部，口服，肠胃外，鼻内，静脉内，肌内，皮下或眼内给药等。具体地，药物组合物含有能够被注射的制剂药学上可接受的载体。这些可以是特别是等张，无菌，盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸钠，钠，钾，钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的，特别是冷冻干燥的组合物，其在加入无菌水或生理盐水时(取决于情况)允许构成可注射溶液。用于施用的剂量可以作为各种参数的函数，特别是作为所用的施用模式的函数，相关病理学的函数或可选的所需治疗持续时间的函数。为了制备药物组合物，可以将有效量的本发明的抗体或免疫缀合物溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体；制剂包括芝麻油，花生油或丙二醇水溶液；以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是流体性的，以至于存在易于注射的程度。在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用而保存。作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。分散体也可以在甘油，液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。本发明的抗体样结合蛋白可以配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并与无机酸形成，例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸，等等。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠，钾，铵，钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺，三甲胺，甘氨酸，组氨酸，普鲁卡因等。载体也可为含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和蔬菜油的溶剂或分散介质。通过在分散体的情况下维持所需的粒径和通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性，例如通过使用包衣如卵磷脂。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。无菌可注射溶液是通过将所需量的活性化合物在合适的溶剂中加入根据需要的上述各种其它成分，然后过滤灭菌来制备的。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌载体中制备分散体，所述无菌载体含有碱性分散介质和上述列举的所需的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分的粉末和任何另外的所需成分。还考虑制备用于直接注射的更多或高度浓缩的溶液，其中使用dmso作为溶剂来预期导致极快的渗透，将高浓度的活性剂递送到小的肿瘤区域。配制后，溶液以与剂量制剂相适应的方式并且以治疗有效的量施用。制剂容易以各种剂型施用，例如上述可注射溶液的类型，但也可以使用药物释放胶囊等。对于在水溶液中肠胃外施用，例如，如果需要，溶液应适当缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内，肌肉内，皮下和腹膜内给药。就此而言，根据本公开内容，可以使用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，一个剂量可以溶解在1ml等渗nacl溶液中，并加入到1000ml的皮下溶解液中或在建议的输注部位注射(参见例如“remington'spharmaceuticalsciences”第15版，第1035-1038页和1570-1580)。剂量的一些变化必然会根据所治疗的受试者的状况而发生。在任何情况下，负责施用者将决定个体受试者的适当剂量。在一个实施方案中，将本发明的抗体样结合蛋白配制在治疗性混合物中，每剂左右包含约0.01至100毫克。另外，用于肠胃外给药(如静脉内或肌内注射)的其它药学上可接受的形式的抗体样结合蛋白包括例如片剂或其他固体用于口服给药；延时释放胶囊；以及当前使用的任何其他形式。在某些实施方案中，预期将脂多糖和/或纳米颗粒的使用引入宿主细胞中的多肽例如抗cd3抗体，抗cd123抗体或抗体样结合蛋白。脂质体和/或纳米颗粒的形成和使用是本领域技术人员已知的。纳米胶囊通常可以稳定和可再现的方式捕获化合物。为了避免由于细胞内聚合物过载引起的副作用，通常使用能够在体内降解的聚合物来设计这样的超细颗粒(尺寸大约为0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒被考虑用于本发明，并且这样的颗粒可以容易地制备。脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(mlv))的磷脂形成。mlv通常具有25nm至4μm的直径。mlv的超声处理导致直径在200至范围内的小单层囊泡(suv)的形成，其含有核心中的水溶液。脂质体的物理特性取决于ph，离子强度和二价阳离子的存在。一旦药物组合物已经配制，其可以作为溶液，悬浮液，凝胶，乳液，固体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。这样的制剂可以以即用形式或以施用前需要重建的形式(例如冻干)储存。治疗方法与用途本发明人已经在体内显示了本发明的几种双特异性化合物(如hcd20g6xhz7g3codv-fab-tl1和hz20g6xhz7g3codv-fab-ol1)的t细胞介导的对cd123阳性肿瘤细胞系模型的细胞毒性。此外，本发明人证明了本发明的几种双特异性化合物在靶细胞存在下激活t细胞的能力，其导致肿瘤细胞的细胞毒性。本发明人进一步证明了在没有靶细胞的情况下，在不存在t细胞活化的情况下，t细胞的活化低。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防疾病或病症的方法，包括对其向有需要的受试者施用治疗有效量的抗体样结合蛋白或如上文“药物组合物”一节中所定义的药物组合物。本发明还涉及抗体样结合蛋白或本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防受试者的疾病或病症的药物中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及使用抗体样结合蛋白或药物组合物来治疗或预防受试者的疾病或病症。在一个实施方案中，“受试者”是指人。在一个实施方案中，“疾病”或“病症”是从本发明的抗体样结合蛋白治疗中获益的任何病症。在一个实施方案中，这包括慢性和急性疾病或疾病，包括易受到所讨论疾病影响的病理状况。在另一个实施方案中，疾病是指癌症。在进一步的实施方案中，癌症涉及血液癌症，特别是与cd123表达相关的血液癌症。在一个实施方案中，例如通过使用抗cd123抗体容易地测定癌细胞cd123的表达。使用抗cd123抗体鉴定表达cd123的癌症的方法是本领域技术人员已知的。“与cd123表达相关的血液学癌症”包括白血病(如急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，急性淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病和骨髓增生异常综合征)和恶性淋巴细胞增生症，乳头状浆细胞样树突状细胞肿瘤(bpdcn)系统性肥大细胞增多症，包括淋巴瘤(如多发性骨髓瘤，非霍奇金氏(non-hodgkin's)淋巴瘤，伯基特氏(burkitt's)淋巴瘤和小细胞和大细胞滤泡性淋巴瘤)。如上文“定义”部分所述，lscs表达cd123。因此，在相关实施方案中，癌症是指与白血病干细胞相关的血液癌症。与根据本发明治疗的白血病干细胞(lsc)相关的血液学癌症病症包括白血病(例如急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病和骨髓增生异常综合征)和恶性淋巴组织增生性疾病，包括淋巴瘤(如多发性骨髓瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤，小细胞和大细胞滤泡性淋巴瘤)。在本发明的一个方面，血液癌是急性骨髓性白血病(aml)。在一个实施方案中，该被试被诊断为罹患aml。在进一步的实施方案中，已经接受化疗治疗，直到完全缓解但复发。在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白单独使用或与任何合适的生长抑制剂组合使用。在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白的治疗效果在体内容易地测定，例如在小鼠的癌症模型中，并且通过测量例如治疗组和对照组之间的肿瘤体积的变化来测定。试剂盒最后，本发明还提供了包含本发明的至少一种抗体样结合蛋白的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含a)至少一种如上文“抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白”一节中所定义的本发明的抗体样结合蛋白，b)任选的包装材料，和c)任选的包含在所述包装材料中的标签或包装插页，指示所述抗体样结合蛋白用于有效治疗癌症或用于治疗癌症。在相关实施方案中，本发明的至少一种抗体样结合蛋白包含在单个和/或多室预填充注射器(例如液体注射器和lyo注射器(lyosyringe))中。在一个实施方案中，本发明包括用于生产单剂量施用单位的套件。因此，在一个实施方案中，本发明的试剂盒的a)所示的本发明的至少一种抗体样结合蛋白是包含在第一容器中的本发明的干燥抗体样结合蛋白。然后试剂盒还含有具有水性制剂的第二容器。因此，在一个实施方案中，试剂盒包含a)第一容器，其包含如上文“抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白”一节中所定义的本发明的至少一种干燥的抗体样结合蛋白，b)包含水性制剂的第二容器；c)任选的包装材料，和d)任选的包含在所述包装材料内的标签或包装插页，其指示所述抗体样结合蛋白用于有效治疗癌症或用于治疗癌症。含水制剂通常是包含如上文“药物组合物”部分中所定义的药学上可接受的载剂的水溶液。在相关实施例中，“第一容器”和“第二”容器是指多室预填充注射器(例如lyo注射器)的腔室。现在将参考以下附图和实施例更详细地描述本发明。本文引用的所有文献和专利文献通过引用并入本文。尽管在前面的描述中已经对本发明进行了详细的说明和描述，但是这些示例被认为是说明性的或示例性的而不是限制性的。序列简述seqidno:1显示蛋白的全长人cd3ε的氨基酸序列，包括信号肽，如可以登录号p07766获取自uniprot数据库。seqidno:2显示了全长食蟹猴cd3ε的氨基酸序列，包括信号肽，如可以登录号q95li5获取自uniprot数据库。seqidno:3显示了成熟人cd3εhis标记的fc融合体的氨基酸序列，其包含全长野生型人cd3ε蛋白的氨基酸23至126。seqidno:4显示了成熟食蟹猴cd3εfc-融合序列的氨基酸序列，其包含全长野生型食蟹猴cd3ε蛋白(seqidno:2)的氨基酸23至117，其在氨基酸位置35与野生型序列的氨基酸位置57相比含有一个ala至val交换。seqidno:5，6和7显示了所谓“hz20g6”抗体的cdr1-h，cdr2-h和cdr3-h的氨基酸序列。seqidno:8显示了所谓“hz20g6”抗体的cdr3-l的氨基酸序列。seqidno:9显示了人源化“20g6”抗cd3抗体的vh变体氨基酸序列vh1d。seqidno:10显示了人源化“20g6”抗cd3抗体的vl变体氨基酸序列vl1c。seqidno:11显示了seqidno:10的人源化“20g6”抗cd3抗体的vl1c变体的cdr1-l的氨基酸序列。seqidno:12显示了全长人cd123蛋白的氨基酸序列，包括信号肽，可以np_002174.1从ncbi数据库获得和以p26951从uniprot数据库获得。seqidno:13显示了全长食蟹猴cd123蛋白的氨基酸序列，包括信号肽，可从ehh61867.1从genbank数据库获得和以g8f3k3从uniprot数据库获得。seqidno:14显示了包含全长人cd123蛋白(seqidno:12)的氨基酸22至305的成熟人cd123his-ii标记的fc-融合物的氨基酸序列。seqidno:15显示了成熟食蟹猴cd123his-ii标记的fc融合物的氨基酸序列，其包含全长食蟹猴cd123蛋白(seqidno:13)的氨基酸22至305。seqidno:16显示了所谓的codv-fab“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的接头l1的氨基酸序列。seqidno:17显示了所谓codv-fab“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的接头l2的氨基酸序列。seqidno:18显示了所谓的codv-fab“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的氨基酸序列cl。seqidno:19显示了所谓的codv-fab“hz20g6xhz7g3“抗体样结合蛋白地氨基酸序列ch1。seqidno:20显示了接头序列(gly-gly-gly-gly-ser)的氨基酸序列。seqidno:21显示了接头序列(gly-gly-gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser)的氨基酸序列。seqidno:22显示了接头序列(thr-val-ala-ala-pro)的氨基酸序列。seqidno:23显示了接头序列(gln-pro-lys-ala-ala)的氨基酸序列。seqidno:24显示了接头序列(gln-arg-ile-glu-gly)的氨基酸序列。seqidno:25显示了接头序列(ala-ser-thr-lys-gly-pro-ser)的氨基酸序列。seqidno:26显示了接头序列(ala-ser-thr-lys-gly-pro-ser)的氨基酸序列。seqidno:27显示了接头序列(gly-gly-gly-ser)的氨基酸序列。seqidno:28显示了接头序列(ser-gly-gly-gly-ser)的氨基酸序列。seqidno:29显示了接头序列(gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser)的氨基酸序列。seqidno:30显示了接头序列(gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser)的氨基酸序列。seqidno:31显示了接头序列(gly-gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser)的氨基酸序列。seqidno:32显示了接头序列(lys-thr-his-thr)的氨基酸序列。seqidno:33显示了接头序列(lys-thr-his-thr-ser)的氨基酸序列。seqidno:34显示了接头序列(asp-lys-thr-his-thr-ser)的氨基酸序列。