本发明属于分离原代细胞领域，具体涉及一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法。
背景技术：
多年来支持细胞的功能被认为是生精细胞的支架,，为生精细胞提供必需的营养物质,能合成与分泌雄激素结合蛋白(androgenbindingprotein,abp)，为生精细胞提供高浓度的雄激素环境等。睾丸支持细胞紧密连接参与构成的血-生精小管屏障，可阻止某些物质进出生精上皮，形成并维持有利于精子发生的微环境，还能防止精子抗原物质逸出到生精小管外而发生自体免疫反应。近年来支持细胞生物学特性的研究揭示了支持细胞还能分泌多种物质，而且众多研究者在支持细胞的应用性方面开始进行探索。睾丸支持细胞在体外可促进神经元以及胰岛细胞的存活及功能，为糖尿病和帕金森病的治疗开辟了广阔的前景。近年还报道了睾丸支持细胞用于体细胞克隆的可能性。所有这些说明睾丸支持细胞的功能非常广泛，应用前景广大，其具体的作用机制以及更广泛的应用有待于进一步开发。在分离培养支持细胞中，选择合适的试验动物是分离培养支持细胞的基础，而sd大鼠是试验中常用的试验动物，其遗传稳定，而且经济实用，处理容易，而且大鼠属于哺乳动物。随着目前对支持细胞的研究越来越深入，支持细胞在临床研究也有重要的作用，因此分离出数量多，纯度高的支持细胞方法是研究支持细胞的生物学应用的基础。
大鼠睾丸组织结构是由8大部分构成：即鞘膜脏层、白膜、睾丸隔膜、睾丸纵隔、间质细胞、直精小管和睾丸网、生精小管，生精小管由支持细胞和生精细胞构成。因此支持细胞的分离纯化过程中，从大鼠日龄的选择到睾丸支持细胞分离和纯化，对每一个步骤都要求很高，其中任何一个因素都可能影响支持细胞的数量和纯度。尤其是分离两步酶消化的过程中，如果酶消化时间过长可能导致细胞消化过度，得到的细胞数量较少；如果消化时间较短可能会使支持细胞消化不彻底，得到的细胞纯度低，因此在分离过程中对酶消化的时间要求很严格。
技术实现要素：
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法。
为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现：
一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，包括如下步骤：
s1：细胞分离：
（1）选用18-22日的sd大鼠睾丸，置于预先加入4~6℃预冷的无菌pbs培养皿中，清洗睾丸表面的粘液和血液，并用眼科剪和眼科镊去除睾丸被膜及睾丸实质中的血管；；
（2）将步骤（1）中的睾丸实质置于青霉素瓶中，加入预冷pbs，用眼科剪将睾丸实质剪碎为1~2mm3的组织块，静置后移除上层清液；
s2：细胞消化：
（3）将步骤（2）中的组织块转移至15ml离心管中，加入4~5倍于组织块体积的0.25%胰蛋白酶，振荡使组织块中的曲精小管散开；
（4）将步骤（3）中的离心管置于水浴锅消化直至组织块消化成线索状，加入1~2ml胎牛血清终止消化，采用1500r/min离心5min，移除上层清液，加入pbs缓冲液使细胞悬浮，并采用移液枪吹打悬浮细胞；
（5）对步骤（4）的离心管采用1000r/min离心5min，移除上层清液后加入3~4倍于组织块体积的0.1％iv型胶原酶，置于水浴锅中消化直至组织块变成粘液状，加入dmem高糖完全培养基终止消化；
（6）将经步骤（5）消化的组织块过滤后收集过滤液于离心管中，采用800r/min离心5min后移除上层清液，获得睾丸支持细胞；
s3：细胞培养：
（7）采用dmem高糖完全培养基重悬睾丸支持细胞，采用细胞计数仪进行细胞计数并将细胞浓度调整为（0.5~1）×106/ml，接种于25cm2培养瓶中，使细胞分散均匀后置于二氧化碳培养箱中培养；
s4：细胞纯化：
（8）培养24h在显微镜下观察，在室温条件下的使用pbs洗涤，更换37℃预热的，分离培养的72h内，每隔24h换一次新的培养基，待细胞长至培养瓶的85-95%时进行细胞传代。
