本发明涉及昆虫物种鉴定领域，具体涉及南山库蠓的dna条形码标准序列及其分子鉴定方法。
背景技术：
库蠓（culicoideslatreille,1809）隶属于昆虫纲（insecta）双翅目（diptera）蠓科（ceratopogonidae），其体型微小、种类繁多、分布广泛，在全世界现有1368种、中国已知347种，并且在世界范围内还在不断发现新物种。吸血蠓是指能通过刺吸反刍动物血液来传播虫媒病原体的蠓，包括库蠓属culicoides、蠛蠓属lasiohelea、细蠓属leptoconops和澳蠓属austroconops等。在库蠓属吸血蠓中，通过蠓媒传播的病原体有蓝舌病病毒(btv)、家畜流行性出血热病毒（ehdv）、施马伦贝格病毒（sbv）、非洲马瘟病毒（ahsv）等诸多病原体。也正因吸血蠓与医疗卫生和兽医等领域息息相关，故一旦爆发家畜流行病将造成巨大的经济损失，如欧洲就曾发生过蓝舌病（bt）和施马伦贝格病（sb）大流行，国内也在多省（云南、新疆和内蒙古等）的牛羊中检测出btv。因此，准确鉴定疾病媒介是对蠓传疾病进行监测、防治的关键一步。
目前，在库蠓的传统形态学分类鉴别方面困难重重，一方面库蠓卵、幼虫和蛹等早期发育阶段的形态结构和肢体残缺的虫体均难以辩认，并且库蠓雌虫和雄虫鉴定昆虫程度有差别，雄性利用外生殖器和尾器等形态特征易于鉴别，而雌性分类特征少较难区分；另一方面由于库蠓表型的可塑性和遗传的可变性也容易导致误判，并且传统形态学鉴定操作过程较为繁琐且需具备较强的专业知识和丰富的实践经验。因此，亟需寻求一种快速、准确的方法，以弥补传统形态学分类方法的不足。
随着分子生物学和生物信息学的快速发展，以dna序列分析为依据的分子鉴定已成为物种鉴定的常用技术手段，极大地弥补了传统分类学鉴定的缺陷。dna条形码技术是指生物体内一段标准的、有足够变异和一定保守性的、且相对较短易扩增的dna片段。因此，作为dna条形码的标准目的基因，其必须满足两个条件，一是必须具有一定的保守性，便于通用引物设计及进行大范围的pcr扩增；二是要有足够的变异性，以区分不同物种，尤其是近缘种。
昆虫线粒体dna为双链闭环分子，由nd1-6、nd4l、coi-coiii、atpase6、atpase8、cytb等13个蛋白质基因、22个trna基因和2个rrna基因（16srrna和12srrna）共37个基因和包含复制启动子的非编码区段组成。coi是目前全世界应用频率最高的分子标记，其基因大小和结构较为保守，包含信息量大，能够保证足够变异的同时又容易被通用引物扩增，在物种内不同个体之间只有1%-2%的差异，而近缘种间的差异明显，且具有较多的系统发育信号，更适合解析亲缘关系密切的生物类群，是使用最广泛的分子标记。
迄今为止，已有诸多研究证明coⅰ基因适用于绝大多数生物类群的分子鉴定，如昆虫、鸟类、鱼类、线虫等类群的分类鉴定。因此，采用coⅰ基因的dna条形码技术对吸血蠓进行分子鉴定。该方法与传统形态学分类方法互为佐证，不仅可实现吸血蠓的快速、准确鉴定，而且利用dna条形码技术可帮助发现库蠓属中的隐存种或新种。目前，通过该方法已获得多种吸血蠓的coⅰ基因序列并上传至genbank中，但至今尚无南山库蠓的coⅰ基因序列。本发明提供的南山库蠓dna条形码标准基因序列有利于实现南山库蠓的快速、准确鉴定，缩短物种鉴定时间。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种南山库蠓的dna条形码标准基因序列及其分子鉴定方法。通过分子生物学dna测序的方法获取南山库蠓dna条形码标准基因—coⅰ基因序列，通过基因序列相似性的比对，实现南山库蠓的快速、准确鉴定。
为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
通过dna模板制备和pcr反应，由合成的引物扩增南山库蠓的coⅰ基因，经扩增后pcr产物可用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，并将特异性扩增出大小约为650bp的条带送生物公司测序。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在ncbi中进行blast相似性搜索，确保所得序列为目标基因序列，同时南山库蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定，并经权威专家复核，从而保证了结果的可靠性。本发明所述的南山库蠓dna条形码标准基因为coⅰ基因，所述南山库蠓的coⅰ基因序列如seqidno.1所示：
ctgatccggactagttggagctaccctaagcttattaattcgaatagaattaagttgccc60
