本发明涉及改造后的组织特异性双向启动子，尤其涉及将玉米(zeamays)来源的胚特异性双向启动子进行改造后获得的种子特异性双向启动子，本发明进一步涉及该种子特异性双向启动子在提高种子产量或品质、改良作物性状、构建转基因作物或培育植物新品种等方面的应用。
背景技术：
通过导入外源基因使植物获得新的性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的。花椰菜病毒camv35s启动子以及玉米ubi启动子作为稳定、高效的外源启动子，一直被人们广泛的使用。然而在转基因过程中由于重复序列的出现会引起基因沉默现象，尤其是进行多个基因导入时，这种现象会更严重，从而严重影响转基因植株的获得和后代的稳定性。在进行两个或两个以上基因导入时，通常需要这些基因的表达量、表达时间和位置的同一性，进而确保转入基因行使正常的功能，使用35s启动子或者玉米ubi启动子很难达到这样的要求。
对于转基因引起的基因沉默现象人们已经有了比较深入的认识，引起转基因沉默有多种因素，其中最主要的就是重复序列的产生，尤其是多个基因导入时，更人为的造成了多个35s启动子插入的情况，对此至今尚无有效的解决方法。随着基因组学的发展，多种生物基因组测序已完成，经过生物信息学分析人们发现了双向启动子的存在，这为我们利用植物自身的双向启动子进行转基因操作，从而避免多基因插入引起的基因沉默现象提供了可能。
公开号为cn104651359a的中国发明专利公开了从玉米(zeamays)中分离的双向启动子，所分离的双向启动子为胚特异性启动子，能够启动报告基因在玉米胚中进行特异性表达。由于玉米胚乳占玉米种子生物量的2/3以上，如果进行改造获得具有胚乳启动活性的双向启动子，将具有更广泛的应用前景。
技术实现要素：
本发明目的之一是将cn104651359a中所公开的胚特异性启动子进行改造获得能够驱动外源基因在种子胚和胚乳中同时进行表达的种子特异性双向启动子。
本发明目的之二是提供含有上述种子特异性双向启动子的重组表达载体以及含有该重组表达载体的宿主细胞。
本发明目的之三是将所述的种子特异性双向启动子以及含有该种子特异性双向启动子的重组表达载体应用于提高种子产量或品质、构建转基因植物以及改良农作物种子性状、培育具有优良性状的植物新品种等方面。
为实现上述目的，本发明将中国发明专利公开号为cn104651359a中的胚特异性双向启动子序列(其在cn104651359a中的序列为seqidno.1所示)中插入一些种子特异性顺式作用元件以期能够获得驱动外源基因在玉米种子胚和胚乳中同时进行表达的种子特异性双向启动子。本发明将cn104651359a中的seqidno.1所示的胚特异性双向启动子序列在不同的位点插入不同的种子特异性顺式作用元件，获得了8条改造后的双向启动子序列，分别命名为pr5sgpa、p2r5sgpa、prsga、p2rsga、prspa、p2rspa、prsgpa和p2rsgpa，其碱基序列分别为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8所示；本发明以gus和egfp为报告基因，将seqidno.1-seqidno.8为双向启动子，在其两端分别接上gus和gfp两个报告基因，分别构建了瞬时表达载体和稳定表达载体并将其转化到玉米中进行功能验证，功能验证结果表明，无论是瞬时表达还是稳定表达，改造后的8条启动子序列中仅有pr5sgpa和p2r5sgpa这两条双向启动子序列能够同时驱动报告基因在玉米的胚和胚乳中进行特异性表达，而其它的6条改造后的启动子序列仍不具有驱动报告基因在胚乳中进行特异性表达的功能。
由此，本发明首先提供了一个种子特异性双向启动子，其多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示:
(a)、seqidno.1所示的多核苷酸序列；或
(b)、与seqidno.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有种子特异性双向启动子的功能或活性；或
(c)、与seqidno.1的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸仍具有种子特异性双向启动子的功能或活性；优选的，与seqidno.1的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸仍具有种子特异性双向启动子的功能或活性；更优选的，与seqidno.1的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸仍具有种子特异性双向启动子的功能或活性。
本发明进一步提供了另一种子特异性双向启动子，其多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示:
(a)、seqidno.2所示的多核苷酸序列；或
(b)、与seqidno.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有种子特异性双向启动子的功能或活性；或