seqidno:35显示了接头序列(asp-lys-thr-his-thr-ser-pro)的氨基酸序列。seqidno:36显示了接头序列(ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro)的氨基酸序列。seqidno:37显示了接头序列(ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro)的氨基酸序列。seqidno:38显示了接头序列(lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser)的氨基酸序列。seqidno:39显示了接头序列(pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser)的氨基酸序列。seqidno:40显示了接头序列(pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro)的氨基酸序列。seqidno:41显示了接头序列(glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro)的氨基酸序列。seqidno:42显示了接头序列(glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly)的氨基酸序列。seqidno:43显示了接头序列(gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly)的氨基酸序列。seqidno:44显示了接头序列(gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly)的氨基酸序列。seqidno:45显示了接头序列(gly-gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly)的氨基酸序列。seqidno:46显示了接头序列(gly-gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly-gly)的氨基酸序列。seqidno:47显示了接头序列(gly-gly-gly-glu-pro-lys-ser-asp-lys-thr-his-thr-ser-pro-pro-ser-pro-gly-gly-gly)的氨基酸序列。seqidno:48和49显示了所谓的“hz7g3”抗体的cdr1-l和cdr3-l的氨基酸序列。seqidno:50和51显示seqidno:52的所谓的人源化“7g3”抗体的cdr1-h和cdr3-h的氨基酸序列。seqidno:52显示了所谓的人源化“7g3”抗体的重链可变域的进一步变体的氨基酸序列。seqidno:53显示seqidno:52的所谓的人源化“7g3”抗体之一的cdr2-h的氨基酸序列。seqidno:54显示了所谓的人源化“7g3”抗体的轻链可变域的氨基酸序列。seqidno:55显示了所谓的codv-fab-ol1和codv-fab-ol1a的式[i]的多肽和codv-fab-ol1-节x穴-rf无gs(wogs)“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的氨基酸序列。seqidno:56显示了接头序列(gly-gly-ser-gly-ser-ser-gly-ser-gly-gly)的氨基酸序列。seqidno:57显示了所谓的codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的所述式[iv]的多肽的氨基酸序列。seqidno:58显示了所谓的codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的fc2区的氨基酸序列。seqidno:59显示了所谓的codv-fab-tl1-rf和codv-fab-tl1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的式[iii]的多肽的氨基酸序列。seqidno:60显示了所谓的codv-fab-tl1-rf和codv-fab-tl1“hz20g6xhz7g3”的式[iii]的多肽的fc区的氨基酸序列。seqidno:61显示了所谓的codv-fab-ol1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的式[iii]的多肽的氨基酸序列。seqidno:62显示了所谓的codv-fab-ol1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的fc区的氨基酸序列。seqidno:63显示了所谓的codv-fab-ol1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的fc段(fc3)的氨基酸序列。seqidno:64显示了所谓的codv-fab-ol1a“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的fc段(fc3)的氨基酸序列。seqidno:65显示了所谓的codv-fab-ol1a和不含gs的codv-fab-ol1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的式[iii]的多肽的氨基酸序列。seqidno:66显示了所谓的codv-fab-ol1a和codv-fab-ol1-节x穴-rfwogs“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的式[iii]多肽的fc域的氨基酸序列。seqidno:67显示了本发明的所谓的抗体样结合蛋白的式[iii]的多肽的广义氨基酸序列(即codv-fab-tl1-节-rfx穴，codv-fab-tl1-节x穴-rf，codv-fab-tl1，codv-fab-tl1-节x穴，codv-fab-ol1-节x穴-rf)无gs(wogs)。seqidno:68显示了本发明的所谓的抗体样结合蛋白的式[iii]的多肽的fc域的广义氨基酸序列(即codv-fab-tl1-节-rfx穴，codv-fab-tl1-节x穴-rf，codv-fab-tl1，codv-fab-tl1-节x穴，codv-fab-ol1-节x穴-rf无gs(wogs))。seqidno:69显示了所谓的codv-fab-ol1-节x穴-rf无gs(wogs)“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的fc段(fc3)的氨基酸序列。seqidno:70显示了所谓的抗体样结合蛋白的化学式[iv]的多肽的fc域(fc2)的广义氨基酸序列，codv-fab-tl1-节-rfx穴，codv-fab-tl1-节x穴-rf，codv-fab-tl1，codv-fab-tl1-节x穴。seqidno:71显示了所谓的抗体样结合蛋白(codv-fab-tl1-节-rfx穴，codv-fab-tl1-节x穴-rc，codv-fab-tl1，codv-fab-tl1-节x穴)的式[iv]的多肽的广义氨基酸序列。seqidno:72显示了所谓的codv-fab-tl1-节-rfx穴“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的所述式[iv]的多肽的氨基酸序列seqidno:73显示了所谓的codv-fab-tl1-节-rfx穴“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的所述式[iv]的多肽的氨基酸序列seqidno:74显示了所谓的codv-fab-tl1-节-rfx穴和codv-fab-tl1-节-x穴“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的式[iii]的多肽的氨基酸序列seqidno:75显示了所谓的codv-fab-tl1-节-rfx穴和codv-fab-tl1-节-x穴“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的式[iii]的多肽的fc的氨基酸序列seqidno:76显示了所谓的codv-fab-tl1-节x穴-rf和codv-fab-tl1-节-x穴“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的所述式[iv]的多肽的氨基酸序列seqidno:77显示了所谓的codv-fab-tl1-节x穴-rf和codv-fab-tl1-节x穴“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的式[iv]的多肽的fc2域的氨基酸序列seqidno:78显示了所谓的codv-fab-tl1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的式[iii]的多肽的氨基酸序列seqidno:79显示了所谓的codv-fab-tl1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的式[iii]的多肽的氨基酸序列seqidno:80显示了所谓的codv-fab-tl1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的所述式[iv]的多肽的氨基酸序列seqidno:81显示了所谓的codv-fab-tl1“hz20g6xhz7g3”抗体样结合蛋白的式[iv]的多肽的fc2域的氨基酸序列seqidno:82显示了如wo2015026892中所示的氨基酸序列seqidno:1。seqidno:83显示了如wo2015026892中所示的氨基酸序列seqidno:3。seqidno:84显示了streptag的氨基酸序列。seqidno:85显示了histag的氨基酸序列。附图图1：a)codv-fab-tl1-rf的示意图b)sds-凝胶c)sec谱(峰值在178，17ml表示异二聚体级分，蛋白a后的产率＝12mg/l，52％异二聚体。图2：a)codv-fab-tl1-节-rfx穴的示意图b)sds-gelc)sec谱(峰值在177，90ml表示异二聚体级分，蛋白a后的产率＝20mg/l，85％异二聚体。图3：a)codv-fab-tl1-节x穴-rf的示意图b)sds-gelc)sec谱(峰值在180，54ml的峰表示异源二聚体级分，蛋白a后的产率＝9mg/l，55％异二聚体。图4：codv-fab-ol1-节x穴-rf_wogs(不含gs)的示意图b)sds-凝胶c)sec谱(峰值在180，59ml表示异二聚体级分，蛋白a后的产率＝5mg/l，88％异二聚体。图5：证明本发明的抗体结合蛋白的稳定性的图。加速应激条件(2周，40℃)后的聚集倾向通过sec进行评估。相比之下，在-80℃或4℃储存的相同蛋白的sec谱。a)codv-fab-tl1-rfb)codv-fab-tl1-节-rfx穴c)codv-fab-tl1-节x穴-rfd)codv-fab-ol1-节x穴-rfwogs图6和8：在人t细胞存在下，完全人codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”ivq3d在所有测试的剂量处抑制全身的molm13肿瘤生长。图7和9：人t细胞存在下的完全人codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”ivq3d与所有测试剂量的长骨中的肿瘤消退有关。图10：codv-fab-tl和codv-fab-ol(进一步显示lala突变(当使用igg1主链的fc时)和节-入穴突变)的结构的示意图。图11：抗体样结合蛋白codv-fab-tl1-节-rfx穴，codv-fab-tl1-节x穴-rf，codv-fab-tl1，codv-fab-tl1-rf，codv-fab-tl1-节x穴和代表其广义氨基酸序列的seqidno:70的式[iv]的多肽的fc域(fc2)的序列比对。抗体样结合蛋白codv-fab-tl1-rf已在pct/ep2016/051386中描述。从这个比对可以看出，codv-fab-tl1-节-rfx穴,codv-fab-tl1-节x穴-rf,codv-fab-tl1-节x穴的式[iv]的多肽的fc域(fc2)与抗体样结合蛋白codv-fab-tl1-rf的所有式[iv]的多肽的fc域(fc2)的区别在于存在“节”突变，且式[iv]的多肽的式[iv]的多肽的fc域(fc2)与抗体样结合蛋白codv-fab-tl1-rf的式[iv]的多肽的fc域(fc2)不同在于缺乏rf突变。图12：抗体样结合蛋白codv-fab-tl1-节-rfx穴,codv-fab-tl1-节x穴-rf,codv-fab-tl1,codv-fab-tl1-rf,codv-fab-tl1-节x穴和代表其广义氨基酸序列的seqidno:68的式[iii]的多肽的fc域的序列比对。从这种比对可以看出，codv-fab-tl1-节-rfx穴,codv-fab-tl1-节x穴-rf,codv-fab-tl1-节x穴的式[iii]的多肽的thefc域与抗体样结合蛋白codv-fab-tl1-rf的区别在于存在“穴”突变。图13：抗体样结合蛋白codv-fab-ol1,codv-fab-ol1a,codv-fab-ol1-节x穴-rfwogs的式[iii]的fc域的序列比对。图14：抗体样结合蛋白codv-fab-ol1，codv-fab-ol1a，codv-fab-ol1-节x穴-rfwogs的式[iii]的多肽的fc3域的序列比对。抗体样结合蛋白codv-fab-ol1和codv-fab-ol1a已经在pct/ep2016/051386中有描述。从这种比对可以看出，codv-fab-ol1-节x穴-rfwogs的式[iii]的多肽的fc3域与抗体样结合蛋白codv-fab-ol1和codv-fab-ol1a区别在于缺乏氨基酸gs。图15：在人t细胞存在下，完全人codv-fab-tl1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”ivq3d在所有测试剂量处抑制全身的molm13肿瘤生长。图16：在人t细胞存在下，完全人codv-fab-tl1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”ivq3d与所有测试剂量的长骨中的肿瘤消退相关。如以下实施例所示，这些抗cd3/抗cd123抗体样结合蛋白包括导致简化纯化并在表达和纯化期间减少聚集从而导致异二聚体的量增加的突变，同时在不存在表达cd123的靶细胞(例如thp-1细胞)的情况下具有低t细胞活化，但在表达cd123的靶细胞(例如thp-1细胞)的情况下具有t细胞的高活化。实施例实施例1：hz20g6xhz7g3codv-fab-tl1-rf,hz20g6xhz7g3codv-fab-ol1和dart1.1tcd123xcd3codv或dart的细胞激活效果如2.9所述，通过基于流式细胞术检测原代人t细胞表面的活化标志物cd25和cd69的表达来分析抗体样结合蛋白对t细胞活化状态的影响。比较包括在wo2015026892中描述的dart形式的单链cd123×cd3双特异性双抗体(以下称为“mgd006”)，其包含序列seqidno:82的第一多肽链(其为seqidno:1为wo2015026892所示)和序列seqidno:83(其是wo2015026892中所示的seqidno:3)的第二多肽链通过二硫键彼此共价键合。