gggaaatttttttgctagagaccaaatttataatgtaattgttacttctcatgcatttat120
tataatttttttcatagtaatacctgttataattggaggcttcggaaactgattagttcc180
cttaatactaggcgccccagacatagctttcccccgaataaacaatataagattttgaat240
acttcccccctctctttctcttcttactattagaagatttgtagacacaggagctggtac300
tggatgaacgatatacccacccctctcttcctttttagcccacccaaatgcctcagtaga360
tttagctattttttctttacatttagccggtatctcttccattttaggagctgtaaattt420
tattactacaatcataaatatacgtcctgcaggaataaccctagataatataccattatt480
tgtttgatcagtatttattactgctattcttttacttctttctttaccagtactagcagg540
tgctattaccatattattaacagatcgaaatattaatacctctttttttgaccctgccgg600
aggaggggaccccatcctttatcaacatttattttgattttttggtcacc650
所述的南山库蠓dna条形码标准基因序列的pcr引物，其特征在于pcr引物序列分别为：
正向引物：5’taaacttcagggtgaccaaaaaatca3’；
反向引物：5’ggtcaacaaatcataaagatattgg3’。
本发明的南山库蠓的分子鉴定方法，步骤包括：
1）从待测的蠓组织中分离提取dna；
2）以该dna为模板，采用的引物为：正向引物：5’taaacttcagggtgaccaaaaaatca3’；反向引物：5’ggtcaacaaatcataaagatattgg3’，通过聚合酶链式反应扩增出该库蠓coⅰ基因；
3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，根据电泳条带判断是否为目的条带，如果能特异性扩增出大小约为650bp的条带，则将pcr产物切胶纯化，送生物公司测序；
4）通过测序结果的比对分析，如果相应coⅰ基因序列与seqidno.1的相似性在98%以上，即可判断所述的待测组织为南山库蠓。
采用上述技术方案的有益效果是：
1）本发明联合了传统的形态学鉴定与分子鉴定方法，对所述库蠓进行鉴定，可确保物种鉴定的准确性和可靠性。
2）本发明与传统的形态学鉴定方法相比，所建立的南山库蠓分子鉴定方法可大大缩短南山库蠓的鉴定时间。
3）本发明填补了南山库蠓coⅰ基因序列在genbank数据库中的空白。
附图说明
图1为本发明的技术流程图。
图2为南山库蠓coⅰ基因pcr扩增结果的电泳图谱。编号说明如下：泳道1-6为南山库蠓雌虫的coⅰ基因，检出大小约为650bp的条带。m为markeriii的dnamarker。
图3为未知库蠓雌虫coⅰ基因pcr扩增结果的电泳图谱。编号说明如下：泳道1-2为未知库蠓雌虫的coⅰ基因，检出大小约为650bp的条带。m为markeriii的dnamarker。
具体实施方式
实施例1南山库蠓coⅰ基因序列的获取
1、南山库蠓标本的采集与保存
南山库蠓标本均通过网扫法和灯诱法采集于贵州、海南、云南等省的野外栖息地，并保存于95%酒精中。用解剖针在体视镜下进行解剖，除胸部外其余均制成永久装片，经权威专家鉴定，确保鉴定结果的准确性。将南山库蠓胸部单独标号后进行分子实验。
2、基因组dna提取
将保存的南山库蠓胸部研磨后，按照qiagendneasyblood&tissuekit说明书进行单只库蠓基因组dna提取，并保存至-20℃备用。
3、引物合成
本实施例所用引物如下：
正向引物：5’taaacttcagggtgaccaaaaaatca3’。
反向引物：5’ggtcaacaaatcataaagatattgg3’。
4、pcr扩增
本实施例的pcr反应体系如下：
dna模板1.5ul
上游引物（10um）1ul
下游引物（10um）1ul
2×pcrmastermix12.5ul
ddh2o9ul
总体系25ul
pcr反应条件为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸5min。
5、pcr产物鉴定与回收
pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断是否为目的条带，电泳图谱参见附图2。按照琼脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书进行pcr产物切胶纯化，纯化后的产物送至生物公司进行双向测序。
