一种RNA抑制剂及其在抑制F1F0-ATP合成酶活性中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种rna抑制剂及其在抑制f1f0-atp合成酶活性中的应用。

背景技术：

f1f0-atp合成酶是一个含多亚基的跨膜蛋白复合物。f1位于细胞质中，包含3α、3β、ε、γ和δ亚基。f1f0-atp合成酶能合成和水解atp(三磷酸腺苷)，调节生物体能量供给。atp的异常表达是多种疾病发生的基础，如atp的异常表达与眼底血管异常增生、心肌缺血、肿瘤的恶性程度、侵袭性和不良预后密切相关；肿瘤细胞的转移及增生需要更多的atp，因此，通过抑制细胞内atp水平可以选择性杀死肿瘤细胞及抑制肿瘤血管的生成。f1f0-atp合成酶是线粒体中合成atp的关键酶，抑制该合成酶能够抑制atp的过量异常表达。心肌细胞中，f1f0-atp合成酶对atp的过量消耗导致严重心肌缺血的发生，降低f1f0-atp合成酶活性能调节心肌缺血的发生。

f1f0-atp合成酶抑制剂可用于肿瘤的治疗。研究发现，药物耐受性肿瘤细胞在atp耗尽的情况下化疗敏感性升高，而药物敏感性肿瘤细胞在外源atp补给的情况下化疗耐药性升高。因此，破坏肿瘤细胞的atp代谢对于肿瘤治疗具有非常重要的作用。

肿瘤分子靶向治疗将比目前的化疗更为有效、副作用更小，是非常有希望的一种肿瘤治疗方法。如表皮生长因子受体酪氨酸激酶(egfr－tk)抑制剂吉非替尼主要治疗肺癌，利妥昔单抗主要用于治疗非霍奇金淋巴瘤，曲妥珠单抗是信号转导抑制剂，用于治疗乳腺癌。治疗慢性粒细胞性白血病和胃肠道基质细胞瘤的是甲磺酸伊马替尼。但是随着靶向治疗的临床应用，越来越多的患者也出现了耐药，靶向治疗药物的临床效果并不令人满意。因此放化疗以及靶向治疗的患者，如果联合应用atp抑制剂，能够产生最有效治疗效果，如glut-1(葡萄糖转运蛋白1)抑制剂，包括不可逆抑制剂wzb117和phloretin根皮素、diclofenac(双氯芬酸)、apigegnin、fasentin、stf-31、以及临床获批药物ritonavir(利托那韦)。wzb117和phloretin是glut1的不可逆性抑制剂，可以显著降低葡萄糖的摄入量和细胞内的atp水平，从而抑制糖酵解和细胞生长。补给外源性atp可以缓解肿瘤细胞的wzb117诱导性细胞毒性，这表明wzb117等glut抑制剂通过降低细胞内atp水平抑制肿瘤细胞生长。

f1f0-atp合成酶抑制剂还可用于结核、自身免疫缺陷、心肌缺血等多种疾病，而且在农药中也有所应用。如抗结核类atp合酶抑制剂二芳基喹啉类抗结合药物tmc207，该化合物作用与atp合酶c亚基，能快速有效地杀死结核杆菌；抗自身免疫性疾病atp合成酶抑制剂bz-423，用于治疗i型红斑狼疮免疫性疾病；抗肿瘤合成酶抑制剂，如多烯α-吡喃酮类；还有一种atp抑制剂以抑制glut1为主，不同细胞具有多种glut异构体，行使相同或不同功能，比如单糖运输、己糖运输、双向运输等；且每种细胞上分布着多种类型的glut，这就使得即使glut1的功能被抑制后，其他glut将代偿其功能。

以glut3为例，它主要分布在神经元和胎盘组织，当脑瘤患者神经元上的glut1被抑制后，仍然可以依赖glut3摄取葡萄糖，因此癌细胞还能继续生长。同时，glut1还容易被诱导，即葡萄糖水平低，它就高表达，葡萄糖水平高，它就低表达，这就使得glut1抑制剂的活性很难抑制或易诱发耐(抗)药性。glut1抑制剂长期应用，使脑组织长期缺乏能量供给，脑发育出现障碍。以上这些atp合成酶抑制剂均为化学合成物，具有细胞毒性大及特异性不高等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的是克服上述背景技术的不足，提供一种f1f0-atp合成酶α亚基的rna结合序列，该序列通过结合f1f0-atp合成酶α亚基，使α亚基从线粒体膜释放入胞浆，导致f1f0-atp合成酶解聚，从而降低atp合成酶活性，抑制细胞内atp合成，具有抑制效率高、合成方便、成本低等特点。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种rna抑制剂，其具有如seqidno.1～4所示的rna序列。