当codv与分离的t细胞单独温育时，cd4阳性和cd8阳性t细胞表面上可检测到晚期活化标志物cd25的表达显著增加(数据未显示)。同样地，两个t细胞亚群的早期活化标志物cd69的表达水平没有浓度依赖性增加(表1)。因此，该结构被评估为不活跃(na)。相比之下，当添加thp-1靶细胞时，可以测量两种标记物的表达水平的巨大增加(cd25数据未显示，cd69数据表2)。表1：在基于流式细胞术的测定中，双特异性cd123×cd3codv或dart对cd69表达水平检测的t细胞活化状态的影响。呈现的是仅用t细胞测定的100nm抗体浓度下活化的cd8和cd4t细胞的均值百分数。表1中显示的结果表明，在所测试的条件下，单链抗体(dart)在没有靶细胞的情况下导致明显更多的t细胞活化。表2：在基于流式细胞术的测定中，通过cd69表达水平检测到的含有codv分子和单链dart的双特异性完全人源化7g3对t细胞活化状态的影响。显示活化的cd8和cd4t细胞的代表性测试的ec50值。通过thp-1靶细胞和原代t细胞的共培养进行测定。评估了codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”，codv-fab-ol1“hz20g6xhz7g3”和单链dartmgd006的细胞毒性作用。通过biacore测量每个双特异性构建体对cd3ε/δ-复合物和cd123的亲和力。此外，如2.8(表3)中所述进行细胞毒性测定。表3：双特异性cd123×cd3codv分子和dart(mgd006)的亲和力和活性为了评估分子在存在(需要的)和不存在(不需要的)靶细胞的情况下触发t细胞活化的潜力，实施了新的测定。将nfat-re-luc2jurkat细胞(promega#cs176401)与thp-1靶细胞在37℃和rpmi1640中的5％co2中以1:3的效应物与靶标比例温育，与2g/l(11mm)葡萄糖，与glutamax，与384孔板中加入的25mmhepes。5小时后，停止温育并使用bio-glo荧光素酶测定系统(promega#g7940)在发光微量板读数器中测量发光。表4：在jurkat-nfat-luc报告基因细胞系中测量的cd123×cd3codv分子和mgd006诱导的t细胞活化表4中显示的结果表明，所有抗体样结合蛋白在靶细胞存在下诱导报告细胞活化，其ec50值低于nm。对于t细胞接合方法，t细胞活化应限于靶细胞的存在。这对于codv分子而言观察到了，因为在没有靶细胞的情况下没有明显的发光信号。相比之下，单链dart分子在没有靶细胞的情况下诱导更高的报道细胞系活化。这些结果与用原代t细胞获得的结果一致。1.2cd123xcd3双特异性codv-fab-tl1-rf和cd123xcd3双特异性dart的体内抗肿瘤活性材料和方法从全血分离人pbmc和t细胞通过ficoll梯度离心从人体健康供体的全血分离pbmc。全血在无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)中以1:1稀释。然后，在15mlficoll-paque存在下，将2体积的35ml的稀释的血液加入两个50ml的falcon管中。将管在室温以200g离心40分钟，无需制动(brake)。回收两个血沉棕黄层，并加入6个50mlfalcon管中，加入45ml无菌pbs，在10分钟内以100g无制动在室温离心3次(在每次离心之间弃去上清液，加入45mlpbs)。最后一次离心后，将两个沉淀放在一起，最终体积为50ml，所述最终体积用pbs在50mlfalcon管中完成。总体的活pbmc数量由vicell计数定义。然后在来自myltenyibiotech(130-091-221)的automacs运行缓冲液中回收沉淀物，并使用来自miltenyibiotech(130-091-156)的阴性选择试剂盒和automacs根据制造商说明书从pbmc中分离t细胞。回收纯化的t细胞，并以2.5x10e+6个细胞/ml的浓度在xvivo-155％his+peni-strepto1x培养基中培养。人t细胞扩增使用来自miltenyibiotech(130-091-441)的t细胞活化/扩增试剂盒，在14天内使人富集的t细胞群在体外活化和扩增，用于体内施用的人t细胞制备物将细胞和细胞培养基在400g离心10分钟。以无菌pbs中2x10e+7细胞/ml的浓度回收沉淀。根据制造商的说明书，使用来自myltenyibiotech(130-092-168)的macsimag分离器，从扩增的t细胞除去活化珠。通过vicell计数富集的t细胞群，并回收于50mlfalcon管中的25ml无菌pbs中。在室温10分钟内以400g离心的步骤后，回收细胞沉淀于足够体积的无菌pbs中，以得到5x10e+7个细胞/ml的终浓度。肿瘤模型表达cd123的molm-13人急性骨髓性白血病细胞获取自微生物和细胞培养物的leibniz-institutdsmz-german收集(dsmzbraunshweig,germany)。细胞在rpmi1640glutamax培养基(用胎牛血清20％完成)中的培养物(37℃，5％co2，95％湿度)中生长。通过非复制型慢病毒携带的荧光素酶载体(sv40-pgl4-puro–即由连接到萤光素酶2的猿猴病毒40启动子和嘌呤霉素抗性盒序列组成的萤光素酶载体)感染molm-13细胞。在nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wji/szjnsg小鼠中静脉内(iv)注射molm13-luc+肿瘤细胞(每只动物10e+6个细胞在200μlpbs悬浮液中)。24小时后，在0.2ml无菌pbs的体积下，将10e+7个人t细胞腹膜内(ip)施用于相同的小鼠。使用livingimage3.2采集软件(perkin-elmer,waltham,m,usa)，使用ivis100成像仪(perkinelmer,waltham,ma,usa)进行肿瘤植入后第三天的基线生物发光成像。在成像前15分钟，对动物ip注射甲基荧光素钾盐(批次316019,promega,lyon,france)120mg/kg溶液。在成像前5分钟，用氯胺酮/(120mg/kg；6mg/kgim，5ml/kg)麻醉小鼠。通过静脉内途径(iv)的codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”和cd123xcd3双特异性dart竞争剂(单链抗体dart形式mgd006或称为“dart工具”的密切类似物)或pbs处理在骨骼中已经检测到的已建立的肿瘤植入后第四天开始，如表5所示。表5：cd123xcd3双特异性codv-fab-tl1-rf静脉内(iv)评估研究设计数据收集和功效标准从第3天到测定结束时监测动物体重，以便遵循治疗的影响。连续3天产生20％体重减轻或15％体重减轻或10％或更多药物相关死亡的剂量被认为是过度毒性的剂量。动物体重包括肿瘤重量。肿瘤负载之后是非侵入性生物发光成像(bli)。基线bli在肿瘤植入后第三天、治疗开始前24小时进行。基于全身生物发光信号，将动物分在不同的组中。通过在肿瘤植入后第7、10和14天的bli信号测量，在后腿中的全身和长骨中随后是肿瘤生长。通过分割来测量长骨信号，并且可能受到附近局部区域信号(例如在后期时间点的软组织中的残留信号)的影响。将治疗组与携带molm13-luc+弥散性肿瘤和人t细胞的对照动物进行比较。主要功效终点是治疗组和对照组(dt/dc)的肿瘤信号自基线变化的比例，部分肿瘤消退数(pr)和完全肿瘤消退数(cr)。对每个治疗组的每只动物监测基于生物发光信号曲线(以phot/sec表示)的肿瘤生长，并以所有身体和骨分割信号的中值曲线±mad表示。对于每个对照(c)或处理的(t)动物，并且通过在指定观察日从肿瘤信号减去第一次处理当天(分期日)的肿瘤信号，计算肿瘤生物发光信号的变化。对于治疗组计算中值t，并计算对照组的中值c。然后计算比率t/c并以百分比表示：dt/dc＝[(中值t天obs-中值t天3)/(中值c天obs-中值c天3)]×100当dt/dc低于10％时，dt/dc在实验结束时(第14天)低于42％时，该剂量被认为具有治疗活性。百分比的肿瘤消退定义为治疗组在指定观察日的肿瘤信号与其治疗第一天的信号相比的减少百分比。在特定的时间点和对于每个动物，％消退计算为：鉴于由于荧光素动力学和可能的ip缺失注射引起的信号变异性的风险，仅当至少在两个连续时间点观察时，将动物的信号消退视为真正的肿瘤消退。部分消退(pr)：如果肿瘤信号在两个连续时间点下降到低于治疗开始的信号，一个优于基线信号的50％，则消退定义为部分的。完全消退(cr)：如果肿瘤信号在连续两个时间点下降超过50％低于在治疗开始时的信号，则消退定义为完整的。统计分析iv途径化合物评价将每组治疗的个体生物发光信号与其他治疗组相比，使用bonferroni-holm调整用于多样性成对比较，然后是具有按天数重复测量的双因子方差分析：p>0.05:ns,0.05>p>0.01:*,p<0.01:**。对全身生物发光信号和长骨生物发光信号进行统计分析结果cd123xcd3双特异性codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”iv在人t细胞存在下，在全血中完全人codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”ivq3d在所有测试剂量(1.3，0.13和0.013nmol/kgq3d)处抑制molm13肿瘤生长，dt/dc分别为20％，14％和38％(图6和8)，且分别与具有4/7cr，6/8cr和2/6cr的在所有测试剂量处的长骨中肿瘤消退相关(图7和9)。在全身和骨骼中以0.13nmol/kgq3d获得完全人codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”最大反应。在该剂量处，活性与dart1.3nmol/kgivqd(全血dt/dc29％具有1/7cr而长骨中为1/7pr)没有统计学差异。数据通过终末组织病理学分析确认(未显示)。在全身和长骨之间观察到的差异与iv注射后的髓外肿瘤扩散后紧接发生的卵巢和腹部脂肪中的残余肿瘤生长有关。1.3cd123xcd3双特异性codv-fab-tl1-rf和cd123xcd3双特异性codv-fab-tl1-节x穴-rf材料与方法第1.2段描述了人t细胞的分离和扩增。肿瘤模型肿瘤模型如第1.2段所述。通过静脉内途径(iv)的codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”和codv-fab-tl1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”或pbs处理在骨骼中已经检测到的已建立的肿瘤植入后第四天开始，如表6所示。统计分析iv途径化合物评价如第1.2段所述。表6：cd123xcd3双特异性codv-fab-tl1-节x穴-rf静脉内(iv)评估研究设计结果cd123xcd3双特异性codv-fab-tl1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”iv在人t细胞存在的情况下，完全人codv-fab-tl1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”ivq3d在所有测试剂量(1.3、0.13和0.013nmol/kgq3d)处抑制molm13肿瘤生长，全身中δt/δc分别为7％、5％和15％，分别与在所有测试剂量处5/8cr、8/8cr和4/6cr的长骨肿瘤消退相关(图15和16)。在全身和骨骼中在0.13nmol/kgq3d处获得完全人codv-fab-tl1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”最大反应。cd123xcd3双特异性codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”iv在人t细胞存在下，完全人codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”ivq3d在所有测试剂量(1.3、0.13和0.013nmol/kgq3d)处抑制molm13肿瘤生长，全血中δt/δc分别为12％、6％和4％，分别与在所有测试剂量处5/8cr、5/7cr和7/7cr的长骨肿瘤消退相关(图15和16)。在所有测试的剂量处，cd123xcd3双特异性codv-fab-tl1-节x穴-rf“hz20g6xhz7g3”活性与codv-fab-tl1-rf“hz20g6xhz7g3”没有统计学差异。数据通过终末组织病理学分析确认。在全身和长骨之间观察到的差异与iv注射后的髓外肿瘤扩散后紧接发生的卵巢和腹部脂肪中的残余肿瘤生长有关。实施例2：hz20g6xhz7g3codv-fab-tl1，hz20g6xhz7g3codv-fab-ol1的变体2.1hcd3ε/δ-hfc融合表达质粒(cd3ed-fc)的构建使用含有质粒的cdna作为模板，如下文详细描述的，产生了人和食蟹猴cd3ε和cdδ融合蛋白，其在阅读框中具有包含人免疫球蛋白igg的铰链区，ch2和ch3结构域的重链恒定区，所述igg携带8xhis或strep-ii标签用于可选的串联纯化。使用人基因组dna作为模板，扩增人cd3ε和人cdδ亚基胞外结构域，包括信号序列。通过连接pcr合并得到的扩增切割和纯化的pcr产物，并使用nhei和hindiii位点通过infusion方法连接到哺乳动物表达载体pxl中。将每个亚基克隆在一个质粒上。所得到的成熟人cd3εhis标记的fc融合蛋白的序列在本文公开于seqidno:3。seqidno:3的氨基酸1至104对应于野生型全长人cd3ε(本文公开为seqidno:1，在uniprot数据库中可以登录号p07766获得)的氨基酸23至126，因此为人cd3ε的胞外结构域。以食蟹猴基因组dna为模板，扩增食蟹猴cd3ε和cd3δ胞外结构域，包括信号序列。通过连接pcr合并得到的扩增切割和纯化的pcr产物，使用nhei和hindiii通过infusion方法连接到哺乳动物表达载体pxl中。将每个亚基克隆在一个质粒上。成熟食蟹猴cd3εfc融合蛋白的所得序列在seqidno:4中公开。seqidno:3的氨基酸1至95对应于全长食蟹猴cd3ε蛋白的氨基酸23至117，因此包含野生型全长食蟹猴cd3ε的胞外结构域(本文公开于seqidno:2，在uniprot数据库中可以登录号q95li5获得)。与野生型序列的氨基酸位置57相比，克隆的融合蛋白在氨基酸位置35处进一步含有一个丙氨酸-缬氨酸交换。2.2人和食蟹猴cd3ε/δ-fc的表达和纯化用表达质粒瞬时转染在f17无血清悬浮培养(life)中生长的自由式hek293细胞。使用cellfectin转染试剂(life)进行代表cd3ε和cd3δ胞外结构域(ecd)亚基的两种质粒的共转染。细胞在37℃培养7天。通过离心收获含有重组蛋白的培养上清液，并通过过滤(0.22μm)澄清。为了纯化，将fc融合蛋白变体捕获在蛋白a基质(ge)上，并通过ph漂移进行洗脱。通过尺寸排阻层析法(sec)使用superdex200(ge)和最终超滤浓缩步骤对蛋白质进行提纯(polishing)后，将该蛋白质用于进一步测定。在蛋白a上捕获后，将人异二聚体另外应用于his-trap柱(ge)并脱盐。将洗脱的蛋白质应用于链霉亲和素柱(ge)，并用d-脱硫生物素进行洗脱，然后使用superdex200(ge)通过sec进行最终提纯。该策略用于从同二聚体分离异二聚体。