本发明涉及基因工程
技术领域：
，尤其涉及一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术：
：手性亚砜广泛存在于自然界中，是很多重要生物活性分子的结构单元，是合成天然产物和手性药物的重要中间体。许多手性亚砜都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的，甚至是有毒的。因此，如何高效立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。baeyervilliger单加氧酶(bvmos)属于黄素类单加氧酶，通常用来立体选择性氧化链状和环状的酮，生成相应的酯或内酯，也能催化硫、氮和磷的亲电氧化反应，同时bvmos还能催化酮和硼的亲核氧化反应。环己酮单加氧酶(chmos)是第一个被发现的bvmo家族成员。cn105695425a公开了chmos在手性药物的合成方面具有很大的应用，可以催化含硫手性前体的氧化，被用于手性药物莫达非尼和奥美拉唑的合成中，但现有的chmos酶活性低，稳定性差，可溶表达不好，选择性不高，酶添加量大，后处理困难。来源于单胞菌brachymonaspetroleovorans的单加氧酶chmo可以较高选择性的催化硫醚类化合物的转化，但是其活性较低，稳定性较差，在大肠杆菌中可溶表达不好，反应时添加的酶量较多。cn107384880a公开了一种黄素单加氧酶突变体及其制备方法，该方法使用易错pcr技术，对野生型黄素单加氧酶进行随机突变，得到黄素单加氧酶突变体，比酶活较野生型黄素单加氧酶的比酶活提高了35％。但其仅仅是提高了比酶活，对单加氧酶的稳定性、可溶性表达、选择性和酶的使用量并没有起到作用。尽管有几种chmos得到了商业化应用，但chmos普遍存在着可溶性表达不好，酶活性低，酶稳定性低，选择性不高等问题。一般而言，可以通过定向进化的手段对野生酶进行改造，提高酶的各种性质，从而可以应用在生产中。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用，所述单加氧酶突变体，提高了其转化效率，稳定性，有利于其在制药领域中的应用。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种单加氧酶突变体，其具有(i)、(ii)所示的氨基酸序列中任意一个：(i)与seqidno.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；(ii)与seqidno.1所示的氨基酸序列的23至508位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1-34个氨基酸；其中，所述突变体具有单加氧酶的活性。本发明中，发明人通过设计23至508位氨基酸的多个不同位点的突变，从而对单加氧酶的性质进行考察，发现这些位点的突变会提高单加氧酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低酶的使用量。本发明中，所述seqidno.1所示的氨基酸序列如下：mssspssaihfdaivvgagfggmymlhklrdqlglkvkvfdtaggiggtwywnrypgalsdthshvyqysfdeamlqewtwknkyltqpeilayleyvadrldlrpdiqlnttvtsmhfnevhniwevrtdrggyytarfivtalgllsainwpnipgresfqgemyhtaawpkdvelrgkrvgvigtgstgvqlitaiapevkhltvfqrtpqysvptgnrpvsaqeiaevkrnfskvwqqvresavafgfeestvpamsvseaerqrvfqeawnqgngfyymfgtfcdiatdpqaneaaatfirnkiaeivkdpetarkltptdvyarrplcdsgyyrtynrsnvslvdvkatpisamtprgirtadgveheldmlilatgydavdgnyrridlrgrggqtinehwndtptsyvgvstanfpnmfmilgpngpftnlppsieaqvewitdlvahmrqhglataeptrdaedawgrtcaeiaeqtlfgqveswifganspgkkhtlmfylaglgnyrkqladvanaqyqgfafqpl.在本发明的另一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。在本发明的一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。在本发明的一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。在本发明的一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。本发明中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化中的任意一种或至少两种的组合。所述取代例如可以是取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个或34个。本发明中，所述单加氧酶突变体能够催化硫醚类化合物进行转化，所述硫醚类化合物为其中，r1和r2各自独立地为c1～c8烷基、c5～c10环烷基、c5～c10芳基或c5～c10杂芳基，或者r1和r2与羰基上的碳共同形成c5～c10杂环基、c5～c10碳环基或c5～c10杂芳基，所述c5～c10杂环基和c5～c10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述c5～c10芳基中的芳基、c5～c10杂芳基中的杂芳基、c5～c10碳环基中的碳环基或c5～c10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，所述硫醚类类化合物如式i所示；具体反应式如下：根据本发明，所述取代为第23位、第25位、第47位、第75位、第93位、第106位、第110位、第117位、第137位、第153位、第159位、第166位、第260位、第265位、第284位、第289位、第334位、第359位、第360位、第377位、第380位、第426位、第428位、第435位、第436位、第437位、第439位、第457位、第474位、第479位、第490位、第495位、第500位或第508位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。