本发明涉及水产动物学领域的生物技术，尤其是涉及一种用于淡水螯虾细胞外源基因表达的转染方法及其应用。
背景技术：
我国是水产养殖大国，虾类养殖业(包括海水对虾和淡水螯虾)是我国许多地区的重要经济产业。但近年来病害问题包括细菌病，真菌病，病毒病等持续突出，使得海水对虾养殖成功率低，2015年中国对虾养殖成功率不到一成，整体产业处于低迷、不景气的状态。相较于海水对虾，淡水螯虾属于外来物种，对养殖环境要求相对较低，但是近年来由于养殖面积大量扩张，养殖密度不断增大，使得以前很少发病的淡水螯虾情况也不甚理想。病害问题严重影响着虾类养殖产业的发展，而获得有效的病害防御方法和抗病良种成为了近年来养殖户的迫切需求。为此中国、美国、瑞典、日本、泰国、越南等国科学家对虾的免疫防御机制以及病害的入侵机制都开展了广泛的研究，但目前所获得的信息还非常有限，这严重影响了对生产实践的指导。究其原因，很大程度上是由于缺乏相关外源基因转染表达的研究平台，使一些关键问题无法深入探讨。因此，本发明创造性地建立一套转染方法，首次攻克这一技术难题，并为其扩展应用提供了可能。
技术实现要素：
本发明的第一目的是提供一段适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的强启动子序列。
本发明的第二目的是提供一个适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的表达载体。
本发明的第三目的是提供一套适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的电穿孔系统以及特定的操作参数。
本发明的第四目的是提供一种适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的转染方法。
所述一段适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的强启动子序列为一段dna核苷酸序列，该序列来源自白斑综合症病毒的极早期基因wsv249的启动子区域，经过筛选比较，发现其在淡水螯虾造血组织细胞中具有强启动子活性，可应用于下游重组表达载体的构建。该序列长度为332bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，序列如下所示，记为seqidno.1：
所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的表达载体为所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的强启动子序列信息合成dna后，将该dna片段插入经过改造的昆虫表达质粒piz/v5-his，获得重组表达载体piz-wsv249p/v5-his，该重组质粒可以在大肠杆菌(escherichiacoli)中大量复制，也可以在淡水螯虾造血组织细胞中实现目的基因的表达，所述经过改造为去掉载体自身带有的多克隆位点前的启动子。
所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的电穿孔系统以及特定的操作参数是celetrixtm电转仪、相关的电击管与电转液在淡水螯虾造血组织细胞外源基因转染表达中的应用，特定的操作参数为电压400v，电脉冲时间30ms，电脉冲次数1次。
所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的转染方法是将外源重组质粒导入淡水螯虾造血组织细胞中，并且实现目的基因大量表达的过程，具体包括以下步骤：
1)使用所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的表达载体，构建包含目的基因片段的重组质粒；
2)淡水螯虾造血组织细胞的分离、培养和预处理；
3)使用所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的电穿孔系统以及特定的操作参数，对淡水螯虾造血组织细胞进行重组质粒的转染；
4)目的基因在淡水螯虾造血组织细胞表达的检测。
本发明使用含有白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus)的极早期基因wsv249启动子序列的重组质粒和celetrixtm电穿孔系统，对转染淡水螯虾造血组织细胞的操作步骤和技术参数进行了摸索，最终建立了一套成功实现淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的操作参数和方法。这套方法可在淡水螯虾造血组织细胞开展外源基因的功能分析与蛋白质制备，对甲壳动物的基础科学研究及生产实际应用，如病害防治等都具有重要的意义，是虾分子生物学研究方法上的突破。
附图说明
图1为绿色荧光蛋白基因在淡水螯虾造血组织细胞中表达的荧光显微镜检测图。上图：10倍物镜下观察；中图：20倍物镜下观察；下图：40倍物镜下观察；fl：荧光光源检测图；bl：明场光源检测图；merge：将fl和bl叠加效果图；比例尺为100μm。
图2为转染操作参数的摸索与优化。a：不同电压下细胞转染效率检测；b：不同电压下细胞存活率检测。
图3为不同细胞量的转染效率比较。上图：5×104个细胞用于转染；下图：1×105个细胞用于转染。fl：荧光光源检测图；bl：明场光源检测图；merge：将fl和bl叠加效果图；比例尺为100μm。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件实验方法的，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册([1]萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版)中所述实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。
1.表达载体的重组
