本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种提高重组dna片段转化大肠杆菌效率的方法。
背景技术：
目前，业内常用的现有技术是这样的：dna重组载体构建是现代生物学研究常规手段之一。在dna重组载体构建中，目的dna片段与载体连接后的dna连接产物需要转化进入大肠杆菌并筛选得到含有重组dna的单克隆。cacl2法是dna转化进入大肠杆菌常用方法之一，但dna连接产物转化大肠杆菌的效率往往较低。dna连接产物中，除了核酸，还含有dna连接酶和其他非重组载体成分(包括了tris、mgcl2、atp、dtt等)，当dna连接产物与感受态大肠杆菌混合时，dna连接酶和其他离子成分，如tris，mg2+等，可能是影响大肠杆菌感受态细胞活性的重要因素。如果在将dna连接产物转化大肠杆菌之前，对dna连接产物进行适当的处理，如乙醇沉淀dna，可去除或者减少dna连接酶和其他非重组载体成分，则可能有利于重组dna转化进入大肠杆菌，进而提高dna连接产物转化大肠杆菌的效率。
传统的dna乙醇沉淀法常用于质粒提取等实验，但其方法中的一些步骤，如70％洗涤沉淀，te缓冲液(ph8.0)溶解沉淀等并不太适合对dna连接产物进行沉淀处理。通常对于微量dna样品，传统的乙醇dna沉淀法容易造成dna样品的损失。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有的dna连接产物转化大肠杆菌的效率低，且传统的dna乙醇沉淀法不能有效的纯化dna连接产物。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明通过改进dna乙醇沉淀法，提供了一种提高dna重组片段转化大肠杆菌效率的方法。
本发明是这样实现的，一种提高重组dna片段转化大肠杆菌效率的方法，所述提高重组dna片段转化大肠杆菌效率的方法是将pcr扩增得到的egfp片段与puc18质粒分别进行双酶切，用t4dna连接酶对酶切后的egfp片段和puc18质粒进行连接，得到dna连接产物；10μl连接产物中加入2μl10m醋酸铵；然后加入24μl无水乙醇，室温静置25min，10000g离心25min；弃上清，加入10μl0.1mcacl2，溶解管底的沉淀，通过对dna的沉淀处理，可以去除残留的dna连接酶和其他非重组载体成分，减少它们对重组dna转化大肠杆菌的干扰，从而有利于提高dna连接产物转化大肠杆菌的效率。
进一步，所述egfp片段摩尔数：puc18质粒摩尔数≈8:1。以保证尽可能多的puc18质粒可与egfp片段连接成为重组载体。
进一步，所述连接之前需要：用pcr方法，扩增出pegfp-c3载体上的egfp片段；用hindⅲ和ecorⅰ两种内切酶，对egfp片段和puc18质粒分别进行双酶切，得到带有相同粘性末端的egfp片段和puc18质粒。
进一步，所述连接反应得到的连接产物需要：用醋酸铵与乙醇沉淀dna，然后用5-10μl0.1mcacl2溶解的dna连接产物，并与10-100μl大肠杆菌感受态细胞混合；冰上放置30min，42℃水浴热激45-90sec，冰上放置2min；取0.4ml液体培养基加入上述混合物中，37℃，250rpm振荡培养1hr；将菌均匀涂布在含有0.125mg/mliptg、0.1mg/mlx-gal、0.1mg/mlampicillin的lb固体培养基上；37℃培养12-16hr。
本发明所述改进的dna乙醇沉淀较传统方法更为简便，改进的方法可提高dna连接产物的转化效率，经该方法处理的dna连接产物，转化大肠杆菌得到的单克隆数目约是未处理组的10倍；本发明也减少了转化时感受态大肠杆菌的用量。对于转化10μl连接产物，商品化的大肠杆菌感受态建议使用体积为50μl(全式金公司，货号：cd201)或者100μl(索莱宝公司，货号：c1100)，即10倍dna连接产物的用量，而本发明所述方法处理后的dna连接产物，只需使用10μl感受态大肠杆菌，便可获得大量重组dna单克隆。对比公司所售的感受态大肠杆菌用量，本发明将转化过程中，大肠杆菌感受态的用量降低了5-10倍。