根据本发明，所述突变体的突变位点为m23l、m25a、a74d、m75l、a93e、p106r、l110f、m117a、t137r、w153f、r159l、m166l、m260l、a265e、m284i、c289s、c334l、a359e、m360i、m377v、l380f、m426l、m428f、p435l、p435a、f436l、f436y、f436a、t437s、t437a、t437y、l439g、l439a、l439s、m457l、a474e、c479v、q490k、i495f、i495v、i495a、s500i或m508l中的任意一个或至少两个的组合。本发明中，通过进一步实验验证，发明人发现这43个位点的突变，能够进一步提高单加氧酶的性质，其中，第25位、第106位、第159位、第265位、第289位、第377位、第380位、第435位、第436位、第437位、第439位、第474位、第479位、第490位、第495位或第500位的突变会明显提高单加氧酶的催化活性、转化率和对异丙醇的耐受性，其他位点的突变，能够明显提高单加氧酶的可溶性表达和选择性。根据本发明，所述取代为第25位、第106位、第159位、第265位、第289位、第377位、第380位、第435位、第436位、第437位、第439位、第474位、第479位、第490位、第495位或第500位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。根据本发明，所述突变体的突变位点为m25a、p106r、r159l、a265e、c289s、m377v、l380f、p435l、f436y、t437a、l439s、a474e、c479v、q490k、i495a或s500i中的任意一个或至少两个的组合。根据本发明，所述突变体的突变位点为m25a、p106r、r159l、a265e、c289s、m377v、l380f、p435l、f436y、t437a、l439s、a474e、c479v、q490k、i495a或s500i中的任意一个或至少两个的组合时，所述突变体单加氧酶转化率为40％以上。根据本发明，所述取代为第25位、第106位、第265位、第474位、第490位或第500位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。根据本发明，所述突变体的突变位点为m25a、p106r、a265e、a474e、q490k或s500i中的任意一个或至少两个的组合。根据本发明，所述突变体的突变位点为m25a、p106r、a265e、a474e、q490k或s500i中的任意一个或至少两个的组合时，所述突变体单加氧酶转化率为48％以上。本发明中，发明人通过进一步的考察，发现，s500i-a265e-m25a、s500i-a265e-m25a-q490k、s500i-a265e-m25a-a474e-p106r、s500i-a265e-m25a-q490k-p106r和s500i-a265e-m25a-a474e-q490k这五个突变体的收率最高，能达到86％以上，酶在异丙醇中的残余活力能达到60％以上，转化率能达到90％以上。第二方面，本发明提供编码如第一方面所述的单加氧酶突变体的核苷酸序列。第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的核苷酸序列。第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的表达载体。第五方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的突变体的方法，包括：(1)制备重组宿主细胞，其中所述细胞包含dna分子，所述dna分子包含编码根据第一方面所述突变体的核酸序列；(2)在适合表达所述突变体的培养基中孵育所述宿主细胞；(3)从所述培养基中回收步骤(2)中由所述宿主细胞表达的所述突变体的多肽。第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的突变体的多肽。根据本发明，所述组合物为干粉、片剂或液体中的任意一种或至少两种的组合。第七方面，本发明提供一种如第一方面所述的突变体在制备手性药物中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明中通过设计23至508位氨基酸的多个不同位点的突变，发现这些突变体提高了单加氧酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低单加氧酶的使用量；(2)本发明通过验证发现在原单加氧酶的基础上通过这12个位点的单独突变，即m25a、p106r、r159l、a265e、c289s、m377v、l380f、a474e、c479v、q490k、i495a和s500i，能够提高单加氧酶的活性，通过将这12个位点的突变进行组合，得到的突变体s500i-a265e-m25a突变体、s500i-a265e-m25a-q490k突变体、s500i-a265e-m25a-a474e-p106r突变体、s500i-a265e-m25a-q490k-p106r突变体和s500i-a265e-m25a-a474e-q490k突变体这五个突变体的收率最高，能达到86％以上，酶在异丙醇中的残余活力能达到60％以上，转化率能达到90％以上。