2.3cd123(il3ra)–hfc融合表达质粒(cd123-fc-his)的构建使用含有质粒的cdna作为模板，在具有免疫球蛋白igg的重链恒定区，人铰链区，ch2和ch3域且另外携带六组氨酸标签的阅读框中产生人cd123融合蛋白。使用人基因组dna作为模板，扩增人cd123(il3ra)胞外结构域，包括信号序列。通过连接pcr组合得到的扩增的切割和纯化的pcr产物，并使用nhei和hindiii位点通过infusion方法连接到哺乳动物表达载体pxl中。得到的成熟人cd123his-ii标记的fc融合蛋白的序列以seqidno:14公开。氨基酸1至284对应于全长野生型人cd123蛋白的氨基酸22至305(本文以seqidno:12公开，可从ncbi数据库以登录号np_002174.1获得)，因此是人cd123的胞外结构域。2.4人cd123-fc-his的表达和纯化用表达质粒瞬时转染在f17无血清悬浮培养(life)中生长的自由式hek293细胞。使用cellfectin转染试剂(life)进行转染。细胞在37℃培养7天。通过离心收获含有重组蛋白的培养上清液，并通过过滤(0.22μm)澄清。为了纯化，将fc融合蛋白变体捕获在蛋白a基质(ge)上，并通过ph漂移进行洗脱。在pbs中通过sec使用superdex200(ge)和最终超滤浓缩步骤提纯蛋白质之后，将蛋白质用于进一步测定。本发明的每种多肽，例如第2.1至2.4节所述的多肽可以包含标签，如his标签或strep标签，因为此类标签可能例如使得纯化更容易。标签可能例如对应于his标签(hhhhhh，也称seqidno:85)或strep-ii标签(wshpqfek，也称seqidno:84)，并且这两个标签可以彼此替代。或者，本发明的多肽没有任何标签。本文所述的任何多肽的不带标签和带标签形式都包括在本发明的范围内。在一个实施方案中，本发明的多肽包含信号肽和/或前肽，使其分泌更容易和/或更有效。或者，本发明的多肽对应于成熟多肽，即对应于没有信号肽和前肽的多肽。本文所述的任何多肽的成熟和全长形式均包括在本发明的范围内。2.5codv抗体样结合蛋白的表达和纯化对使用单克隆抗体“hz20g6”和“hz7g3”的序列的双特异性cd3xcd123codv抗体样结合蛋白进行表达和纯化。用轻链和重链质粒以等比例转染在f17血清游离悬浮培养基(invitrogen)中生长的自由式hek293细胞。对于codv-fab-tl1抗体样结合蛋白，抗体信息编码在一条轻链和一条重链上(图1-3)，而对于codv-fab-ol1抗体样结合蛋白如codv-fab-ol1-节x穴-rf无gs(图4)，如制造商所述，使用聚乙烯雌二醇转染试剂转染一条轻链和两条重链质粒。于37℃在kuhnerisf1-x振荡培养箱中以8％co2以110rpm培养细胞。培养7天后，通过离心除去细胞，加入10％vol/vol1mtrishclph8.0，并通过0.2μm的瓶顶过滤器过滤上清液以除去颗粒。所有codv分子，codv-fab-tl1抗体样结合蛋白以及codv-fab-ol1抗体样结合蛋白通过蛋白a上的亲和层析柱(hitrap蛋白ahp柱，gelifesciences)纯化。在用0.1mcitrat,ph3.0从柱洗脱后，使用配制在pbs(gibco14190-136)中的hiprep26/10脱盐柱将codv构建体脱盐。为了从聚集体分离单体，使用hiloadsuperdex20026/60320ml柱(gehealthcare目录号:29-9893-36)，在pbs(gibco14190-136)中对两种构建体(codv-fab-tl1抗体样结合蛋白和codv-fab-ol1抗体样结合蛋白)进行了高分辨率分级步骤。合并单体级分，使用vivaspin20离心柱(vs2002sartoriusstedimbiotech)浓缩至1mg/ml，并使用0.22μm膜(syringefiltersslgv033rs)过滤。通过测量280nm处的吸光度来测定蛋白浓度。在还原和非还原条件下通过sds-page分析每批次，以确定每个亚基和单体的纯度和分子量。使用来自charlesriver的endosafe-pts系统进行定量lal测定，以确保无内毒素样品。表6：不同codv抗体样结合蛋白的蛋白产量与codv-fab-tl1-rf相比，codv-fab-tl1-节-rfx穴的表达导致更高的产量和更高量的正确异二聚体级分。令人惊讶的是，rf突变定位的变化扭转了这一积极作用，如codv-fab-tl1-节x穴-rf所观察到的。codv-fab-ol1-节x穴-rfwogs构型积极影响异二聚体级分的量，而不影响产量(表6)。2.6用spr对cd3xcd123codv抗体样结合蛋白对人cd3ε/δ和人cd123的亲和力评估使用具有hbs-ep(gehealthcare)作为测定缓冲液的biacore3000或biacoret200仪器(gehealthcare)，通过表面等离子体共振(spr)测量codv抗体样结合蛋白对人cd3ε/δ和人cd123的结合亲和力。使用his捕获试剂盒(gehealthcare)实现对cd3ε/δ-fc或cd123-fc-his融合蛋白的捕获。使用胺偶联试剂盒(br-100-50，gehealthcare)将捕获抗体偶联至cm5芯片(gehealthcare)至约12.000ru。以10μl/min捕获cd3εδ-fc或cd123-fc-his融合蛋白，以得到30ru的rmax值。与codv抗体样结合蛋白的结合动力学测定为30μl/分钟。使用测定缓冲液中的3-200nm的codv抗体样结合蛋白的两倍稀释度。所有fab浓度与双重缓冲空白液一起重复运行进行双重参考。以30μl/分钟的1分钟注射10mm甘氨酸ph1.5进行捕获表面的再生。使用bia评估软件(gehealthcare)进行数据分析。使用具有质量传递的1:1langmuir模型全局拟合数据。表7：spr数据(hucd3εδ/hucd123)对于不同的cd3xcd123codv(称为codv-fab-tl1-节-rfx穴,codv-fab-tl1-节x穴-rf“,codv-fabol1-节x穴-rfwogs)获得的对hucd3εδ和hucd123的结合动力学对所有测试构建体而言是相似的。2.7cd3xcd123codv抗体样结合蛋白的稳定性评估2.7.1通过差示扫描荧光测定法(dsf)测量的热稳定性使用差示扫描荧光测定法(dsf)测定熔点tm。将样品在d-pbs缓冲液(invitrogen)中稀释至0.2μg/μl的终浓度为，包括白色半裙边96孔板(biorad)中的d-pbs中的sypro-orange染料(invitrogen，dmso中的5000x储液)的4x浓缩溶液。所有测量使用myiq2实时pcr仪(biorad)一式两份进行。在iq5软件v2.1(biorad)中生成了解曲线的负一阶导数曲线(-d(rfu)/dt)。然后将数据导出到excel中，以确定tm和数据的图形显示。发现所有测试的codv构建体的熔点(表8)在56-57℃非常相似。表8：dsf数据构建体tm(℃)codv-fab-tl1-rf57codv-fab-tl1-节-rfx穴56codv-fab-tl1-节x穴-rf56codv-fab-ol1-节x穴-rf_wogs572.7.2加速温度应激时的稳定性为了评估加速温度应激条件下codv构建体的稳定性，在40℃将蛋白质在0.5ml安全锁管(eppendorfbiopur)中的d-pbs缓冲液中以1mg/ml温育2周。将对照样品在-80℃和4℃保持相同的时间段。应激处理后，用bioseccurityhplc系统(psspolymer)通过分析尺寸排阻层析(sec)分析样品的聚集物含量。使用tskgelsupersw3000柱(4μm，4,6x300mm，tosohbioscience)上的5μl蛋白溶液，用具有250mmnacl，100mm磷酸钠ph6.7作为运行缓冲液的tskgelsw型保护柱(4μm，4,6x35mm，tosohbioscience)以0.25ml/min来进行层析。采用wingpc软件(psspolymer)分析数据。加速温度应激后分析的所有codv结构与对照样品相比，其聚合物含量增加(图5)。codv-fab-tl1-rf(pb05126)应激后的聚合物含量为6％，codv-fab-tl1-节-rfx穴为4.1％，codv-fab-tl1-节x穴-rf为6.6％且codv-fab-ol1-节x穴-rfwogs为3.4％。2.8codvcd123xcd3介导的thp-1细胞的细胞毒性作用通过基于流式细胞术的细胞毒性测定分析codvcd123×cd3的t细胞接合作用。效应细胞是从健康供体全血中分离的原代t细胞。thp-1细胞用作表达cd123的靶细胞。通过ficoll密度离心从edta处理的健康供体的200ml外周血中分离外周血单核细胞(pbmc)。将15mlhistopaque(sigma-aldrich)预载在50ml的leucosep-管(greinerbio-one)上。用automacsrinsing缓冲液+1％bsa(miltenyibiotec)稀释血液，并加载到总共十个制备的管的膜上。将管以1000xg离心分离10分钟。收集pbmc并用automacsrinsing缓冲液+1％bsa洗涤3次。最后，根据制造商的说明书，使用pant细胞分离试剂盒(miltenyibiotec)，通过automacspro技术将pbmc重悬于automacs运行缓冲液(miltenyibiotec)中以分离t淋巴细胞。使用人7色免疫分型试剂盒(miltenyibiotec)通过macsquant流式细胞术分析分离的t细胞的纯度。靶细胞(即thp-1细胞系)在37下用1mlrpmi+glutamaxi+10％fcs(invitrogen)中的1μmcfse染色15分钟。将2.5e4靶细胞接种在96孔u底悬浮培养板(greinerbio-one)中，每孔50μl。将分离的原代人t淋巴细胞重悬于rpmi+glutamaxi+10％fcs中，并以指定的效应物-靶标比例以50μl/孔添加至靶细胞(通常e:t＝10:1)。在1mlrpmi+glutamaxi+10％fcs(invitrogen)或pbs中将bispecific抗体样结合蛋白以1:3的比例连续稀释，并将各自添加5μl至细胞，终浓度高达3000ng/ml。将测定在37℃，5％co2中温育20小时。为了检测死亡的靶细胞，将所有细胞用7-aad染色。因此，在每个孔中加入稀释于具有fbs的染色缓冲液(bdpharmingen)中的5μg/ml7-aad，并在4℃于黑暗中温育30分钟。分别使用macsquant(miltenyibiotec)或lsrii或verse(两者均为bd)流式细胞仪测量细胞。使用flowjo软件(treestar，inc.)进行进一步的数据分析。读出是cfse和7-aad双阳性细胞的百分比。通过xlfit(算法205)计算曲线。如表9所示，双特异性抗体样结合蛋白能够在体外接合原代t细胞并裂解thp-1靶细胞。在20小时共培养后，可检测死亡靶细胞的抗体浓度依赖性增加。对于这里所示的抗体样结合蛋白，计算范围在0.8至1.2pm的ec50值。表9：基于细胞毒性测定的流式细胞术中检测到的双特异性codvcd123×cd3的t细胞接合效应。呈现的是从曲线计算的平均ec50值构建体ec50(pm)g均值ec50(pm)标准误计数codv-fab-tl1-rf0.80.134codv-fab-tl1-节-rfx穴0.80.24codv-fab-tl1-节x穴-rf1.10.34codv-fab-ol1-节x穴-rfwogs1.20.212与codv-fab-tl1-rf相比，codv-fab-tl1-节x穴-rf或codv-fab-tl1-节-rfx穴中引入骨架突变不改变这些分子的功能参数，表明这些codv修饰不会导致t细胞接合活性的任何丧失。2.9cd123xcd3codv抗体样结合蛋白对存在(活性读出)和不存在(安全性读出)靶细胞情况下的t细胞活化的影响通过流式细胞术检测双特异性抗体样结合蛋白对作为活性或安全性读出的t细胞活化状态的影响，其基于检测在存在(条件见2.8.)或不存在靶细胞情况下原代人t细胞表面活化标记物cd25和cd69的表达。将分离的原代人t淋巴细胞重悬于rpmi+glutamaxi(gibco)+10％fcs(invitrogen)中，2.5e5细胞以每孔50μl接种在96孔u-底悬浮培养板(greinerbio-one)中。仅测试t细胞，并用50μlrpmi+glutamaxi+10％fcs填充孔，或者以每孔2.5e4细胞在50μlrpmi+glutamaxi中加入靶细胞(即thp-1细胞系)+10％fcs。将双特异性抗体样结合蛋白以1:3或1:10连续稀释于rpmi+glutamaxi+10％fcs或pbs中，并以高达300000ng/ml的最终浓度每种加入5μl至细胞。将测定在37℃，5％co2中温育20小时。温育后，将细胞旋转并在4℃在100μl含有fbs(bdpharmingen)的染色缓冲液中用如下标记的抗体染色15分钟：cd4-pe，cd8-apc-cy7，cd25-apc，cd69-pe-cy7如上所述染色fluorescenceminusone(fmo)对照活化的t细胞，但在一个管中将cd25替换为同种型同种型(同种型apc-ig1k)，并在第二管中将cd69替换为同种型(同种型pe-cy7-ig1k)。染色后将细胞洗涤两次，用fbs重悬于150μl染色缓冲液中，用lsrii(bd)流式细胞仪测定10000个细胞。使用flowjo软件(treestar,inc.)进行进一步的数据分析。读出是cd4poscd25pos，cd4poscd69pos，cd8poscd25pos和cd8poscd69post细胞的百分比。门限根据fmo对照设置。表10显示t细胞活化导致靶细胞的存在(活性读出)。靶细胞表达的ec50值与细胞毒性测定中观察到的ec50值非常相似。与codv-fab-tl1-rf相比，codv-fab-tl1-节-rfx穴或codv-fab-tl1-节x穴-rf中引入的骨架突变不改变该分子的功能参数，表明这些codv-fab修饰与目标方法兼容。表10：用thp-1靶细胞的t细胞活化(ec50)表10和表11显示了在高浓度(100nm，高于ec505log)的针对cd4+(表11)和cd8+(表12)t细胞的双特异性的靶细胞的不存在(安全性读出)和存在(活性读出)情况下的t细胞活化结果(基于cd69表达)。在没有靶细胞的情况下，只有少部分t细胞成为cd69阳性，分子之间或cd4+和cd8+t细胞之间没有主要差异。如表10所示，所有codv在靶细胞存在下都诱导cd4+和cd8+t细胞的活化。因此，在没有靶细胞的情况下，codv分子中引入的骨架突变不会引起关于t细胞活化的不期望的作用。