(c)、与seqidno.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸仍具有种子特异性双向启动子的功能或活性；优选的，与seqidno.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸仍具有种子特异性双向启动子的功能或活性；更优选的，与seqidno.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸仍具有种子特异性双向启动子的功能或活性。
本领域普通技术人员可以很容易的采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的seqidno.1或seqidno.2所示的种子特异性双向启动子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子的核苷酸序列具有80％或者更高同源性的核苷酸，只要仍保持了种子特异性双向启动子功能或活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
将本发明序列表中的seqidno.1或seqidno.2种子特异性双向启动子与其它的基因相嵌合或连接得到的嵌合基因或表达盒均属于本发明的保护范畴。
含有本发明的种子特异性双向启动子或上述的嵌合基因或表达盒的重组表达载体同样也属于本发明的保护范围之内。
所述的重组植物表达载体中还可含有选择标记基因。
另外，可以将本发明的种子特异性双向启动子与选择标记序列可操作的连接以确定选择标记序列的活性，所述的选择标记序列通常包括提供抗生素抗性或除草剂抗性的基因，诸如：四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等。
可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植物的细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等；所述的目标植物包括单子叶植物、双子叶植物；优选的，所述的目标植物为禾本科植物，例如，可以是玉米、水稻、大麦、小麦、高粱等农作物，最优选为玉米。
因此，可以将本发明所提供的种子特异性双向启动子应用于提高作物种子的产量或品质(譬如：增加种子的微量元素含量、提高种子中蛋白质含量或提高种子中糖的含量等)；改良植物性状，例如，提高作物对于环境胁迫抗性，例如对于病虫害的抗性；或者是培育植物新品种等方面。
可以将本发明的双向启动子或启动子缺失片段可操作的与待转化的两个异源性dna序列相连接，可以指导或调控两个的异源基因在植物中进行双向表达，不仅有效避免基因沉默现象，而且能够得到具有多个预期性状的转基因植物或植物新品种；待转化的异源性dna序列不受限制，可以是调节基因、调节基因的反义基因或者能干扰内源基因表达的小rna等；所述的待转录的异源dna序列可以是来自非靶基因物种的核酸分子或基因，或者是起源于或存在于相同的物种中经过人工改造或修饰的核酸分子或基因。
通常来说，待转化的异源性dna序列多为提高作物种子品质、提高作物种子对病虫害抗性的有关基因，例如，提高种子产量或品质的相关基因(例如表达或调控种子中微量元素、蛋白质含量的有关基因)，改善植物生理、生长和发育的相关基因，这些基因或者为植物体提供有益的性状，或者是提高或改善作物种子品质、促进种子胚或胚乳发育或者是提高作物种子对病虫害抗性等。
所述待转化的异源性dna序列可以包括具有rna活性的序列或产生多肽产物的序列等，例如，可以是反义序列、rnai序列、核酶序列、剪接体、氨基酸编码序列以及它们的片段。
在一个具体的实施例中，本发明公开了一种在玉米中实现产物的种子特异性表达的方法，该方法包括将所述的种子特异特异性启动子与待转化的异源性dna序列可操作的连接后获得的载体导入玉米植物的基因组；该方法进一步包括培育所述植物直至种子生成；所述的待转化的异源性dna序列涉及增加或调控玉米种子的产量、提高玉米种子的品质或增加玉米种子对于病虫害的抗性等。
通过本发明所述方法获得的那些转化植物细胞和植物还可以用于本领域熟知的育种程序中，例如杂交、自交和回交。育种程序可以涉及杂交以产生f1代(第一子代)，随后是几个自交世代(产生f2、f3等)。该育种程序也可以涉及回交(bc)步骤，因而该后代与亲本系之一(称作回归亲本)回交。
通过本发明所披露的方法获得的转基因植物细胞和植物也可以进一步用于后续的转化程序中，例如用来引入其它的嵌合基因。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85％或更高，更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。