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1单点突变(m25a)的单加氧酶突变体单加氧酶突变体基因的构建：为了提高来源于单胞菌brachymonaspetroleovorans的单加氧酶chmo(其氨基酸序列为seqidno.1，其编码核苷酸序列为seqidno.2)的活性、稳定性、可溶表达，选择性，降低酶的使用量，对m25a位点分别进行突变，具体步骤如下：所述seqidno.2所示的核苷酸序列如下：atgagtagcagcccgagcagcgccatccactttgacgccattgtggtgggtgccggttttggcggcatgtatatgctgcacaagctgcgcgaccagctgggcctgaaagttaaagtgttcgacaccgccggtggtattggtggtacctggtactggaaccgctatccgggtgccctgagcgacacccatagccacgtgtaccagtacagcttcgatgaggccatgctgcaggagtggacatggaaaaataaatatctgacccagccggaaatcctggcatatctggaatacgtggccgatcgtctggatttacgccctgacattcagctgaacaccaccgttaccagcatgcattttaacgaggtgcacaatatctgggaagttcgcaccgatcgtggcggctactatacagcacgcttcattgtgaccgcactgggtctgttaagtgccatcaactggccgaacatcccgggccgtgagtcttttcaaggcgaaatgtatcataccgccgcctggccgaaagatgttgaactgcgcggcaagcgcgtgggtgtgatcggtacaggtagcaccggtgtgcagctgatcaccgccattgcaccggaggtgaagcacctgaccgtttttcagcgtaccccgcagtatagcgttccgacaggcaatcgcccggttagcgcccaggaaatcgcagaagtgaaacgcaactttagcaaagtgtggcagcaggtgcgtgagagtgccgttgcctttggctttgaggaaagcaccgtgccggcaatgagcgttagcgaggcagaacgccagcgtgttttccaggaagcatggaatcagggcaacggcttttactatatgtttggcaccttttgcgatatcgccacagatccgcaggccaacgaggcagccgccaccttcattcgtaataagatcgccgaaatcgttaaagatccggagacagcccgcaaactgacaccgacagacgtttatgcccgtcgtccgctgtgcgatagcggctactatcgcacctacaatcgtagcaacgtgagcctggtggatgtgaaggccaccccgatcagtgcaatgaccccgcgcggcattcgtaccgcagatggcgtggagcatgaactggacatgctgattctggcaaccggctacgacgccgttgatggcaactatcgccgtattgatctgcgtggccgcggtggccagaccattaacgaacactggaatgacacccctaccagctatgttggcgtgagcaccgccaattttccgaacatgttcatgattctgggccctaacggcccgttcaccaatctgccgccgagtatcgaagcccaggtggaatggattaccgatctggtggcacacatgcgtcagcacggtctggcaaccgccgaacctacccgcgatgccgaagatgcctggggtcgtacctgtgcagagattgccgagcagaccctgttcggccaggtggaaagctggatctttggcgcaaacagcccgggtaagaagcataccctgatgttttatctggccggcctgggcaattaccgcaaacagctggccgatgtggcaaatgcccagtatcagggctttgccttccagcctctgtaa；(1)引入突变：根据seqidno.2所示的核苷酸设计引物，设计包含有m25a位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.3)：gccggttttggcggcatgtatgcgctgcacaagc；下游引物(seqidno.4)：gcttgtgcagcgcatacatgccgccaaaaccggc；将引物和模板质粒混合后，加入高保真taq聚合酶kod-plus，进行全质粒pcr扩增，pcr结束后电泳检测pcr产物，所述pcr扩增体系如下：所述pcr反应的扩增条件如下：(2)转化：加入dpni酶，消化模板，转入大肠杆菌感受态bl21(de3)中，37℃过夜培养，挑取单克隆到试管；(3)诱导表达：由试管接种到1.5l摇瓶，37℃培养至od600至1时，降低培养温度至25℃，加入终浓度为0.1mmiptg诱导表达16h；(4)反应验证：10ml的反应瓶中加入底物(3-氯苄基)二甲基硫醚40mg，加入0.1m的tris-hcl9.0，20mg异丙醇，0.4mg的nadp+，4mg醇脱氢酶，加入4mg单加氧酶chmo(0.1wt)，混匀，总体积为1ml，于50℃、200转摇床，反应16小时。实施例2单点突变(p106r)的单加氧酶突变体对p106r进行定点突变，具体步骤如下：引入突变：设计包含有p106r位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.5)：cgtctggatttacgccgtgacattcagctgaac；下游引物(seqidno.6)：gttcagctgaatgtcacggcgtaaatccagacg；其他方法和步骤同实施例1。