经实验发现，seqidno.1所示rna序列是能够与f1f0-atp合成酶α亚基有效结合并实现f1f0-atp合成酶解聚的最短序列，而seqidno.2～4所示序列在rna序列3’端比seqidno.1所示rna序列多1～3各碱基。上述seqidno.1～4所示的rna序列均能够与f1f0-atp合成酶α亚基有效结合并实现f1f0-atp合成酶的解聚。

本发明还提供了一种rna抑制剂，是具有双链结构的rna序列，其中有义链的核苷酸序列如seqidno.1～4所示，互补链的核苷酸序列如seqidno.5～8所示。

经实验发现，能够起到f1f0-atp合成酶解聚作用的为seqidno.1～4所示的单链rna序列。而以双链结构形式存在的rna序列同样也能够实现f1f0-atp合成酶的解聚。

本发明还保护一种编码所述rna抑制剂的dna序列。

本发明提供了所述rna抑制剂在制备抑制f1f0-atp合成酶活性的药物中的应用。

进一步地，所述rna抑制剂的靶点为f1f0-atp合成酶的α亚基。

本发明将rna抑制剂加入至晶状体上皮细胞的培养基中培养72小时，发现晶状体上皮细胞的atp表达量显著下降；本发明还将rna抑制剂加入至晶状体上皮细胞的培养基中培养48小时，并利用f1f0-atp合成酶α亚基的抗体进行westernblot实验，发现晶状体上皮细胞的胞浆中有f1f0-atp合成酶α亚基的高表达，说明rna抑制剂能够解聚f1f0-atp合成酶上的α亚基；此外，本发明还将rna抑制剂加入至晶状体上皮细胞的培养基中培养48小时，发现f1f0-atp合成酶的活性显著降低。

由此可以证明，本发明rna抑制剂能够解聚f1f0-atp合成酶，抑制f1f0-atp合成酶的活性，进而防治由f1f0-atp合成酶过表达而引起的各类疾病。

此外，本发明rna抑制剂可应用于制备抗肿瘤药物和抗血管增生性疾病的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过化学合成的方法得到小片段的rna序列，该序列能够结合细胞内的f1f0-atp合成酶α亚基使f1f0-atp合成酶的α亚基从胞膜释放到胞浆，导致f1f0-atp合成酶解聚，从而抑制细胞内atp合成，具有专一性强，抑制效率高的特点。

(2)本发明提供的rna序列可用于治疗多种疾病，如眼底血管增生、结核、自身免疫缺陷、肿瘤、心肌缺血等多种疾病，而且在农药中也可以应用。

(3)本发明提供的rna序列片段小，只有18～21个核苷酸序列，制作工艺简单。

(4)本发明提供的rna序列具有副作用小，合成方便，成本低等特点。

附图说明

图1为实施例2中dsrna-184-u和dsrna-184-c的序列对比图。

图2为实施例2中单链rna序列中发挥作用的关键序列的鉴定；

其中，a为rna–pulldown实验示意图，cellextract表示细胞提取，desthiobiotin表示脱硫生物素，streptavidin表示链霉亲和素；b为rna–pulldown实验下拉蛋白sds-page电泳后，银染鉴定的单链关键作用蛋白。

图3为实施例3中不同处理下线粒体膜上f1f0-atp合成酶α亚基向胞浆释放的情况；

其中，atpa5表示f1f0-atp合成酶α亚基；gapdh表示甘油醛-3-磷酸脱氢酶，在此作为实验中的内对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1制备rna序列

1、合成单链rna

应用abi394rna自动合成仪合成rna序列，固相合成单链rna：首先将要合成的rna序列(如seqidno.1所示)输入合成仪，rna化学合成时由3’端向5’进行；按以下步骤合成：

1)脱保护基；用三氯乙酸脱去预先连接在cpg上的核苷酸的保护基团dmt(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’-羟基端；

2)活化；将质子化的核苷3’-亚磷酰胺单体与四氮唑活化剂混合进入合成柱，形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体(其5’端仍受dmt保护，3’端被活化)；

