本发明属于检测生物技术领域，具体涉及一种六类真菌毒素产生菌的同步检测试剂盒。
背景技术：
真真菌感染常见于谷物类粮食作物的生长期及贮存期。其中曲霉属、青霉属及镰刀属真菌的感染不仅使粮食大量减产、品质下降，而且其代谢过程中还会产生系列毒素严重危害健康。黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、展青霉素、单端孢酶烯族毒素、玉米赤霉烯酮及伏马菌素是当前世界上危害最为严重的6类真菌毒素。食用或长期接触受上述毒素污染的初级农产品、饲料及加工食品，会导致机体损伤、器官病变甚至癌变。
目前，产毒真菌的常规鉴定方法多基于形态学及育性分析(如gb4789.16-2016食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定；sn/t1035-2011进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法)，费时、冗繁且专业要求强。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种六类真菌毒素产生菌的同步检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种六类真菌毒素产生菌的同步检测试剂盒，上述六种毒素为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、展青霉素、单端孢霉烯族毒素、伏马菌素和玉米赤霉烯酮，基于多重pcr检测方法，包括能在同一反应管中进行pcr反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和内标引物对，其中，
第一引物对用以扩增黄曲霉毒素合成正向调节基因aflr，包括alfr-775-f和alfr-775-r，分别包括如seqidno01和seqidno02所示的序列；
第二引物对用以扩增赭曲霉毒素合成必需的核糖体肽合酶基因ps，包括ps-343-f和ps-343-r，分别包括如seqidno03和seqidno04所示的序列；
第三引物对用以扩增展青霉素合成必需的异环氧菌素脱氢酶基因idh，包括idh-649-f和idh-649-r，分别包括如seqidno05和seqidno06所示的序列；
第四引物对用以扩增单端孢霉烯族毒素合成必需的正向调控转录因子tri6，包括tri6-543-f和tri6-543-r，分别包括如seqidno07和seqidno08所示的序列；
第五引物对用以扩增伏马菌素合成必需的聚酮合酶基因fum1，包括fum1-273-f和fum1-273-r，分别包括如seqidno09和seqidno10所示的序列；
第六引物对用以扩增玉米赤霉烯酮合成必需的聚酮合酶基因pks4，包括pks4-942-f和pks4-942-r，分别包括如seqidno11和seqidno12所示的序列。
内标引物对用以扩增真菌通用分子识别序列，该真菌通用分子识别序列为内部转录间区序列its，包括its-600-f和its-600-r，分别包括如seqidno13和seqidno14所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一引物中的alfr-775-f和alfr-775-r分别如seqidno01和seqidno02所示；所述第二引物中的ps-343-f和ps-343-r分别如seqidno03和seqidno04所示；所述第三引物对中的idh-649-f和idh-649-r分别如seqidno05和seqidno06所示；所述第四引物对中的tri6-543-f和tri6-543-r分别如seqidno07和seqidno08所示；所述第五引物中的fum1-273-f和fum1-273-r分别如seqidno09和seqidno10所示；所述第六引物中的pks4-942-f和pks4-942-r分别如seqidno11和seqidno12所示；所述内标引物对中的its-600-f和its-600-r分别如seqidno13和seqidno14所示。
进一步优选的，其dna模板包括阳性对照、阴性对照和空白对照，其中阳性对照为黄曲霉cgmcc3.4408、赭曲霉cgmcc3.4411、棒曲霉cgmcc3.6890、黄色镰刀菌atcc204257和串珠镰刀菌atcc204499的等量dna混合物，阴性对照为蛹虫草xmzj-f-001的dna，空白对照为水。
进一步优选的，其扩增体系的总体积为20～30μl，包括dna模板45～55ng、第一引物对各0.18～0.22μm、第二引物对各0.18～0.22μm、第三引物对各0.3～0.4μm、第四引物对各0.25～0.35μm、第五引物对各0.25～0.35μm、第六引物对各0.55～0.65μm、内标引物对各0.12～0.14μm、dntps0.8～1.2mm、mgcl22.2～2.6mm、不含mg2+的1×聚合酶缓冲液和1.2～1.3utaq酶。
更进一步优选的，其扩增体系的总体积为25μl，包括dna模板50ng、第一引物对各0.2μm、第二引物对各0.2μm、第三引物对各0.4μm、第四引物对各0.3μm、第五引物对各0.3μm、第六引物对各0.6μm、内标引物对各0.13μm、dntps1.0mm、mgcl22.5mm、不含mg2+的1×聚合酶缓冲液和1.25utaq酶。