实施例3单点突变(r159l)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有r159l位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.7)：cgaacatcccgggccttgagtcttttcaagg；下游引物(seqidno.8)：ccttgaaaagactcaaggcccgggatgttcg；其他方法和步骤同实施例1。实施例4单点突变(a265e)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有a265e位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.9)：gagcgttagcgaggaagaacgccagcgtg；下游引物(seqidno.10)：cacgctggcgttcttcctcgctaacgctc；其他方法和步骤同实施例1。实施例5单点突变(c289s)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有c289s位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.11)：tttactatatgtttggcacctttagcgatatcgccacag；下游引物(seqidno.12)：ctgtggcgatatcgctaaaggtgccaaacatatagtaaa；其他方法和步骤同实施例1。实施例6单点突变(m377v)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有m377v位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.13)：ggagcatgaactggacgtgctgattctggcaac；下游引物(seqidno.14)：gttgccagaatcagcacgtccagttcatgctcc；其他方法和步骤同实施例1。实施例7单点突变(l380f)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有l380f位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.15)：agcatgaactggacatgctgattttcgcaaccggctac；下游引物(seqidno.16)：gtagccggttgcgaaaatcagcatgtccagttcatgct；其他方法和步骤同实施例1。实施例8单点突变(p435l)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有p435l位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.17)：gggccctaacggcctgttcaccaatctgc；下游引物(seqidno.18)：gcagattggtgaacaggccgttagggccc；其他方法和步骤同实施例1。实施例9单点突变(f436y)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有f436y位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.19)：gggccctaacggcccgtataccaatctgccg；下游引物(seqidno.20)：cggcagattggtatacgggccgttagggccc；其他方法和步骤同实施例1。实施例10单点突变(t437a)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有t437a位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.21)：taacggcccgttcgccaatctgccgcc；下游引物(seqidno.22)：ggcggcagattggcgaacgggccgtta；其他方法和步骤同实施例1。实施例11单点突变(l439s)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有l439s位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.23)：cctaacggcccgttcaccaattcgccgccgagta；下游引物(seqidno.24)：tactcggcggcgaattggtgaacgggccgttagg；其他方法和步骤同实施例1。实施例12单点突变(a474e)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有a474e位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.25)：gcgatgccgaagatgagtggggtcgtacctg；下游引物(seqidno.26)：caggtacgaccccactcatcttcggcatcgc；其他方法和步骤同实施例1。实施例13单点突变(c479v)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有c479v位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.27)：gcctggggtcgtaccgttgcagagattgccga；下游引物(seqidno.28)：tcggcaatctctgcaacggtacgaccccaggc；其他方法和步骤同实施例1。实施例14单点突变(q490k)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有q490k位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.29)：agaccctgttcggcaaggtggaaagctgg；下游引物(seqidno.30)：ccagctttccaccttgccgaacagggtct；其他方法和步骤同实施例1。