进一步地，步骤（2）中在青霉素瓶中剪碎睾丸组织块，预冷pbs添加量为3~4ml，预冷温度为4°~6°。
进一步地，步骤（2）中，静置时间为3~5min，所述上层清液采用规格1ml的移液枪移除。
进一步地，步骤（4）中水浴锅消化温度37℃，消化时间为12~15min，消化期间每隔2min震荡离心管一次；所述pbs缓冲液添加量为10ml。
进一步地，步骤（5）中水浴锅消化温度37℃，消化时间为8~10min，消化期间每隔2min震荡离心管一次。
进一步地，步骤（6）中所述组织块采用100目金属网筛进行过滤。
进一步地，步骤（7）中，所述dmem高糖完全培养基包括100iu/ml青霉素、100ug/ml链霉素以及10%fbs；所述二氧化碳培养箱的培养环境为37℃、5%co2以及饱和湿度。
本发明的有益效果：
1、睾丸实质置于青霉素瓶中，采用眼科剪剪碎，这种方式易于操作，能有效减少细胞损伤，而且组织块剪碎的较为均匀；同时青霉素瓶瓶口小而且能够耐高温，可有效减少细胞污染；
2、本发明采用4~5倍于组织块体积的0.25%胰蛋白酶和3~4倍于组织块体积的0.1％iv型胶原酶，并在水浴锅中每2min震荡一次，有效缩短常规两步酶消化的时间，不仅使支持细胞消化更为彻底，同时有效避免细胞消化过程中消化过度导致的细胞损伤；
3、本发明采用的两步酶法能够获得较高的支持细胞产量，获得的支持细胞活力大大提高；
4、本发明的睾丸支持细胞在培养过程的72小时内每隔24h即换一次新的培养基，能有效去除生精细胞，减少对细胞的伤害，纯化支持细胞。
5、本发明的支持细胞在培养24h，用室温条件下的pbs轻轻洗涤一次，能有效减少常规中tris-hcl去除生精细胞的损伤。
6、本发明在获得支持细胞过程中，在0.25%胰蛋白酶消化结束后的第二次离心采用1000r/min离心5min，有效收集细胞并减少对细胞的损伤。
7、本发明在收集细胞滤液后采用800r/min低速离心，能避免有的高速离心对支持细胞的损伤，而且达到收集支持细胞的效果，避免细胞损失。
附图说明
图1为现有技术分离培养获得的100倍显微镜下的支持细胞形态图；
图2为本发明分离培养获得的100倍显微镜下的支持细胞形态图；
图3为本发明分离的睾丸支持细胞的原代培养细胞形态变化图；
其中，
a：睾丸支持细胞第1h100倍显微镜下的细胞形态图，
b：睾丸支持细胞第1天100倍显微镜下的细胞形态图，
c：睾丸支持细胞第2天100倍显微镜下的细胞形态图，
d：睾丸支持细胞第3天100倍显微镜下的细胞形态图。
图4为睾丸支持细胞原代培养第一至第四代细胞形态变化图；
其中，
a：睾丸支持细胞培养第一代细胞在100倍显微镜下的活细胞观察图，
b：睾丸支持细胞培养第二代细胞在100倍显微镜下的活细胞观察图，
c：睾丸支持细胞培养第三代细胞在100倍显微镜下的活细胞观察图，
d：睾丸支持细胞培养第四代细胞在100倍显微镜下的活细胞观察图，
e：睾丸支持细胞培养第一代细胞在100倍显微镜下的经he染色的细胞形态图，
f：睾丸支持细胞培养第二代细胞在100倍显微镜下的经he染色的细胞形态图，
g：睾丸支持细胞培养第三代细胞在100倍显微镜下的经he染色的细胞形态图，
h：睾丸支持细胞培养第四代细胞在100倍显微镜下的经he染色的细胞形态图，
i：睾丸支持细胞培养第一代细胞在200倍显微镜下的经he染色的细胞形态图，
j：睾丸支持细胞培养第二代细胞在200倍显微镜下的经he染色的细胞形态图，
k：睾丸支持细胞培养第三代细胞在200倍显微镜下的经he染色的细胞形态图，