3)将步骤2)中活化得到的亚磷酸酰胺四唑活性中间体与步骤1)中脱保护基后的核苷酸混合，使亚磷酸酰胺四唑活性中间体与核苷酸的5’-羟基发生亲核反应，缩合并且脱去四唑，此时合成的寡糖核苷酸链向前延长一个碱基；氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酸酯键与连接在cpg上的寡糖核苷连接，而亚磷酸酯键不稳定、易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酸酰胺转化为磷酸三脂，得到稳定的寡糖核苷酸。

经过上述几个步骤后，一个rna核苷酸就被连接到cpg的核苷酸上；以上步骤均在rna合成仪的合成模块中自动完成，一次加一个碱基到载体结合核苷酸上。

4)反复上述步骤，即可得到rna的片段样品；然后，将rna合成柱切换到切除模块，将氢氧化铵溶液加入到柱内，从载体上切除寡核苷酸，将氢氧化铵溶液中的rna转移到脱保护模块，然后将含核苷酸的溶液在65℃加热1小时，去掉保护基团。

rna纯化分离利用hplc(高压液相色谱)方法对得到的粗品进行纯化分离，收集所需的rna溶液分子并进行浓度测定。

5)采用上述同样的方法合成互补序列，再经hplc纯化。

合成的rna样品的保存方式：将液体rna样品在减压离心机上37℃，12000rpm离心干燥，制成干粉-20℃冻存6个月。

2、合成双链rna

在每1od单链rna样品中加入250μldepc水，配置成20μm储存溶液。各取200μm合成的序列，加入20μl退火缓冲液(100mm醋酸钾,30mmhepes-koh,2mm乙酸镁)中，depc水补到100μl，90℃变性1分钟后，自然降温至室温，得到的产物即为所需双链rna。

将合成的rna双链加样到2.0％的page胶跑电泳进行验证和鉴定纯度。

3、合成不同bp的双链rna

根据上述步骤，分别合成18bp、19bp、20bp和21bp的双链rna，分别命名为dsrna-184-u-18、dsrna-184-u-19、dsrna-184-u-20和dsrna-184-u-21。其中，dsrna-184-u-18的序列如下：

有义链：5’-uggauggagaacugauaa-3’；

互补链：5'-uuaucaguucuccaucca-3'。

dsrna-184-u-19的序列如下：

有义链：5’-uggauggagaacugauaag-3’；

互补链：5'-cuuaucaguucuccaucca-3'。

dsrna-184-u-20的序列如下：

有义链：5’-uggauggagaacugauaagg-3’；

互补链：5'-ccuuaucaguucuccaucca-3'。

dsrna-184-u-21的序列如下：

有义链：5’-uggauggagaacugauaaggg-3’；

互补链：5'-cccuuaucaguucuccaucca-3'。

实施例2rna-pulldown实验及质谱检测关键作用序列及结合蛋白

前期实验验证22个碱基序列长度的dsrna-184-u(5’-uggauggagaacugauaagggu-3’,5'-acccuuaucaguucuccaucca-3')关键作用序列在5’-uggaugg-3’位置。本实验使用对照序列为dsrna-184-c，如图1所示。

细胞抽提蛋白在体外分别与生物素标记的22个碱基的dsrna-184-uduplex(双链复合物)，dsrna-184-u-p1,dsrna-184-u-p2,dsrna-184-cduplex(双链复合物)，dsrna-184-c-p1,dsrna-184-c-p2，体外孵育，然后用抗生物素的抗体做rna-pulldown实验，下拉的rna与蛋白复合物跑sds-page电泳，银染，鉴定差异表达条带。将差异表达条带切割下来进行蛋白质谱测序，所测得的多肽片段与蛋白数据库匹配，鉴定差异蛋白所在基因位置。如图2所示。

实施例3rna序列对f1f0-atp合成酶的影响

1、实验细胞：以晶状体上皮细胞为细胞模型，购自国外atcc公司。

2、实验药品：rna抑制剂由实施例1所制备的rna序列经depc水(焦碳酸二乙酯)溶解后制得，以下简称dsrna-184-u(分为dsrna-184-u-18、dsrna-184-u-19、dsrna-184-u-20和dsrna-184-u-21)；lipofernaimax转染试剂(简称lip)；f1f0-atp合成酶α亚基抗体(简称atp5a抗体)。