实施例15单点突变(i495a)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有i495a位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.31)：ccaggtggaaagctgggcctttggcgcaaacagc；下游引物(seqidno.32)：gctgtttgcgccaaaggcccagctttccacctgg；其他方法和步骤同实施例1。实施例16单点突变(s500i)的单加氧酶突变体引入突变：设计包含有s500i位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：上游引物(seqidno.33)：gctggatctttggcgcaaacatcccgggtaaga；下游引物(seqidno.34)：tcttacccgggatgtttgcgccaaagatccagc；其他方法和步骤同实施例1。转化率检测反应样品体系加入3ml乙腈，混匀后置于5ml的ep管中，12000转离心3分钟，取100μl上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μl，hplc检测，检测波长210nm，结果如表1所示。稳定性检测取两份单加氧酶seqidno：1质量都为4mg，其中一份加入终浓度为10％的异丙醇在30℃放置1h，另一份不加异丙醇在30℃放置1h，然后按照如下体系进行反应：10ml的反应瓶中加入底物(3-氯苄基)二甲基硫醚40mg，加入0.1m的tris-hcl9.0，20mg异丙醇，0.4mg的nadp+，4mg醇脱氢酶，加入4mg单加氧酶chmo，混匀，总体积为1ml，于50℃、200转摇床，反应16小时。反应样品体系加入3ml乙腈，混匀后置于5ml的ep管中，12000转离心3分钟。取100μl上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μl，hplc检测，检测波长210nm。突变体稳定性表示为异丙醇中保温的单加氧酶转化率占不加异丙醇保温的单加氧酶转化率的百分比，结果如表1所示。表1从表1可以看出，单点突变体的转化效果较母本有所提高，但并未达到理想的效果，单点突变体中实施例4(a265e)、实施例8(a474e)、实施例10(a490k)的在异丙醇中的残余活力提高到60％以上，一般而言，单点突变的突变体性能较母本很难有较大差异，突变点的组合可以获得更优的突变体。实施例17单点突变的单加氧酶突变体引入突变：设计分别包含有其他23个位点(m23l、a74d、m75l、a93e、l110f、m117a、t137r、w153f、m166l、m260l、m284i、c334l、a359e、m360i、m426l、m428f、p435a、f436l、f436a、t437s、t437y、l439g、l439a、m457l、i495f、i495v或m508l)的正、反向引物，具体引物如下表2所示：表2其他方法和步骤同实施例1。活性验证将培养后的菌株采用超声破碎，检测上清和沉淀中蛋白的表达量，结果如表3所示：表3从表3可以看出，虽然这些位点并没有提高单加氧酶转化率，但是能够提高单加氧酶的可溶性表达，尤其是a74d、m153f显著提高了上清的表达量。实施例18多点突变的单加氧酶突变体通过dnashuffling的方法将突变位点进行随机重组，建立突变文库，然后进行筛选，制备得到多点突变的单加氧酶突变体，具体步骤如下：(1)pcr获得带有m25a、p106r、a265e、m377v、a474e、c479v、q490k、i495a和s500i突变位点的同源基因，将pcr产物进行纯化后，按照等摩尔量将这些基因进行混合，然后用核酸酶i消化成随机片段，由这些随机片段组成文库，互为引物和模板进行pcr扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，发生模板互换和基因重组，所述n-pcr的反应体系如下：所述n-pcr反应的扩增条件如下：(2)转化和筛选：将制备得到的产物，转入大肠杆菌中，培养；(3)酶液制备：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200μl酶解溶液(溶菌酶2mg/ml，多黏菌素0.5mg/ml，ph＝7.0)，37℃保温破碎3h；(4)高通量筛选：250μl测活体系：底物(3-氯苄基)二甲基硫醚终浓度2mm，nadph终浓度0.3mm，破碎酶液加入量100μl，ph＝9.0，温度30℃，筛选得到的突变体进行摇瓶培养，再进行放大反应；(5)诱导表达：25℃，0.1mmiptg诱导过夜；(6)反应验证：10ml的反应瓶中加入底物40mg，加入0.1m的tris-hcl9.0，20mg异丙醇，0.4mg的nadp+，4mg醇脱氢酶，加入4mg单加氧酶chmo(0.1wt)，混匀，总体积为1ml，于50℃、200转摇床，反应16小时。转化率检测反应样品体系加入3ml乙腈，混匀后置于5ml的ep管中，12000转离心3分钟，取100μl上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μl，hplc检测，检测波长210nm，结果如表2所示。稳定性检测取两份单加氧酶seqidno：1质量都为4mg，其中一份加入终浓度为10％的异丙醇在30℃放置1h，另一份不加异丙醇在30℃放置1h，然后按照如下体系进行反应：10ml的反应瓶中加入底物40mg，加入0.1m的tris-hcl9.0，20mg异丙醇，0.4mg的nadp+，4mg醇脱氢酶，加入4mg单加氧酶chmo，混匀，总体积为1ml，于50℃、200转摇床，反应16小时。反应样品体系加入3ml乙腈，混匀后置于5ml的ep管中，12000转离心3分钟。取100μl上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μl，hplc检测，检测波长210nm。