本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种基于杂交序列荧光淬灭基团切割及溶解曲线分析的靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及检测方法。
背景技术：
荧光pcr技术是检测靶核酸序列的常用技术，目前常用的荧光pcr检测方法包括taqman探针法、分子信标探针法、杂交探针法等。其中taqman探针法主要依赖核酸聚合酶的外切酶活性，在pcr延伸过程中切割与靶序列杂交的荧光探针，释放其5'端荧光基团，通过5'端荧光基团被释放后引起的荧光值上升检测靶序的存在。分子信标探针法和杂交探针法主要通过探针在特定温度下与靶序列的杂交，造成荧光基团与淬灭基团的空间距离变化所引起的荧光信号强弱变化来检测靶序列的存在。
荧光探针溶解曲线分析技术是基于不对称pcr扩增技术的一种定性检测方法。利用分子信标探针、fret探针或taqman探针在不对称pcr反应后进行溶解曲线分析，可因为所结合序列变化所造成的溶解曲线峰值变化，从而分辨不同的靶序列位点。这项技术主要优势在于可以利用不同荧光通道和不同荧光探针溶解峰温度的组合同时检测多个检测位点，而且设计良好的探针可以通过溶解峰的变化分辨不同的突变位点。
目前荧光探针溶解曲线技术在同一荧光通道使用多条荧光探针进行检测时，即使荧光探针未与靶序列结合，探针自身或探针之间在低温条件下互相缠绕误杂交也会产生背景信号，多条荧光探针的背景信号之间互相干扰叠加，造成荧光背景过高，从而影响了溶解曲线的判读。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种基于杂交序列荧光淬灭基团切割的检测靶核酸序列的多重淬灭荧光探针及检测方法，多条检测探针的背景信号之间不会互相干扰叠加。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种检测靶核酸序列的多重淬灭荧光探针(multiplequencherfluorescenceprobe,mqfp)，所述多重淬灭荧光探针具有两个以上淬灭基团。
在其中一些实施例中，所述淬灭基团为fam、rox、hex、或cy5。
在其中一些实施例中，所述荧光基团与3'端的淬灭基团的碱基距离为1-30个。
在其中一些实施例中，所述荧光基团与3'端的淬灭基团的碱基距离为1-6个。
一种检测靶核酸序列的方法，采取上述多重淬灭荧光探针进行检测，包括以下步骤：
以待检测核酸序列为模板，在相应引物与多重淬灭荧光探针作用下进行荧光pcr反应，绘制熔解曲线，即可。
本发明的检测靶核酸序列的多重淬灭荧光探针，包含两个以上的荧光淬灭基团。除5'端第一个淬灭基团以外的淬灭基团会在荧光探针与检测靶序列结合情况下，在引物延伸时被dna聚合酶的核酸外切酶切除，从而释放出仅包含第一个淬灭基团和荧光基团的荧光检测探针片段，并与体系中游离的检测探针结合产生特定tm值的熔解曲线，从而对靶序列的存在进行检测。当检测靶序列不存在时，多重淬灭荧光探针的荧光基团会被邻近的第二个及之后的淬灭基团淬灭，不会发出荧光，也不会产生荧光探针背景，从而不会影响多重pcr中其它靶序列的检测。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的基于杂交序列荧光淬灭基团切割的靶核酸序列检测方法与其它溶解曲线分析技术相比，当检测靶序列不存在情况下，荧光探针不产生荧光信号，使得熔解曲线分析时的背景本底明显降低，不会影响其它阳性靶序列的检测；当有多条荧光探针存在时，荧光探针自身的本底信号不会互相干扰，使得多重pcr的判读更加清晰。
附图说明
图1为本发明的检测靶核酸序列的多重淬灭荧光探针的结构示意图；
图2为本发明的基于杂交序列荧光淬灭基团切割的靶核酸序列检测方法的原理图；
图3为本发明实施例2的检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本发明，并不限制本发明的权利要求。
实施例1基于杂交序列上荧光淬灭基团切割的靶核酸序列检测技术
请参阅图1，为本发明的检测靶核酸序列的多重淬灭荧光探针的结构示意图，多重淬灭荧光探针包含两个部分，5'端为荧光检测探针部分，包含淬灭基团1和荧光基团，这部分不与待检测的目标靶序列结合，3'端为靶序列结合部分，包含淬灭基团1以外的其它淬灭基团，此部分与待检测的目标靶序列可反向互补结合。