进一步优选的，其热循环条件如下：94℃预变性4.5～5.5min；94℃变性28～32s，60℃退火28～32s，72℃延伸58～62s，循环30～40次；最后72℃再延伸6.5～7.5min。
更进一步优选的，其热循环条件如下：94℃预变性5min；；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次；最后72℃再延伸7min。
本发明的有益效果是：
1、相对于针对毒素本身的检测方法，本发明靶向于毒素产生菌鉴定的方法可在毒素未形成或微量累积时，即可判定样品中产毒真菌存在与否，为谷物及其制品受毒素污染的风险提供早期预警，便于相关部门采取前置化干预，采取有效措施防控毒素危害的产生，切实减轻其危害。
2、与基于形态学鉴别的传统方法及单重pcr扩增检测法相比，本发明无需冗繁的培养基配置、载玻片小培养、形态观察等步骤，一步检测排查3类毒素，可节约3-4d的时间及大量人力成本；同时针对产毒必需基因的扩增技术可有效克服因亲缘种属间形态高度类似而易导致误判的缺陷。
3、本发明的检测体系直接靶向毒素合成必需基因，特异性强；同步扩增内参基因，同时设置阳性、阴性及空白对照，有效避免假阴性及假阳性；pcr指数倍增保障了方法灵敏度。
附图说明
图1为本发明实施例1的同步检测产六种毒素真菌的多重pcr电泳结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
1、真菌基因组的提取
以经hplc证实产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、展青霉素、单端孢霉烯族毒素、伏马菌素和玉米赤霉烯酮的阳性菌(黄曲霉cgmcc3.4408、赭曲霉cgmcc3.4411、棒曲霉cgmcc3.6890、黄色镰刀菌atcc204257和串珠镰刀菌atcc204499)作为阳性对照；不产上述六种毒素的菌株(蛹虫草xmzj-f-001)作为阴性对照。
将上述各菌株斜面工作菌(孢子或菌丝)接种于表面贴有玻璃纸的pda平板上，25℃培养3-4d，待菌丝布满培养皿且未产孢时收获菌丝，参照如下方法提取dna：称取0.2g菌丝置于预冷研钵中，液氮研磨至粉末。而后加入4mldna提取液[0.2mtris·hcl(ph7.5)，0.5mnacl，10mmedta，1％sds(w/v)]，继续研磨后转移至离心管，冰浴3～5min。加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液，剧烈震荡3min，4℃下1840g离心10min。吸取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)混合液，颠倒混匀后于4℃下1840g离心10min。吸取上清液，加入1/10体积3mnaac缓冲液(ph5.3)和2.5倍体积乙醇，混匀后在20℃下沉淀1h。继之，4℃下9300g离心10min，弃上清后再用0.5ml75％乙醇洗涤沉淀，再4℃下9300g离心5min。自然干燥3～5min后，加入0.6ml无菌水溶解，再加入2μlrnaase，在37℃下保温15min。重复一轮酚/氯仿抽提，最后用0.1ml无菌水溶解dna。
2、多重pcr体系
以上述dna为模板、如下7对引物(第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对和内标引物对)为特异性引物进行检测。
第一引物对，即黄曲霉毒素合成正向调节基因aflr引物对序列为：
alfr-775-f：5′-gcaaagcaccctgtcttccctaac-3′(seqidno01)
alfr-775-r：5′-gagatttgcttcgaggccactaaa-3′(seqidno02)
第二引物对，即赭曲霉毒素合成必需的核糖体肽合酶基因ps引物对序列为：
ps-343-f：5′-cggagactggtcttactttga-3′(seqidno03)
ps-343-r：5′-caacagggctgtttggaatct-3′(seqidno04)
第三引物对，即青霉素合成必需的异环氧菌素脱氢酶基因idh引物对序列为：
idh-649-f：5′-ggyatgggwgargcratggt-3′(seqidno05)
idh-649-r：5′-tcgctgytcctcyaccca-3′(seqidno06)
第四引物对，即单端孢霉烯族毒素合成必需的正向调控转录因子tri6引物对序列为：
tri6-543-f：5′-gactatgaatcaccaacwttcg-3′(seqidno07)
tri6-543-r：5′-cttrtgtatccgcctatagtgatc-3′(seqidno08)
第五引物对，即伏马菌素合成必需的聚酮合酶基因fum1引物对序列为：
fum1-273-f：5′-gaaatggatctcttcgaggc-3′(seqidno09)
fum1-273-r：5′-ttctgcatgtatcgaaaggc-3′(seqidno10)
第六引物对，即玉米赤霉烯酮合成必需的聚酮合酶基因pks4引物对序列为：