表11：最大t细胞活化+/-thp-1靶细胞(cd4+)表12：最大t细胞活化+/-thp-1靶细胞(cd8+)序列表<110>赛诺菲(sanofi)<120>特异性结合至cd3和cd123的双特异性抗体样结合蛋白<130>fr2016/016<160>85<170>patentin版本3.5<210>1<211>207<212>prt<213>人(homosapiens)<400>1metglnserglythrhistrpargvalleuglyleucysleuleuser151015valglyvaltrpglyglnaspglyasngluglumetglyglyilethr202530glnthrprotyrlysvalserileserglythrthrvalileleuthr354045cysproglntyrproglysergluileleutrpglnhisasnasplys505560asnileglyglyaspgluaspasplysasnileglyseraspgluasp65707580hisleuserleulysgluphesergluleugluglnserglytyrtyr859095valcystyrproargglyserlysprogluaspalaasnphetyrleu100105110tyrleuargalaargvalcysgluasncysmetglumetaspvalmet115120125servalalathrilevalilevalaspilecysilethrglyglyleu130135140leuleuleuvaltyrtyrtrpserlysasnarglysalalysalalys145150155160provalthrargglyalaglyalaglyglyargglnargglyglnasn165170175lysgluargproproprovalproasnproasptyrgluproilearg180185190lysglyglnargaspleutyrserglyleuasnglnargargile195200205<210>2<211>198<212>prt<213>食蟹猴(macacafascicularis)<400>2metglnserglythrargtrpargvalleuglyleucysleuleuser151015ileglyvaltrpglyglnaspglyasngluglumetglyserilethr202530glnthrprotyrglnvalserileserglythrthrvalileleuthr354045cysserglnhisleuglyserglualaglntrpglnhisasnglylys505560asnlysgluaspserglyaspargleupheleuproglupheserglu65707580metgluglnserglytyrtyrvalcystyrproargglyserasnpro859095gluaspalaserhishisleutyrleulysalaargvalcysgluasn100105110cysmetglumetaspvalmetalavalalathrilevalilevalasp115120125ilecysilethrleuglyleuleuleuleuvaltyrtyrtrpserlys130135140asnarglysalalysalalysprovalthrargglyalaglyalagly145150155160glyargglnargglyglnasnlysgluargproproprovalproasn165170175proasptyrgluproilearglysglyglnglnaspleutyrsergly180185190leuasnglnargargile195<210>3<211>340<212>prt<213>人(homosapiens)<220><221>domain<222>(1)..(104)<223>人cd3ε的胞外结构域<220><221>misc_feature<222>(105)..(340)<223>带his标签的fc-融合物<400>3aspglyasngluglumetglyglyilethrglnthrprotyrlysval151015serileserglythrthrvalileleuthrcysproglntyrprogly202530sergluileleutrpglnhisasnasplysasnileglyglyaspglu354045aspasplysasnileglyseraspgluasphisleuserleulysglu505560phesergluleugluglnserglytyrtyrvalcystyrproarggly65707580serlysprogluaspalaasnphetyrleutyrleuargalaargval859095cysgluasncysmetglumetaspglyserasplysthrhisthrcys100105110proprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalpheleu115120125pheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrproglu130135140valthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallys145150155160pheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlys165170175proargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleu180185190thrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslys195200205valserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlys210215220alalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproser225230235240argaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallys245250255glyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglygln260265270progluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspgly275280285serphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpgln290295300glnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasn305310315320histyrthrglnlysserleuserleuserproglyhishishishis325330335hishishishis340<210>4<211>333<212>prt<213>食蟹猴(macacafascicularis)<220><221>domain<222>(1)..(95)<223>食蟹猴cd3ε蛋白的胞外结构域<220><221>misc_feature<222>(96)..(333)<223>fc融合物<400>4aspglyasngluglumetglyserilethrglnthrprotyrglnval151015serileserglythrthrvalileleuthrcysserglnhisleugly202530sergluvalglntrpglnhisasnglylysasnlysgluaspsergly354045aspargleupheleuproglupheserglumetgluglnserglytyr505560tyrvalcystyrproargglyserasnprogluaspalaserhishis65707580leutyrleulysalaargvalcysgluasncysmetglumetaspgly859095serasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleu100105110glyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleu115120125metileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser130135140hisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalglu145150155160valhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthr165170175tyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasn180185190glylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalapro195200205ileglulysthrileserlysalalysglyglnproarggluprogln210215220valtyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnval225230235240serleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealaval245250255glutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpro260265270provalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthr275280285valasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysserval290295300methisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleu305310315320serproglyseralatrpserhisproglnpheglulys325330<210>5<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的"hz20g6"抗cd3抗体的cdr1-h<400>5glyphethrphethrlysalatrp15<210>6<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的"hz20g6"抗cd3抗体的cdr2-h<400>6ilelysasplysserasnsertyralathr1510<210>7<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的"hz20g6"抗cd3抗体的cdr3-h<400>7argglyvaltyrtyralaleuserpropheasptyr1510<210>8<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的"hz20g6"抗cd3抗体的cdr3-l<400>8glyglnglythrglntyrprophethr15<210>9<211>121<212>prt<213>人工序列<220><223>人源化的"20g6"抗cd3抗体的vh1d<400>9glnvalglnleuval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列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>33lysthrhisthrser15<210>34<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>34asplysthrhisthrser15<210>35<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>35asplysthrhisthrserpro15<210>36<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>36serasplysthrhisthrserpro15<210>37<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>37serasplysthrhisthrserpropro15<210>38<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>38lysserasplysthrhisthrserproproser1510<210>39<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>39prolysserasplysthrhisthrserproproser1510<210>40<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>40prolysserasplysthrhisthrserproproserpro1510<210>41<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>41gluprolysserasplysthrhisthrserproproserpro1510<210>42<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>42gluprolysserasplysthrhisthrserproproserprogly151015<210>43<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>43glygluprolysserasplysthrhisthrserproproserprogly151015<210>44<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>44glygluprolysserasplysthrhisthrserproproserprogly151015gly<210>45<211>18<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>45glyglygluprolysserasplysthrhisthrserproproserpro151015glygly<210>46<211>19<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>46glyglygluprolysserasplysthrhisthrserproproserpro151015glyglygly<210>47<211>20<212>prt<213>人工序列<220><223>接头序列的氨基酸序列<400>47glyglyglygluprolysserasplysthrhisthrserproproser151015proglyglygly20<210>48<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的"hz7g3"抗体的cdr1-l<400>48glnserleuleuasnserglyasnglnlysasntyr1510<210>49<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的"hz7g3"抗体的cdr3-l<400>49glnasnasptyrsertyrprotyrthr15<210>50<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的人源化的"7g3"抗体的cdr1-h<400>50glytyrserphethrasptyrtyr15<210>51<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的人源化的"7g3"抗体的cdr3-h<400>51alaargserhisleuleuargalasertrpphealatyr1510<210>52<211>120<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的人源化的"7g3"抗体的vh变体<400>52gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu151015serleulysilesercyslysglyserglytyrserphethrasptyr202530tyrmetlystrpalaargglnmetproglylysglyleuglutrpmet354045glyaspileileproserserglyalathrphetyrasnglnlysphe505560lysglyglnvalthrileseralaasplysserileserthrthrtyr65707580leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys859095alaargserhisleuleuargalasertrpphealatyrtrpglygln100105110glythrmetvalthrvalserser115120<210>53<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的人源化的"7g3"抗体之一的cdr2-h<400>53ileileproserserglyalathr15<210>54<211>113<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的人源化的"7g3"抗体的vl变体<400>54aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly151015gluargalathrileasncysgluserserglnserleuleuasnser202530glyasnglnlysasntyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln354045proprolysproleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval505560proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr65707580ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglnasn859095asptyrsertyrprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluile100105110lys<210>55<211>352<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的codv-fab-ol1"hz20g6xhz7g3"和codv-fab-ol1a"hz20g6xhz7g3"的多肽i<400>55aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly151015gluargalathrileasncysgluserserglnserleuleuasnser202530glyasnglnlysasntyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln354045proprolysproleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval505560proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr65707580ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglnasn859095asptyrsertyrprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluile100105110lysglyglyserglyserserglyserglyglyaspilevalmetthr115120125glnthrproleuserleuservalthrproglyglnproalaserile130135140sercyslysserserglnserleuvalhisasnasnalaasnthrtyr145150155160leusertrptyrleuglnlysproglyglnserproglnserleuile165170175tyrlysvalserasnargpheserglyvalproaspargphesergly180185190serglyserglythraspphethrleulysileserargvalgluala195200205gluaspvalglyvaltyrtyrcysglyglnglythrglntyrprophe210215220thrpheglyserglythrlysvalgluilelysglyglyserglyser225230235240serglyserglyglyargthrvalalaalaproservalpheilephe245250255proproseraspgluglnleulysserglythralaservalvalcys260265270leuleuasnasnphetyrproargglualalysvalglntrplysval275280285aspasnalaleuglnserglyasnserglngluservalthrglugln290295300aspserlysaspserthrtyrserleuserserthrleuthrleuser305310315320lysalaasptyrglulyshislysvaltyralacysgluvalthrhis325330335glnglyleuserserprovalthrlysserpheasnargglyglucys340345350<210>56<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>接头<400>56glyglyserglyserserglyserglygly1510<210>57<211>578<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的codv-fab-tl1-rf"hz20g6xhz7g3"的根据式[iv]的多肽的氨基酸序列<400>57aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly151015gluargalathrileasncysgluserserglnserleuleuasnser202530glyasnglnlysasntyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln354045proprolysproleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval505560proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr65707580ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglnasn859095asptyrsertyrprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluile100105110lysglyglyserglyserserglyserglyglyaspilevalmetthr115120125glnthrproleuserleuservalthrproglyglnproalaserile130135140sercyslysserserglnserleuvalhisasnasnalaasnthrtyr1451501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yscyslysvalserasnlysala100105110leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro115120125arggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthr130135140lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser145150155160aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr165170175lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr180185190serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe195200205sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys210215220serleuserleuserprogly225230<210>61<211>570<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的codv-fab-ol1"hz20g6xhz7g3"的根据式[iii]的多肽的氨基酸序列<400>61glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphethrlysala202530trpmethistrpvalargglnalaproglylysglnleuglutrpval354045alaglnilelysasplysserasnsertyralathrtyrtyralaasp505560servallysglyargphethrileserargaspaspserlysasnthr65707580leutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyr859095tyrcysargglyvaltyrtyralaleuserpropheasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalsersergluvalglnleuvalglnser115120125glyalagluvallyslysproglygluserleulysilesercyslys130135140glyserglytyrserphethrasptyrtyrmetlystrpalaarggln145150155160metproglylysglyleuglutrpmetglyaspileileproserser165170175glyalathrphetyrasnglnlysphelysglyglnvalthrileser180185190alaasplysserileserthrthrtyrleuglntrpserserleulys195200205alaseraspthralamettyrtyrcysalaargserhisleuleuarg210215220alasertrpphealatyrtrpglyglnglythrmetvalthrvalser225230235240seralaserthrlysglyproservalpheproleualaproserser245250255lysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasp260265270tyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthr275280285serglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyr290295300serleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrgln305310315320thrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasp325330335lyslysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcyspropro340345350cysproalaproglualaalaglyglyproservalpheleuphepro355360365prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr370375380cysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasn385390395400trptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarg405410415glugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrval420425430leuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalser435440445asnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalys450455460glyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproprocysargasp465470475480gluleuthrlysasnglnvalserleutrpcysleuvallysglyphe485490495tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu500505510asnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphe515520525pheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglngly530535540asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnargphe545550555560thrglnlysserleuserleuserprogly565570<210>62<211>231<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的codv-fab-ol1"hz7g3xhz20g6"抗体样结合蛋白的fc区<400>62gluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproala151015proglualaalaglyglyproservalpheleupheproprolyspro202530lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval354045valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval505560aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln65707580tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln859095asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala100105110leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro115120125arggluproglnvaltyrthrleuproprocysargaspgluleuthr130135140lysasnglnvalserleutrpcysleuvallysglyphetyrproser145150155160aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr165170175lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr180185190serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe195200205sercysservalmethisglualaleuhisasnargphethrglnlys210215220serleuserleuserprogly225230<210>63<211>228<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的codv-fab-ol1"hz7g3xhz20g6"抗体样结合蛋白的fc段<400>63glyserasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluala151015alaglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr202530leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval354045serhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyval505560gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnser65707580thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu859095asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproala100105110proileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro115120125glnvalcysthrleuproproserargaspgluleuthrlysasngln130135140valserleusercysalavallysglyphetyrproseraspileala145150155160valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr165170175proprovalleuaspseraspglyserphepheleuvalserlysleu180185190thrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysser195200205valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser210215220leuserprogly225<210>64<211>228<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的codv-fab-ol1a"hz7g3xhz20g6"的fc段<400>64glyserasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluala151015alaglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr202530leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval354045serhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyval505560gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnser65707580thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu859095asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproala100105110proileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro115120125glnvalcysthrleuproproserargaspgluleuthrlysasngln130135140valserleusercysalavallysglyphetyrproseraspileala145150155160valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr165170175proprovalleuaspseraspglyserphepheleuvalserlysleu180185190thrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysser195200205valmethisglualaleuhisasnargphethrglnlysserleuser210215220leuserprogly225<210>65<211>570<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的codv-fab-ol1a和无gs的codv-fab-ol1-节x穴-rf"hz20g6xhz7g3"的根据式[iii]的多肽的氨基酸序列<400>65glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphethrlysala202530trpmethistrpvalargglnalaproglylysglnleuglutrpval354045alaglnilelysasplysserasnsertyralathrtyrtyralaasp505560servallysglyargphethrileserargaspaspserlysasnthr65707580leutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyr859095tyrcysargglyvaltyrtyralaleuserpropheasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalsersergluvalglnleuvalglnser115120125glyalagluvallyslysproglygluserleulysilesercyslys130135140glyserglytyrserphethrasptyrtyrmetlystrpalaarggln145150155160metproglylysglyleuglutrpmetglyaspileileproserser165170175glyalathrphetyrasnglnlysphelysglyglnvalthrileser180185190alaasplysserileserthrthrtyrleuglntrpserserleulys195200205alaseraspthralamettyrtyrcysalaargserhisleuleuarg210215220alasertrpphealatyrtrpglyglnglythrmetvalthrvalser225230235240seralaserthrlysglyproservalpheproleualaproserser245250255lysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasp260265270tyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthr275280285serglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyr290295300serleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrgln305310315320thrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasp325330335lyslysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcyspropro340345350cysproalaproglualaalaglyglyproservalpheleuphepro355360365prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr370375380cysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasn385390395400trptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarg405410415glugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrval420425430leuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalser435440445asnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalys450455460glyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproprocysargasp465470475480gluleuthrlysasnglnvalserleutrpcysleuvallysglyphe485490495tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu500505510asnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphe515520525pheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglngly530535540asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyr545550555560thrglnlysserleuserleuserprogly565570<210>66<211>231<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的codv-fab-ol1a和codv-fab-ol1-节x穴节x穴-rfwogs"hz20g6xhz7g3"的式[iii]的多肽的fc域<400>66gluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproala151015proglualaalaglyglyproservalpheleupheproprolyspro202530lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval354045valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval505560aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln65707580tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln859095asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala100105110leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro115120125arggluproglnvaltyrthrleuproprocysargaspgluleuthr130135140lysasnglnvalserleutrpcysleuvallysglyphetyrproser145150155160aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr165170175lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr180185190serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe195200205sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys210215220serleuserleuserprogly225230<210>67<211>570<212>prt<213>人工序列<220><223>codv-fab-tl1-节-rfx穴,codv-fab-tl1-节x穴-rf,codv-fab-tl1,codv-fab-tl1-节x穴,无gs(wogs)的codv-fab-ol1-节x穴-rf的根据式[iii]的多肽的广义的氨基酸序列<220><221>misc_feature<222>(473)..(473)<223>x1是y或c<220><221>misc_feature<222>(478)..(478)<223>x2是s或c<220><221>misc_feature<222>(490)..(490)<223>x3是t,s或w<220><221>misc_feature<222>(492)..(492)<223>x4是a或l<220><221>misc_feature<222>(531)..