术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(tijssen,techniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicprobes,"overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度ph下的热熔点(tm)约5-10℃。tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、ph和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在ph7.0到8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子浓度，通常为约0.01到1.0m钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×ssc和1％sds，在42℃下培养；或5×ssc，1％sds，在65℃下培养，在0.2×ssc中洗涤和在65℃下于0.1％sds中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(batzer等人,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和cassol等人,(1992)；rossolini等人,molcell.probes8:91-98(1994))。
术语“启动子”指下述的任何核酸序列(如dna序列)：这种序列在转录起始期间被dna依赖性rna聚合酶识别并(直接或间接)结合，导致生成与转录的dna互补的rna分子；这种区域也可以称作“5'调节区”。启动子通常位于在待转录的编码序列前方存在的5'非翻译区(utr)的上游并且具有多个区域，这些区域充当rna聚合酶ii和其他蛋白质如转录因子的结合位点以引发可操作地连接的基因的转录。启动子本身可以含有调节可操作地连接的基因的转录的子元件(即启动子基序)如顺式元件或增强子结构域。该启动子和连接的5'utr也称作“启动子区”。
术语“双向启动子”是指位于一对“头对头”基因转录起始位点之间的具有驱动各自內源基因表达的长度一般小于1.0kb的dna序列。
术语“种子特异性启动子”意指受启动子控制的核酸序列转录在种子细胞中比在任何其它植物组织的细胞中高至少5倍、高至少10倍、高至少20倍或高至少50倍。
术语“异源”指衍生自不同来源的两个或更多个核酸序列或蛋白质序列之间的关系。例如，启动子相对于可操作地连接的核酸序列(如编码序列)是异源，如果这种组合正常情况下不存在于自然界中。此外，特定序列可以相对于插入该序列的细胞或生物是“异源”的(即不天然存在于这种特定细胞或生物中)。例如，本文所披露的嵌合基因是异源核酸。
术语“内源基因”来自宿主本身的基因，包括dna或rna序列。
术语“可操作地连接”指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区可以相对于编码感兴趣表达产物的核酸序列如此安置，从而所述核酸序列的转录由该启动子区指导。因此，启动子区“与该核酸序列可操作地连接”。
术语“调节元件”在此指的是在控制核苷酸序列的表达中所包含的核苷酸序列。调节元件可以包括与相关核苷酸序列可操纵地连接的启动子以及终止信号。调节序列也包括增强子和沉默子。它们通常也包括正确翻译核苷酸序列所需的序列。
术语“转化”在此指的是用于将异源dna引入到植物细胞、植物组织、或植物中的过程。转化植物细胞、植物组织、或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，也包括其子代。
术语“转化”、“转基因”、和“重组体”在此指的是其中已经被引入异源核酸分子的宿主细胞或生物体例如细菌或植物细胞(例如植物)。核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者核酸分子也可以以染色体外分子的形式存在。这样一种染色体外分子可以是自我复制的。转化细胞、组织或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，还包括其转基因子代。“未转化”、“未转基因”、或“未重组的”宿主指的是野生型生物体例如细菌或植物，它不包含异源核酸分子。
附图说明
图1zmbds1、zmbds2的改造示意图。
图2将种子特异性顺式作用元件插入到zmbd1启动子序列后得到的pr5sgpa(zmbds1)启动子序列；黑色的斜体字体部分是在原启动子的基础上插入的序列。
图3将种子特异性顺式作用元件插入到zmbd1启动子序列后得到的p2r5sgpa(zmbds2)启动子序列；黑色的斜体字体部分是在原启动子的基础上插入的序列。
图4将种子特异性顺式作用元件插入到zmbd1启动子序列后得到的prsga启动子序列；黑色的斜体字体部分是在原启动子的基础上插入的序列。
图5将种子特异性顺式作用元件插入到zmbd1启动子序列得到的p2rsga启动子序列；黑色的斜体字体部分是在原启动子的基础上插入的序列。
图6将种子特异性顺式作用元件插入到zmbd1启动子序列后得到的prspa启动子序列；黑色的斜体字体部分是在原启动子的基础上插入的序列。
图7将种子特异性顺式作用元件插入到zmbd1启动子序列得到的p2rspa启动子序列；黑色的斜体字体部分是在原启动子的基础上插入的序列。
图8将种子特异性顺式作用元件插入到zmbd1启动子序列后得到的prsgpa启动子序列；黑色的斜体字体部分是在原启动子的基础上插入的序列。
图9将种子特异性顺式作用元件插入到zmbd1启动子序列后得到的p2rsgpa启动子序列；黑色的斜体字体部分是在原启动子的基础上插入的序列。
图10克隆载体puc57的示意图。
图11中间载体pmedgg3的示意图。
图12表达载体pbd-r5sgpa的示意图。