请参阅图2a-c，为本发明的基于杂交序列荧光淬灭基团切割的靶核酸序列检测方法的原理图。完整的多重淬灭荧光探针与检测探针结合时，由于第2个及之后淬灭基团的影响，在溶解曲线分析时没有荧光信号产生(图2a)。当反应体系中存在靶序列时，靶序列结合部分与对应的靶序列反向互补结合，pcr引物在taq酶作用下从5'向3'延伸，依赖taq酶的5'核酸外切酶活性切割探针的靶序列结合部分，释放出探针5'端游离的荧光检测探针部分(图2b)。在pcr反应中释放出的荧光检测探针部分可与检测探针结合，由于失去了第2个及以后的淬灭基团的淬灭作用，荧光基团发出的荧光信号增强，在溶解曲线分析时产生荧光信号(图2c)。
实施例2使用本发明实施例1的方法检测不同浓度靶序列模板
使用本发明实施例1的方法检测不同浓度靶序列模板以评价其实用性。靶序列模板为包含pcr扩增区域的人工质粒(t载体质粒，生工生物(上海)有限公司合成)，按浓度稀释为e2、e3、e4不同浓度(分别为102copies/ul，103copies/ul，104copies/ul)。
使用仪器为上海宏石slan-96p荧光定量pcr仪。
扩增引物序列为：
ng-f:tacgcctgctactttcacgct(seqidno:1)
ng-r:caatggatcggtatcactcgc(seqidno:2)
荧光探针序列为：
ng-p:acgacggcttggctttacttcatgcccctcattggcgtgtttcg
(seqidno:3，其中，5'bhq1修饰，3'c3spacer修饰，第19位碱基fam标记，第23位碱基bhq1标记)
检测探针序列为：
ng-t：agtaaagccaagccgtcgt(seqidno:4，3'c3spacer修饰)
检测探针可与多重淬灭荧光探针的荧光检测探针部分互补结合。当多重淬灭荧光探针在pcr反应中被切割而释放荧光检测探针部分时，检测探针与荧光检测探针部分结合后可在溶解曲线分析时产生溶解曲线。
反应体系为：
反应条件：
熔解曲线分析：
设置检测荧光通道为fam
反应条件为：95℃2min；45℃2min；45℃-85℃熔解曲线分析。
判读阈值：噪声阈值设为10。
多重淬灭荧光探针与靶序列结合并释放出5‘端的荧光检测探针部分，检测探针作为检测模板与其结合产生特定tm值的溶解曲线。结果如图3所示，从图3结果可知，e2、e3、e4均出现63度左右溶解峰(三个峰的高度由上至下为e2、e3、e4)，而ntc(nonetemplatecontrol,存在靶序列的空白对照)均无对应溶解峰。
试验例本发明的检测方法的灵敏度、特异性试验
1、敏感性试验
将淋球菌(ng)的质粒标准品分别做8个稀释度从1×107～1×100拷贝数/μl，以倍比稀释为模板分别进行如实施例2所述的荧光定量pcr扩增，噪音阈值设为10，定量pcr仪随机分析软件自动判读tm值，存在tm值63±1摄氏度的溶解峰判读为阳性，否则判读为阴性。同时利用引物对seqidno:1和seqidno:2进行常规pcr扩增。
检测结果表明，利用本发明的方法检测ng标准质粒的灵敏度可达1×102拷贝数/μl，而普通pcr最低可以检测到1×102拷贝数/μl，说明本发明的方法与普通pcr方法相同。
2、特异性试验
通过本发明实施例1的检测方法，分别对国家标准品菌种样本：淋球菌、人乳头瘤病毒、沙眼衣原体、解脲脲原体、微小脲原体、阴道毛滴虫、生殖道支原体、人型支原体进行检测，结果表明，除淋球菌标准品会有阳性溶解峰外，其他病原体样本均没有阳性溶解峰，证明本发明建立的检测方法特异性强，与其他常见的生殖道病原体均无交叉反应。
3、重复性试验
以ng质粒标准品中的1×106和1×104拷贝数/μl两个稀释度的作为模板，对这两个稀释度在不同时间段进行2次重复测定，每次对同一模板同时进行3次重复测定及设置3个重复孔，按照本发明实施例2所述的方法进行实时荧光定量pcr。其中：变异系数(β)＝标准偏差(sd)/平均数(x)，结果重复性试验阳性率100％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>江西贤聚景欣医药生物科技有限公司、赣南医学院第一附属医院、江西耀阳医疗科技有限公司
<120>用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tacgcctgctactttcacgct21
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
caatggatcggtatcactcgc21
<210>3
<211>44
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
acgacggcttggctttacttcatgcccctcattggcgtgtttcg44
<210>4
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
agtaaagccaagccgtcgt19