(531)<223>x5是v或y<220><221>misc_feature<222>(559)..(559)<223>x6是h或r<220><221>misc_feature<222>(560)..(560)<223>x7是y或f<400>67glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphethrlysala202530trpmethistrpvalargglnalaproglylysglnleuglutrpval354045alaglnilelysasplysserasnsertyralathrtyrtyralaasp505560servallysglyargphethrileserargaspaspserlysasnthr65707580leutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyr859095tyrcysargglyvaltyrtyralaleuserpropheasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalsersergluvalglnleuvalglnser115120125glyalagluvallyslysproglygluserleulysilesercyslys130135140glyserglytyrserphethrasptyrtyrmetlystrpalaarggln145150155160metproglylysglyleuglutrpmetglyaspileileproserser165170175glyalathrphetyrasnglnlysphelysglyglnvalthrileser180185190alaasplysserileserthrthrtyrleuglntrpserserleulys195200205alaseraspthralamettyrtyrcysalaargserhisleuleuarg210215220alasertrpphealatyrtrpglyglnglythrmetvalthrvalser225230235240seralaserthrlysglyproservalpheproleualaproserser245250255lysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasp260265270tyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthr275280285serglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyr290295300serleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrgln305310315320thrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasp325330335lyslysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcyspropro340345350cysproalaproglualaalaglyglyproservalpheleuphepro355360365prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr370375380cysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasn385390395400trptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarg405410415glugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrval420425430leuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalser435440445asnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalys450455460glyglnproarggluproglnvalxaathrleuproproxaaargasp465470475480gluleuthrlysasnglnvalserleuxaacysxaavallysglyphe485490495tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu500505510asnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphe515520525pheleuxaaserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglngly530535540asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnxaaxaa545550555560thrglnlysserleuserleuserprogly565570<210>68<211>231<212>prt<213>人工序列<220><223>codv-fab-tl1-节-rfx穴,codv-fab-tl1-节x穴-rf,codv-fab-tl1,codv-fab-tl1-节x穴,无gs(wogs)的codv-fab-ol1-节x穴-rf的根据式[iii]的多肽的fc域的广义的氨基酸序列<220><221>misc_feature<222>(134)..(134)<223>x1是y或c<220><221>misc_feature<222>(139)..(139)<223>x2是s或c<220><221>misc_feature<222>(151)..(151)<223>x3是t,s或w<220><221>misc_feature<222>(153)..(153)<223>x4是a或l<220><221>misc_feature<222>(192)..(192)<223>x5是v或y<220><221>misc_feature<222>(220)..(220)<223>x6是h或r<220><221>misc_feature<222>(221)..(221)<223>x7是y或f<400>68gluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproala151015proglualaalaglyglyproservalpheleupheproprolyspro202530lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval354045valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval505560aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln65707580tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln859095asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala100105110leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro115120125arggluproglnvalxaathrleuproproxaaargaspgluleuthr130135140lysasnglnvalserleuxaacysxaavallysglyphetyrproser145150155160aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr165170175lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleuxaa180185190serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe195200205sercysservalmethisglualaleuhisasnxaaxaathrglnlys210215220serleuserleuserprogly225230<210>69<211>226<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的无gs(wogs)的codv-fab-ol1-节x穴-rf"hz20g6xhz7g3"的fc段(fc3)<400>69asplysthrhisthrcysproprocysproalaproglualaalagly151015glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet202530ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis354045gluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluval505560hisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyr65707580argvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly859095lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproile100105110glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval115120125cysthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalser130135140leusercysalavallysglyphetyrproseraspilealavalglu145150155160trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro165170175valleuaspseraspglyserphepheleuvalserlysleuthrval180185190asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet195200205hisglualaleuhisasnargphethrglnlysserleuserleuser210215220progly225<210>70<211>226<212>prt<213>人工序列<220><223>codv-fab-tl1-节-rfx穴,codv-fab-tl1-节x穴-rf,codv-fab-tl1,codv-fab-tl1-节x穴的式[iv]的多肽的fc域(fc2)的广义的氨基酸序列<220><221>misc_feature<222>(129)..(129)<223>x1是y或c<220><221>misc_feature<222>(134)..(134)<223>x2是s或c<220><221>misc_feature<222>(146)..(146)<223>x3是t,s或w,<220><221>misc_feature<222>(148)..(148)<223>x4是a或l,<220><221>misc_feature<222>(187)..(187)<223>x5是v或y<220><221>misc_feature<222>(215)..(215)<223>x6是h或r<220><221>misc_feature<222>(216)..(216)<223>x7是y或f,或<400>70asplysthrhisthrcysproprocysproalaproglualaalagly151015glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet202530ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis354045gluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluval505560hisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyr65707580argvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly859095lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproile100105110glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval115120125xaathrleuproproxaaargaspgluleuthrlysasnglnvalser130135140leuxaacysxaavallysglyphetyrproseraspilealavalglu145150155160trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro165170175valleuaspseraspglyserphepheleuxaaserlysleuthrval180185190asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet195200205hisglualaleuhisasnxaaxaathrglnlysserleuserleuser210215220progly225<210>71<211>578<212>prt<213>人工序列<220><223>所谓的抗体样结合蛋白codv-fab-tl1-节-rfx穴,codv-fab-tl1-节x穴-rf,codv-fab-tl1,codv-fab-tl1-节x穴的式[iv]的多肽的广义的氨基酸序列<220><221>misc_feature<222>(481)..(481)<223>x1是y或c<220><221>misc_feature<222>(486)..(486)<223>x2是s或c<220><221>misc_feature<222>(498)..(498)<223>x3是t,s或w<220><221>misc_feature<222>(500)..(500)<223>x4是a或l<220><221>misc_feature<222>(539)..(539)<223>x5是v或y<220><221>misc_feature<222>(567)..(567)<223>x6是h或r<220><221>misc_feature<222>(568)..(568)<223>x7是y或f<400>71aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly151015gluargalathrile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