l：睾丸支持细胞培养第四代细胞在200倍显微镜下的经he染色的细胞形态图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明提供的一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法，包括如下步骤：s1：细胞分离：（1）取交配繁殖的18-22d雄性sd大鼠，无水乙醚麻醉后颈椎脱臼致死，全身浸泡于75％酒精中，紫外灯下照射10min，无菌操作取睾丸并置于预先加入4~6℃预冷的无菌pbs培养皿中，两次清洗睾丸表面的粘液和血液，并用眼科剪和眼科镊去除睾丸被膜及睾丸实质中的血管；（2）将步骤（1）中的睾丸实质置于青霉素瓶中，加入3ml、预冷温度为4~6℃的pbs缓冲液，用眼科剪将睾丸实质剪碎为1~2mm3的组织块，静置3min后采用1ml移液枪移除上层清液；s2：细胞消化：（3）将步骤（2）中的组织块转移至15ml离心管中，加入4~5倍于组织块体积的0.25%胰蛋白酶，轻轻振荡使组织块中的曲精小管散开；（4）将步骤（3）中的离心管置于37℃水浴锅消化12~15min，消化期间每隔2min震荡离心管一次直至组织块消化成线索状，加入1~2ml胎牛血清终止消化，采用1500r/min离心5min，移除上层清液，加入5mlpbs缓冲液使细胞悬浮，并采用1ml移液枪吹打悬浮细胞；（5）对步骤（4）的离心管采用1000r/min离心5min，移除上层清液后加入4~5倍于组织块体积的0.1％iv型胶原酶，置于37℃水浴锅中消化8~10min，消化期间每隔2min震荡离心管一次直至组织块消化成粘液状，加入1~2ml胎牛血清终止消化；（6）将步骤（5）消化的组织块通过100目金属网筛过滤后收集过滤液于离心管中，采用800r/min离心5min后移除上层清液，即可获得睾丸支持细胞，如图2所示为在显微镜下睾丸支撑细胞的形态图，图1为现有技术分离培养的睾丸支持细胞形态图；s3：细胞培养：（7）采用dmem高糖完全培养基重悬睾丸支持细胞，所述dmem高糖完全培养基包括100iu/ml青霉素、100ug/ml链霉素以及10%fbs，采用细胞计数仪进行细胞计数并将细胞浓度调整为（0.5~1）×106/ml，接种于5ml培养瓶中，使细胞分散均匀后置于37℃、5%co2以及饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养；s4：细胞纯化：（8）培养24h后在显微镜下观察，采用pbs洗涤，更换dmem高糖完全培养基，分离培养的72h内，每隔24h换一次新的培养基，待细胞长至培养瓶的85-95%时进行细胞传代，如图3所示，为分离的原代细胞在培养的72小时内的形态变化图。
对本发明分离得到的细胞以及细胞传代后的不同代细胞进行鉴定：
一、细胞he染色鉴定：取不同代细胞，本实施例中采用第一代至第四代，制备细胞爬片，采用pbs洗涤3次，每次2min，使用95%乙醇固定，固定时间20min，固定结束后使用pbs洗涤2次，每次1min，并采用苏木精染液染色2.5min，对完成染色的细胞爬片使用蒸馏水冲洗，使用1%盐酸酒精进行分色，分色时间5s，对完成分色的细胞爬片采用自来水蓝化，使用伊红染色2min，梯度乙醇70%、80%、90%各洗涤一次，每次1min，95%、100%乙醇洗涤2次，每次1min，二甲苯洗涤3次，每次1min，中性树胶封片，在显微镜分别用不同放大倍数进行观察，如图3，分别为第一代至第四代的细胞形态图，并有经过染色的不同代细胞形态图与活细胞形态图的对比图；
二、细胞免疫荧光鉴定：取分离培养所得细胞，制备细胞爬片，使用4%多聚甲醛固定，固定好的细胞爬片，用含0.1%tris-hcl的pbs洗涤3次，每次5min，并使用3%h2o2室温处理15min；处理完的细胞爬片使用pbs洗涤3次，每次5min，滴加1∶1000的一抗vimentinantibody，在4℃静置10h；完成后将细胞爬片处于室温的环境下平衡30min，并采用pbs洗涤3次，每次5min，向细胞爬片上滴加二抗alexafluro，37℃温度下孵育2h后使用pbs洗涤3次，每次3min；最后滴加dapi染色15min，并采用pbs洗涤3次，每次3min，荧光显微镜下观察拍照。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。