6、coi基因序列测定
通过人工校对及生物信息学软件对南山库蠓coi基因序列进行比对、编辑和拼接后即为seqidno.1。
实施例2未知库蠓的鉴定
1、蠓标本的采集与保存
蠓标本通过网扫法和灯诱法采集于野外栖息地，并保存于95%酒精中。用解剖针在体视镜下进行解剖，除胸部外其余均制成永久装片用于形态鉴定。将蠓胸部单独标号后进行分子实验。
2、基因组dna提取
将保存的蠓胸部研磨后，按照qiagendneasyblood&tissuekit说明书进行单只未知蠓基因组dna提取，并保存至-20℃备用。
3、引物合成
本实施例所用引物如下：
正向引物：5’taaacttcagggtgaccaaaaaatca3’。
反向引物：5’ggtcaacaaatcataaagatattgg3’。
4、pcr扩增
本实施例的pcr反应体系如下：
dna模板1.5ul
上游引物（10um）1ul
下游引物（10um）1ul
2×pcrmastermix12.5ul
ddh2o9ul
总体系25ul
pcr反应条件为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸5min。
5、pcr产物鉴定与回收
pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断是否为目的条带，电泳图谱参见附图3。附图3显示实施例2的未知库蠓也能通过pcr特异性扩增出大小约为650bp的产物。按照琼脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书进行pcr产物切胶纯化，纯化后的产物送至生物公司进行双向测序。
6、coi基因序列测定
通过人工校对及生物信息学软件对未知库蠓coi基因序列进行比对、编辑和拼接后与seqidno.1进行相似性比对，结果显示其与基因序列seqidno.1的相似性大于98%，因而可判定该未知库蠓为南山库蠓。
序列表
<110>遵义医学院
<120>一种南山库蠓的dna条形码标准序列及其分子鉴定方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>650
<212>dna
<213>南山库蠓coⅰ基因(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1
ctgatccggactagttggagctaccctaagcttattaattcgaatagaattaagttgccc60
gggaaatttttttgctagagaccaaatttataatgtaattgttacttctcatgcatttat120
tataatttttttcatagtaatacctgttataattggaggcttcggaaactgattagttcc180
cttaatactaggcgccccagacatagctttcccccgaataaacaatataagattttgaat240
acttcccccctctctttctcttcttactattagaagatttgtagacacaggagctggtac300
tggatgaacgatatacccacccctctcttcctttttagcccacccaaatgcctcagtaga360
tttagctattttttctttacatttagccggtatctcttccattttaggagctgtaaattt420
tattactacaatcataaatatacgtcctgcaggaataaccctagataatataccattatt480
tgtttgatcagtatttattactgctattcttttacttctttctttaccagtactagcagg540
tgctattaccatattattaacagatcgaaatattaatacctctttttttgaccctgccgg600
aggaggggaccccatcctttatcaacatttattttgattttttggtcacc650
<210>2
<211>26
<212>dna
<213>正向引物(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>2
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<212>dna
<213>反向引物(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>3
ggtcaacaaatcataaagatattgg25