附图说明
图1是本发明实施例提供的提高重组dna片段转化大肠杆菌效率的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的dna沉淀法(本发明所述方法)处理连接产物后，转化大肠杆菌的示意图。
图3是本发明实施例提供的dna沉淀法(本发明所述方法)处理后的连接产物，转化大肠杆菌所得到的单克隆数量显著多于未处理组的示意图。
图4是本发明实施例提供的用70％乙醇洗涤沉淀的dna连接产物后，转化大肠杆菌的示意图。
图5是本发明实施例提供的70％乙醇洗涤沉淀的dna连接产物，转化大肠杆菌所得到的单克隆数量显著少于本发明所述方法的示意图。
图6是本发明实施例提供的用te(ph8.0)缓冲液溶解dna连接产物后，转化大肠杆菌的示意图。
图7是本发明实施例提供的用te(ph8.0)缓冲液溶解的dna连接产物，转化大肠杆菌所得到的单克隆数量显著少于本发明所述方法的示意图。
图8是本发明实施例提供的用3m醋酸钠(ph5.2)沉淀dna连接产物后，转化大肠杆菌的示意图。
图9是本发明实施例提供的用3m醋酸钠(ph5.2)沉淀dna连接产物，转化大肠杆菌所得到的单克隆数量显著少于处理组(10m醋酸铵沉淀dna连接产物，即本发明所述方法)的示意图。
图10是本发明实施例提供的用dna吸附柱法纯化dna连接产物后，转化大肠杆菌的示意图。
图11是本发明实施例提供的用dna吸附柱法纯化dna连接产物，转化大肠杆菌所得到的单克隆数量显著少于本发明所述方法的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的提高重组dna片段转化大肠杆菌效率的方法包括以下步骤：
s101：用pcr方法，扩增出pegfp-c3载体上的egfp片段；
s102：用hindⅲ和ecorⅰ两种内切酶，分别双酶切puc18质粒和egfp片段，得到带有相同粘性末端的puc18质粒和egfp片段；
s103：将双酶切所得到的egfp片段与双酶切获得的puc18质粒混合，用t4dna连接酶进行连接(egfp片段摩尔数：puc18质粒摩尔数≈8:1)，得到连接产物；dna连接产物加入1/5体积dna连接产物的10m醋酸铵；然后加入混合物2倍体积的无水乙醇，室温静置25min-1hr，10000g离心25min-1hr；弃上清，加入10μl0.1mcacl2，溶解管底的沉淀。
s104：10μl经醋酸铵等试剂处理的dna连接产物与10μl大肠杆菌感受态细胞(cacl2法制备)混合；冰上放置30min，42℃水浴热激45sec，冰上放置2min；取0.4ml液体培养基加入上述混合物中，37℃，250rpm振荡培养1hr。将菌涂布在含有0.125mg/mliptg、0.1mg/mlx-gal、0.1mg/mlampicillin的lb固体培养基上。37℃倒置平板培养12-16hr。
下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。
1.实验方法
1.1未处理组实验方法(传统方法)
(1)获得dna插入片段。
用pcr方法，扩增出pegfp-c3载体上的egfp片段，使用的引物序列如下：
seqidno：1上游引物：5’-cagaagcttgcatggtgagcaagggcg-3’(hindⅲ)
seqidno：2下游引物：5’-ggaattctcacttgtacagctcgtccatgc-3’(ecorⅰ)
seqidno：3扩增得到的dna片段序列如下：