pks4-942-f：5′-agacgcatactccgaaacaac-3′(seqidno11)
pks4-942-r：5′-ccaatagtacggtggatagcg-3′(seqidno12)
内标引物对，即真菌通用分子识别序列-内部转录间区序列its引物对序列为：
its-600-f：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′(seqidno13)
its-600-r：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′(seqidno14)
扩增体系总体积为25μl，具体包括：dna模板50ng、第一引物对各0.2μm、第二引物对各0.2μm、第三引物对各0.4μm、第四引物对各0.3μm、第五引物对各0.3μm、第六引物对各0.6μm、内标引物对各0.13μm、dntps1.0mm、mgcl22.5mm、不含mg2+的1×聚合酶缓冲液和1.25utaq酶。
热循环条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次；最后72℃再延伸7min。
pcr结束后，取5μl样液、上样缓冲液和sybrgreeni染液混匀后，以2％琼脂糖凝胶进行电泳(90v，1.5h)，于凝胶成像仪拍照。结果如图1所示，其中其中m表示100bpladdermarker，各条带大小依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp及100bp；1～7-黄曲霉、赭曲霉、棒曲霉、黄色镰刀菌、黄色镰刀菌、串珠镰刀菌及其混合dna为模板分别以引物对aflr-775-f&r、ps-343-f&r、idh-649-f&r、tri6-543-f&r、pks4-942-f&r、fum1-273-f&r和its-600-f&r各自单重扩增；8-五种菌dna混合物为模板、7对引物同步多重扩增；9～10-非产毒株蛹虫草dna和无菌水为模板、7对引物同步多重扩增。
可见，本发明所采用的6类毒素代表性产毒株所提取dna以特异性引物扩增，不论在单重或是多重扩增体系中均能产生预期大小目的片段(毒素基因和its基因)。而以非产毒株黄曲霉dna为模板时则不显现任何毒素基因的扩增，仅可获得its片段；以无菌水替代上述模板时则未获得任何扩增产物，表明本发明所建立的多重pcr扩增体系可用于产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、展青霉素、单端孢霉烯族毒素、伏马菌素和玉米赤霉烯酮真菌的同步检测。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110>厦门市产品质量监督检验院（国家半导体发光器件应用产品质量监督检验中心、国家场（厂）内机动车辆质量监督检验中心）
<120>一种六类真菌毒素产生菌的同步检测试剂盒
<160>14
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>24
<212>dna
<213>homosapiens
<400>1
gcaaagcaccctgtcttccctaac24
<210>2
<211>24
<212>dna
<213>homosapiens
<400>2
gagatttgcttcgaggccactaaa24
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>homosapiens
<400>3
cggagactggtcttactttga21
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>homosapiens
<400>4
caacagggctgtttggaatct21
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>homosapiens
<400>5
ggyatgggwgargcratggt20
<210>6
<211>18
<212>dna
<213>homosapiens
<400>6
tcgctgytcctcyaccca18
<210>7
<211>22
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<212>dna
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<400>8
cttrtgtatccgcctatagtgatc24
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<212>dna
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<212>dna
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agacgcatactccgaaacaac21
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tcctccgcttattgatatgc20