图13表达载体pbd-2r5sgpa的示意图。
图14改造后的双向启动子pr5sgpa、p2r5sgpa、prsga、p2rsga、prspa、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa的瞬时表达结果；胚和胚乳的发育时间为20天。
图15改造后的双向启动子pr5sgpa、p2r5sgpa驱动报告基因在玉米种子的瞬时表达结果。
图16改造后的双向启动子pr5sgpa、p2r5sgpa、prsga、p2rsga、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa驱动报告基因在玉米种子中的稳定表达结果；a-d分别代表双向启动子pr5sgpa、p2r5sgpa、prsga、p2rsga、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa、zmbd1同时驱动gus和gfp两个报告基因在授粉后15天、20天、25天和30天的玉米籽粒中的表达情况。
图17zmbds1在不同发育时期转基因玉米种子中的表达结果。
图18zmbds2在不同发育时期转基因玉米种子中的表达结果。
图19zmbds1，zmbds2在大喇叭口时期转基因玉米营养组织中的表达结果。
图20改造前的zmbd1双向启动子及改造后的双向启动子pr5sgpa、p2r5sgpa、prsga、p2rsga、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa在不同发育时期转基因玉米种子中表达的定量结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1玉米双向启动子的序列改造及人工合成
根据生物信息学分析的结果，将一些种子特异性顺式作用元件按一定顺序插入到中国发明专利公开号为cn104651359a的序列表中的seqidno.1所示的玉米来源的胚特异性双向启动子zmbd1序列中，改造后的启动子序列命名为pr5sgpa(zmbds1)(seqidno.1)、p2r5sgpa(zmbds2)(seqidno.2)、prsga(seqidno.3)、p2rsga(seqidno.4)、prspa(seqidno.5)、p2rspa(seqidno.6)、prsgpa(seqidno.7)、p2rsgpa(seqidno.8)；其中，图1为zmbds1、zmbds2改造的示意图；图2-9为8个改造后的启动子序列，其中黑色的斜体字体部分是在原启动子的基础上插入的碱基序列，方框表示种子特异性顺式作用元件的位置；将上述改造后的人工序列进行人工合成，进行人工合成时都在两端分别加上xbai和ncoi两个酶切位点。
实验例1改造后玉米双向启动子的瞬时表达载体的构建及功能验证实验
一、重组表达载体的构建
1、将实施例1中人工合成的改造后的启动子序列插入到puc57克隆载体(图10)上。
2、植物表达载体的构建
用xbaⅰ/ncoⅰ将测序正确的克隆载体上的zmbds1、zmbds2、prsga、p2rsga、prspa、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa分别整合到中间载体pmedgg3(图11)构建得到瞬时植物表达载体pr5sgpa、p2r5sgpa、prggpa、p2rggpa、prpgpa、p2rpgpa、prsgpa、p2rsgpa。其中，图12和图13分别为pr5sgpa和p2r5sgpa的示意图。
3、瞬时表达体系验证改造后的双向启动子的功能
(1)、基因枪(bio-rad公司)介导的转化
选取授粉后20天(20dap)玉米幼穗，在超净工作台用终浓度为5％的次氯酸钠消毒灭菌30分钟，而后用无菌水清洗3次。用无菌的剥胚工具剥取幼胚置于液体ms培养基(培养基配方详见论文cropscience,1975年，第15卷，页码：417-421)，而后用液体ms培养基清洗2次转移到固体高渗培养基(9个幼胚/皿)(培养基配方详见论文molecularbreeding，2001年，第8卷，页码:323–333)28℃黑暗条件下培养6小时。在压力为1100psi的条件下，将构建的瞬时表达载体进行基因枪转化，每皿轰击一次(使用方法详见论文plantcell,tissueandorganculture，1993年，第33卷，页码221-226)。轰击后的幼胚转移到恢复培养基(培养基配方详见论文molecularbreeding，2001年，第8卷，页码:323–333)上28℃黑暗条件下培养24小时。
(2)、转化的幼胚中gfp和gus的表达分析
基因枪转化恢复培养24小时后，用荧光显微镜(zeiss公司)在5物×镜下观察幼胚在紫外光谱下的绿色荧光并通过ccd成像(见图14)。gfp表达分析完成后的幼胚立刻进行gus染色(染色方法参见theembojournal，1987年，第6卷，页码：3901-3907)，分析结果如图14和图15，从瞬时表达的结果可见，瞬时表达系统幼胚中的gfp和gus基因得到表达。
实验例2改造后的双向启动子的稳定表达载体的构建及功能与组织特异性验证实验