5’-cagaagcttgcatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtgagaattcc-3’
(2)puc18质粒和扩增得到的egfp片段分别进行双酶切。
用hindⅲ(全式金公司，货号：jh101)和ecorⅰ(全式金公司，货号：je201)两种内切酶，双酶切puc18质粒(索莱宝公司，货号：p3518)，得到带有粘性末端的puc18质粒。
表1双酶切puc18质粒反应体系
37℃酶切30min
表2双酶切pcr扩增得到的egfp片段反应体系
37℃酶切30min
(3)连接。
已双酶切的puc18质粒和egfp片段用1％琼脂糖凝胶进行电泳，并切胶回收，将回收的带有相同黏性末端的egfp片段与puc18质粒，用t4dna连接酶(全式金公司，货号：fl101)进行连接(egfp片段摩尔数：puc18质粒摩尔数≈8:1，酶切后的puc18质粒质量约为24ng)，得到连接产物。
表3dna连接反应体系
25℃连接1h
(4)转化和涂板。
10μl连接产物与10μl或者100μl大肠杆菌感受态细胞(cacl2法制备，大肠杆菌细胞购自全式金公司，货号：cd201)混合；冰上放置30min。42℃水浴热激45sec，冰上放置2min；取0.4ml液体培养基加入上述混合物中，37℃，250rpm振荡培养1hr。涂布在含有0.125mg/mliptg、0.1mg/mlx-gal、0.1mg/mlampicillin的lb固体培养基上，37℃培养12hr。
1.2处理组实验方法(本发明所述方法)
同样进行“1.1(1)、(2)、(3)”的操作。然后，由“1.1(3)”步骤得到的10μl连接产物做如下处理：
a.10μl连接产物加入2μl10m醋酸铵。
b.加入24μl无水乙醇到上述混合液，室温静置25min，10000g离心25min。
c.弃上清，加入10μl0.1mcacl2，溶解管底的沉淀。
上述方法得到的10μl处理之后的连接产物溶液用于转化和涂板(与“1.1(4)”操作相同)。
1.370％乙醇洗涤组实验方法
在“1.2处理组实验方法”所述实验步骤“b.加入24μl无水乙醇到上述混合液，室温静置25min，10000g离心25min”之后，用70％乙醇洗涤dna沉淀一次，10000g离心25min，然后弃上清，加入10μl0.1mcacl2，溶解管底的沉淀。
1.4te(ph8.0)缓冲液溶解dna连接产物组实验方法
基本同“1.2处理组实验方法”，但将“c.弃上清，加入10μl0.1mcacl2，溶解管底的沉淀。”用“c.加入10μlte缓冲液(ph8.0)，溶解管底的沉淀。”步骤代替。
1.5醋酸钠等试剂沉淀dna连接产物实验方法
基本同“1.2处理组实验方法”，但将“a.10μl连接产物加入2μl10m醋酸铵。”用“a.10μl连接产物加入2μl3m醋酸钠(ph5.2)”步骤代替。
2.实验结果
2.1醋酸铵等试剂处理的dna连接产物可有效提高大肠杆菌转化效率
分别转化醋酸铵等试剂处理的dna连接产物和未处理的dna连接产物进入大肠杆菌(感受态大肠杆菌用量为10μl或者100μl)，统计lb固体培养基平板上所长出的单克隆数。发现，dna连接产物经本发明所述方法处理(处理组)后转化大肠杆菌所得到的单克隆数量显著多于未处理组(图2)。对数据进行独立样本t检验分析，未处理组与处理组之间存在显著性差异(图3)。
dna连接产物经本发明所述方法处理后转化大肠杆菌(处理组)，在lb固体平板上所长出的单克隆数明显多于未处理组。进一步统计分析了dna连接产物转化大肠杆菌感受态后得到单克隆数的差异性，无论是转化10μl感受态大肠杆菌，还是100μl感受态大肠杆菌，处理组连接产物转化大肠杆菌得到的单克隆数目与未处理组的单克隆数之间均存在显著性差异(统计方法：独立样本t检验，**表示p≤0.01，*表示p≤0.05)。本发明所述方法处理之后的dna连接产物，用10μl感受态大肠杆菌进行转化，便可得到较多的单克隆；若未使用本发明所述方法处理dna连接产物，必须用100μl感受态大肠杆菌转化dna连接产物才能得到较多的单克隆。说明，通过本发明所述方法处理之后的dna连接产物，可以较大程度的降低转化时感受态大肠杆菌的用量。