3、实验方法与结果：

(1)dsrna-184-u-18复合物对细胞内atp表达的抑制作用。

取正常培养的晶状体上皮细胞，接种于96孔板，接种密度为每100μl培养基中2×10⁴个细胞。分别将0.108μl20μm的dsrna-184-u-18、dsrna-184-u-19、dsrna-184-u-20、dsrna-184-u-21与0.144μllipofectarnaimax置于20μl细胞培养基中混合后，加入至培养的晶状体上皮细胞中，dsrna-184-u-18终浓度为30nm(即：rna处理组)。同时，0.144μlrnaimax直接置于20μl细胞培养基中混合，再加入晶状体上皮细胞中，作为对照组(即：lip对照组)。继续培养72小时后，进行atp合成量的检测。实验同时进行三组，计算平均值。

统计学处理：实验数据用均值±标准差表示，全部实验数据采用spss12.0软件进行处理。

结果如表1所示；

表1不同处理下细胞内atp的表达量

^**与对照组相比，p<0.01。

由表1可见，在细胞培养72小时后，dsrna-184-u-18能非常显著地降低细胞atp的表达(p<0.01)。

(2)dsrna-184-u-18、dsrna-184-u-19、dsrna-184-u-20、dsrna-184-u-21对f1f0-atp合成酶α亚基(atp5a)在线粒体膜及胞浆中表达量的影响。

采用westernblot(免疫印迹试验)技术验证atp5a在线粒体膜上及胞浆中的表达量，dsrna-184-u(药物终浓度30nm)及rnaimax(lip对照组)处理细胞，48小时后，分别提取细胞膜及胞浆蛋白，利用atp5a抗体进行westernblot实验。

具体内容为：使用thermo公司的men-perplus膜蛋白提取试剂盒提取分别提取细胞膜蛋白及胞浆蛋白，进行sds-page凝胶电泳，并将电泳分开的蛋白转到nc(硝酸纤维素)膜上，转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的western洗涤液漂洗，然后在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟后，加入atp5a抗体室温孵育一小时，洗去一抗，加入二抗室温孵育一小时后，进行蛋白曝光检测，整个westernblot实验使用gapdh为内对照。

图3为dsrna-184-u-18处理细胞48小时后，胞浆蛋白atp5a表达的情况；由图可知，rna处理组的胞浆中有atp5a的表达，而lip处理组的胞浆中没有atp5a的表达；由此可见，dsrna-184-u-18能够促使f1f0-atp合成酶的α亚基向胞浆释放

此外，本实施例还分别做了dsrna-184-u-19、dsrna-184-u-20和dsrna-184-u-21处理细胞48小时后，胞浆蛋白atp5a表达的情况；结果与dsrna-184-u-18相同，rna处理组的胞浆中有大量atp5a的表达，而lip处理组的胞浆中只有少量atp5a的表达。

(3)atp合成酶的活性检测

取正常培养的晶状体上皮细胞，接种于6孔板，分别转染dsrna-184-u-18、dsrna-184-u-19、dsrna-184-u-20、dsrna-184-u-21入晶体细胞，终浓度为30nm。同时，rnaimax直接与细胞培养基混合，加入晶状体上皮细胞中，作为对照组。继续培养48小时后，进行atp合成酶活性检测。实验同时进行三组，计算平均值(该值为各处理组与lip对照组数值的比值)。

结果如下：lip对照组为1；dsrna-184-u-18为0.7906±0.044；dsrna-184-u-19为0.82±0.054；dsrna-184-u-20为0.88±0.023；dsrna-184-u-21为0.89±0.01。由此可知，细胞培养48小时后，dsrna-184-u-18、dsrna-184-u-19、dsrna-184-u-20和dsrna-184-u-21处理组的细胞内f1f0-atp酶活性显著降低。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种rna抑制剂及其在抑制f1f0-atp合成酶活性中的应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

uggauggagaacugauaa18

<210>2

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

uggauggagaacugauaag19

<210>3

<211>20

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

uggauggagaacugauaagg20

<210>4

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

uggauggagaacugauaaggg21

<210>5

<211>18

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

uuaucaguucuccaucca18

<210>6

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cuuaucaguucuccaucca19

<210>7

<211>20

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ccuuaucaguucuccaucca20

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cccuuaucaguucuccaucca21