一、将pr5sgpa、p2r5sgpa、prsga、p2rsga、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa、zmbd1(cn104651359a的序列表中seqidno.1所示的胚特异性启动子)的两端分别接上gus和gfp两个报告基因，其构建方法包括：将人工合成的改造后的启动子序列插入到puc57克隆载体上，用xbaⅰ/ncoⅰ将pr5sgpa、p2r5sgpa、prsga、p2rsga、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa、zmbd1从克隆载体上切下来与同样酶切的载体pmed-gg3链接得到稳定双向植物表达载体；将这8个双向稳定表达载体转化分别以农杆菌介导的方法转化了玉米材料hiⅱ，得到了稳定转化的玉米植株，玉米稳定转化流程如下：
(1)、取授粉后10天的hiⅱ幼穗，首先用无菌水配制5％的次氯酸钠溶液对幼穗进行浸泡灭菌15min,而后用无菌水浸泡清洗三次。
(2)、在无菌条件下，剥取长度在1.5mm-2.0mm左右的幼胚置于加有乙酰丁香酮的液体侵染培养基(培养基配方详见论文molecularbreeding，2001年，第8卷，页码:323–333)中。
(3)、将事先在具有相应抗性的yeb固体培养基上在28℃培养4天的含有目的表达载体的重组克隆菌体刮取适量重悬在加有乙酰丁香酮的液体侵染培养基中，28℃恒温摇床低速恢复培养至od260到0.4-0.6。
(4)、用液体侵染培养基清洗剥好的幼胚两次，吸弃清洗液，加入od260＝0.4-0.6的菌体颠倒混匀20次，置于黑暗条件下静置5min。
(5)、吸弃菌液，并用液体侵染培养基清洗浸染的幼胚两次，连带第二次清洗液和幼胚一起倾倒在无筛选压的固体共培养基(培养基配方详见论文molecularbreeding，2001年，第8卷，页码:323–333)上，将幼胚均匀分布在培养基上，并将幼胚的平滑面紧贴培养，弧形面朝上。
(6)、吸弃清洗液，将培养物置于25℃恒温箱黑暗条件下培养3天。将共培养3天后的幼胚在无菌条件下转移到无筛选压的固体恢复培养基上，28℃黑暗条件下培养7-10天。
(7)、将恢复培养长势良好且无菌的幼胚衍生物转移到具有basta筛选压的筛选培养基上筛选28℃黑暗条件下培养1-2个月，每2周继代一次。
(8)、待有生长速度显著高于一般愈伤组织的抗性愈伤出现后，将其繁殖到一定后，将一定量的抗性愈伤转移到具有多种激素的分化培养基(培养基配方详见论文molecularbreeding，2001年，第8卷，页码:323–333)上28℃黑暗条件下培养2周左右，诱导形成胚状体。
(9)、将胚状体转移到固体生根培养基中，28℃光照条件下培养1周左右。生根成苗，将小苗转移到盛有固体生根培养基的圆柱状培养管中，28℃光照条件下培养1周左右。
(10)、再将展开2-3片幼叶的试管苗转移到有营养土的营养钵中在光照培养箱培养1周左右后即可转移到温室进一步培养并最终移栽到大棚。
图16a-d分别代表双向启动子pr5sgpa、p2r5sgpa、prsga、p2rsga、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa、zmbd1同时驱动gus和gfp两个报告基因在授粉后15、20、25和30天的籽粒中的表达情况。
图16a-d的每个小图中左部分为非转基因的材料(即对照)，右半部分为转基因的材料。图16a-d的每一横排的3个图片均为同一个实验材料在不同处理不同拍照条件下获得的照片，3个图片依次为完整的籽粒在自然光条件下、籽粒纵切片在紫外线照射加gfp滤光片条件下和籽粒纵切片经gus染色后在自然光条件下拍摄的照片。
从图16a-d可以看出，当改造后的双向启动子pr5sgpa、p2r5sgpa、prsga、p2rsga、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa两端同时各融合一个报告基因gus和gfp时，它仍能同时启动这两个报告基因在转基因玉米授粉后不同时期的籽粒中进行表达，但是，prsga、p2rsga、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa和zmbd1驱动的报告基因仅能在种子的胚中进行特异性表达，pr5sgpa以及p2r5sgpa驱动的报告基因能够同时在种子的胚和胚乳中进行特异性表达。
图17是pr5sgpa(zmbds1)在不同发育时期转基因玉米种子中的表达结果。
图18是p2r5sgpa(zmbds2)在不同发育时期转基因玉米种子中的表达结果。
图19是zmbds1，zmbds2在大喇叭口时期转基因玉米营养组织中的表达结果。
图20是改造后的双向启动子pr5sgpa、p2r5sgpa、prsga、p2rsga、p2rspa、prsgpa、p2rsgpa在不同发育时期转基因玉米种子中表达的定量结果。
上述实验结果证明改造后的pr5sgpa以及p2r5sgpa是一个种子特异性双向启动子，能够驱动报告基因在玉米种子的胚和胚乳中同时进行稳定表达。
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<110>中国农业科学院生物技术研究所
<120>种子特异性双向启动子及其应用
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