2.2用70％乙醇洗涤沉淀的dna连接产物，会影响dna连接产物的转化效率
在质粒大量提取过程(已有技术)中，为了保证所提取质粒dna的纯度(高纯度的质粒dna利于酶切、连接等实验)，要求利用70％乙醇对沉淀得到的质粒dna进行洗涤。本发明用醋酸铵等试剂沉淀dna连接产物(未用70％乙醇洗涤沉淀)，便可很好的提高重组dna连接产物转化大肠杆菌效率，而加入70％乙醇洗涤沉淀的重组dna连接产物，反而会影响dna连接产物的转化效率(图4)。统计学分析表明，醋酸铵等试剂处理组转化大肠杆菌得到的单克隆数目显著高于70％乙醇洗涤组的单克隆数目(统计方法：独立样本t检验，**表示p≤0.01，n.s.表示无统计学差异)(图5)。因此，本发明实验方法流程中未用70%乙醇洗涤沉淀。
2.3te(ph8.0)缓冲液溶解连接产物沉淀，会影响连接产物转化效率
te(ph8.0)缓冲液常用来溶解dna，在质粒大量提取过程(已有技术)中，要求使用该溶液溶解dna，以达到保存dna的最佳条件。实验用醋酸铵和无水乙醇沉淀dna连接产物后，比较了分别用te(ph8.0)缓冲液和0.1mcacl2溶解沉淀后转化大肠杆菌的效果(图6)，发现用0.1mcacl2溶解的dna连接产物，转化大肠杆菌后所得到的单克隆数目显著高于te(ph8.0)缓冲液组(统计方法：独立样本t检验，*表示p≤0.05)(图7)。因此，本发明实验方法选择0.1mcacl2溶解dna连接产物。
2.4醋酸钠替代醋酸铵沉淀dna连接产物，转化大肠杆菌的效率下降
10m醋酸铵与3m醋酸钠(ph5.2)均可用于沉淀dna，但用它们沉淀dna连接产物及用于转化感受态大肠杆菌的效果尚不清楚。因此，实验比较了分别用10m醋酸铵(本发明所述方法内容)和3m醋酸钠(ph5.2)沉淀的dna连接产物转化感受态大肠杆菌的效果(图8)，发现用10m醋酸铵(本发明方法)沉淀的dna连接产物转化大肠效率显著高于3m醋酸钠(ph5.2)沉淀组(统计方法：独立样本t检验，**表示p≤0.01，*表示p≤0.05)(图9)。因此，本发明实验方法选择10m醋酸铵处理dna连接产物。
2.5用本发明所述方法处理后的dna连接产物，其转化大肠杆菌效率优于用dna纯化柱所纯化的dna连接产物
在分子克隆操作中，dna沉淀法或dna吸附柱法均可对dna进行纯化。于是，实验比较了这两种方法处理的dna连接产物转化感受态大肠杆菌的效率。dna沉淀法采用本发明所述方法，dna吸附柱法则采用dna产物纯化试剂盒(索莱宝公司，货号：d1300)进行。相同dna连接产物分别用两种方法处理后，转化感受态大肠杆菌，发现本发明所述方法处理后的dna连接产物转化效率显著高于dna吸附柱法(统计方法：独立样本t检验，*表示p≤0.05)(图10和图11)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>南华大学；
<120>一种提高dna重组片段转化大肠杆菌效率的方法
<141>2018-01-23
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>27
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
<210>3
<211>738
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3