所述强启动子为一段dna核苷酸序列，该序列来源自白斑综合症病毒的极早期基因wsv249的启动子区域([2]yangf,hej,linx,etal.completegenomesequenceoftheshrimpwhitespotbacilliformvirus[j].journalofvirology,2001,75(23):11811-11820)，根据该序列信息合成dna，并在两端加入相应的酶切位点，分别是在序列5’端加入bglⅱ，在3’端加入ecorⅰ。将该dna片段和经过改造的昆虫表达质粒piz/v5-his([3]luot,lif,leik,xux.genomicorganization,promotercharacterizationandexpressionprofilesofanantiviralgenepmavfromtheshrimppenaeusmonodon[j].molimmunol,2007,44(7):1516e23)，分别用bglⅱ和ecorⅰ进行双酶切反应后，纯化回收dna片段。将两者16℃连接4h后转化e.coli感受态细胞top10中，提取质粒，双酶切鉴定，测序验证插入的序列。
2.重组质粒的构建
以“绿色荧光蛋白基因”作为目的基因为例，以实验室保留质粒为模板，通过下列引物
f和r扩增得到绿色荧光蛋白基因egfp。
引物f：tctagaatggtgagcaagggcgagga
引物r：tctagacttgtacagctcgtccatgc
划线部分代表xbaⅰ酶切位点。
pcr扩增方法：在25μl的反应体系中含1μl模板，1μl正反引物(20μm)，2μldntp(各2.5mm)，5μl5×primerstartmbuffer，0.5μlprimerstartmhsdnapolymerase(2.5u/μl)(takara公司)，用h2o将总体积补至25μl。pcr反应条件为：98℃10s、58℃10s、72℃1min(30cycles)；4℃保存。pcr产物经纯化后与t载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞top10中，菌落pcr后选取有dna片段的阳性克隆测序。将含有egfp基因的质粒用xbai酶切，胶回收egfp基因片段，同时将表达载体piz-wsv249p/v5-his也用相同的酶进行酶切。将两者16℃连接4h后转化e.coli感受态细胞top10中，提取质粒，测序验证。
3.淡水螯虾造血组织细胞的分离与培养
淡水螯虾造血组织细胞的分离与培养方法可参见文献[4]([4]linx,kimya,leebl,
1)沿螯虾头胸甲两侧纵向剪开，将两侧壳去除，再将中间壳块掀开，过程中将粘连的结缔组织用刀小心的挑断，直至露出三角区；
2)用磷酸盐缓冲溶液(10mmna2hpo4；10mmkh2po4；150mmnacl；10μmcacl2；10μmmncl2，ph6.8)清洗三角区，用镊子将膜块取出，放于含胶原酶的磷酸盐缓冲溶液中(1mg/ml)，室温放置消化45min；
3)待膜块消化至薄纱状，2500×g离心5min；
4)弃除上清后，加入1ml磷酸盐缓冲溶液，吹吸10次；
5)2500×g离心5min，弃除上清；
6)重复步骤4)和5)一次，加入1ml改良的l-15培养基(培养基中添加5μm2-巯基乙醇，1μm苯硫脲，60μg/ml青霉素，50μg/ml链霉素，50μg/ml庆大霉素和2mml-谷氨酰胺)悬浮细胞；
4.重组质粒转染淡水螯虾造血组织细胞
重组质粒转染淡水螯虾造血组织细胞，具体操作如下：
1)取24孔板，每孔预先加入1ml改良的l-15培养基；
2)将细胞2500×g离心5min，用电转液重悬细胞；
3)取20μl悬浮细胞，加入2μg重组质粒，混匀后加入到电击管中；
4)将电击管放到celetrixtm电转仪中，按照操作参数电压400v，电脉冲时间30ms，电脉冲次数1次进行电击悬浮细胞；
5)取出电击管，吸出悬浮细胞，加入培养基中，反复吹吸10次；
6)将培养板放置25℃培养箱中培养；
7)培养30min后，按每100μl加入1μl细胞因子，继续培养；
8)培养过程中每两天更换培养基一次。
5.目的基因在淡水螯虾造血组织细胞表达的检测
待培养24h后，取出培养板，在荧光显微镜下进行观察，检测绿色荧光蛋白基因的表达情况，如图1所示，经转染重组质粒的细胞，能够检测到明显荧光信号，表明绿色荧光蛋白基因被导入淡水螯虾造血组织细胞并大量表达。
转染操作参数的摸索与优化参见图2，不同细胞量的转染效率比较参见图3。
本发明使用含有白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus)的极早期基因wsv249启动子序列的表达载体和celetrixtm电穿孔系统，对转染淡水螯虾造血组织细胞的操作步骤和技术参数进行了摸索，最终建立了一套成功实现淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的操作参数和方法。这套方法可用于在淡水螯虾造血组织细胞开展基因功能分析与蛋白质制备。本发明在国内外首次提供了一种利用分子生物学手段将外源基因导入淡水螯虾造血组织细胞并大量表达目的蛋白质的方法，该方法对甲壳动物的基础科学研究及生产实际应用，如病害防治等都具有重要的意义，在国际上处于领先地位。
序列表
<110>国家海洋局第三海洋研究所
<120>一种用于淡水螯虾细胞外源基因表达的转染方法及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>332
<212>dna
<213>白斑综合症病毒(whitespotsyndromebaculovirus)
<400>1
tctcgcccaccaccagatatctgggaagccttaggcgagtcatgtttcttgcaccatgta60
tttctaggaatttcgctgacgtcaataaactggtttgtcatcctgttttatccagtttgc120
tgacgtcaatagaccatatttgggcatctcgcccacacagaaacaggatatgatatcata180
gatttctgggaagagggtgttttttgtgccgatctgggtgtataaaagagcgctgcggag240
aggcagaaacatcagacagacttgatctgtacagctagcagcagcagtagcagcagccaa300
gagaagatcggacgcaaaccattctcgcagcc332