突变体稳定性表示为异丙醇中保温的单加氧酶转化率占不加异丙醇保温的单加氧酶转化率的百分比，结果如表4所示。表4从表4可以看出，多点突变体相比于单点突变的转化效果大部分进一步的提高，有一小部分虽然转化效果没有提高，但稳定性有提高，可见多点突变会进一步提高单加氧酶的性质，其中，多点突变体中s500i-a265e-m25a突变体、s500i-a265e-m25a-a474e突变体、s500i-a265e-m25a-q490k突变体、s500i-a265e-m25a-a474e-p106r突变体、s500i-a265e-m25a-q490k-p106r突变体和s500i-a265e-m25a-a474e-q490k突变体的转化率能达到90％以上，在异丙醇中的残余活力能达到60％以上，进一步验证这6个突变体的放大反应效果。。实施例19多点突变体的放大反应的验证进一步验证制备得到的s500i-a265e-m25a突变体、s500i-a265e-m25a-a474e突变体、s500i-a265e-m25a-q490k突变体、s500i-a265e-m25a-a474e-p106r突变体、s500i-a265e-m25a-q490k-p106r突变体和s500i-a265e-m25a-a474e-q490k突变体的收率，具体步骤如下：(1)250ml的反应瓶中加入底物(3-氯苄基)二甲基硫醚1g，加入0.1m的tris-hcl9.0，500mg异丙醇，10mg的nadp+，100mg醇脱氢酶，加入100mg单加氧酶chmo，混匀，总体积为25ml，于50℃、200转摇床，反应16小时；(2)从反应样品体系中取样1ml加入3ml乙腈，混匀后置于5ml的ep管中，12000转离心3分钟。取100μl上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μl，hplc检测，检测波长210nm；(3)反应结束后，加入50ml的乙酸乙酯进行萃取3次，合并萃取有机相后加入硫酸镁进行干燥，旋转蒸发至干，称量，结果如表5所示：表5序列突变位点收率(％)e.e.(％)seqidno.3s500i-a265e-m25a86.599seqidno.4s500i-a265e-m25a-a474e89.599seqidno.5s500i-a265e-m25a-q490k90.299seqidno.6s500i-a265e-m25a-a474e-p106r88.999seqidno.7s500i-a265e-m25a-q490k-p106r90.899seqidno.8s500i-a265e-m25a-a474e-q490k89.399从表5可以看出，这6个突变体的收率都可达86％以上，e.e.值都在99％，特别是seqidno.5(s500i-a265e-m25a-q490k)突变体的收率可达90.2％，e.e.值99％，可见多位点突变取得了很好的效果。综上所述，本发明通过验证发现在原单加氧酶的基础上通过这12个位点的单独突变，即m25a、p106r、r159l、a265e、c289s、m377v、l380f、a474e、c479v、q490k、i495a和s500i，能够提高单加氧酶的活性，通过将这12个位点的突变进行组合，得到的突变体s500i-a265e-m25a突变体、s500i-a265e-m25a-q490k突变体、s500i-a265e-m25a-a474e-p106r突变体、s500i-a265e-m25a-q490k-p106r突变体和s500i-a265e-m25a-a474e-q490k突变体这五个突变体的收率最高，能达到86％以上，酶在异丙醇中的残余活力能达到60％以上，转化率能达到90％以上。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。序列表<110>凯莱英医药集团（天津）股份有限公司<120>一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用<130>2017<141>2018-02-07<160>88<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>537<212>prt<213>人工合成序列()<400>1metserserserproserseralailehispheaspalailevalval151015glyalaglypheglyglymettyrmetleuhislysleuargaspgln202530leuglyleulysvallysvalpheaspthralaglyglyileglygly354045thrtrptyrtrpasnargtyrproglyalaleuseraspthrhisser505560hisvaltyrglntyrserpheaspglualametleuglnglutrpthr65707580trplysasnlystyrleuthrglnprogluileleualatyrleuglu859095tyrvalalaaspargleuaspleuargproaspileglnleuasnthr100105110thrvalthrsermethispheasngluvalhisasniletrpgluval115120125argthraspargglyglytyrtyrthralaargpheilevalthrala130135140leuglyleuleuseralaileasntrpproasnileproglyargglu145150155160serpheglnglyglumettyrhisthralaalatrpprolysaspval165170175gluleuargglylysargvalglyvalileglythrglyserthrgly180185190valglnleuilethralailealaprogluvallyshisleuthrval195200205pheglnargthrproglntyrservalprothrglyasnargproval210215220seralaglngluilealagluvallysargasnpheserlysvaltrp225230235240glnglnvalarggluseralavalalapheglypheglugluserthr245250255valproalametservalserglualagluargglnargvalphegln260265270glualatrpasnglnglyasnglyphetyrtyrmetpheglythrphe275280285cysaspilealathraspproglnalaasnglualaalaalathrphe290295300ileargasnlysilealagluilevallysaspprogluthralaarg305310315320lysleuthrprothraspvaltyralaargargproleucysaspser325330335glytyrtyrargthrtyrasnargserasnvalserleuvalaspval340345350lysalathrproileseralametthrproargglyileargthrala355360365aspglyvalgluhisgluleuaspmetleuileleualathrglytyr370375380aspalavalaspglyasntyrargargileaspleuargglyarggly385390395400glyglnthrileasngluhistrpasnaspthrprothrsertyrval405410415glyvalserthralaasnpheproasnmetphemetileleuglypro420425430asnglyprophethrasnleuproproserileglualaglnvalglu435440445trpilethraspleuvalalahismetargglnhisglyleualathr450455460alagluprothrargaspalagluaspalatrpglyargthrcysala465470475480gluilealagluglnthrleupheglyglnvalglusertrpilephe485490495glyalaasnserproglylyslyshisthrleumetphetyrleuala500505510glyleuglyasntyrarglysglnleualaaspvalalaasnalagln515520525tyrglnglyphealapheglnproleu530535<210>2<211>1614<212>dna<213>人工合成序列()<400>2atgagtagcagcccgagcagcgccatccactttgacgccattgtggtgggtgccggtttt60ggcggcatgtatatgctgcacaagctgcgcgaccagctgggcctgaaagttaaagtgttc120gacaccgccggtggtattggtggtacctggtactggaaccgctatccgggtgccctgagc180gacacccatagccacgtgtaccagtacagcttcgatgaggccatgctgcaggagtggaca240tggaaaaataaatatctgacccagccggaaatcctggcatatctggaatacgtggccgat300cgtctggatttacgccctgacattcagctgaacaccaccgttaccagcatgcattttaac360gaggtgcacaatatctgggaagttcgcaccgatcgtggcggctactatacagcacgcttc420attgtgaccgcactgggtctgttaagtgccatcaactggccgaacatcccgggccgtgag480tcttttcaaggcgaaatgtatcataccgccgcctggccgaaagatgttgaactgcgcggc540aagcgcgtgggtgtgatcggtacaggtagcaccggtgtgcagctgatcaccgccattgca600ccggaggtgaagcacctgaccgtttttcagcgtaccccgcagtatagcgttccgacaggc660aatcgcccggttagcgcccaggaaatcgcagaagtgaaacgcaactttagcaaagtgtgg720cagcaggtgcgtgagagtgccgttgcctttggctttgaggaaagcaccgtgccggcaatg780agcgttagcgaggcagaacgccagcgtgttttccaggaagcatggaatcagggcaacggc840ttttactatatgtttggcaccttttgcgatatcgccacagatccgcaggccaacgaggca900gccgccaccttcattcgtaataagatcgccgaaatcgttaaagatccggagacagcccgc960aaactgacaccgacagacgtttatgcccgtcgtccgctgtgcgatagcggctactatcgc1020acctacaatcgtagcaacgtgagcctggtggatgtgaaggccaccccgatcagtgcaatg1080accccgcgcggcattcgtaccgcagatggcgtggagcatgaactggacatgctgattctg1140gcaaccggctacgacgccgttgatggcaactatcgccgtattgatctgcgtggccgcggt1200ggccagaccattaacgaacactggaatgacacccctaccagctatgttggcgtgagcacc1260gccaattttccgaacatgttcatgattctgggccctaacggcccgttcaccaatctgccg1320ccgagtatcgaagcccaggtggaatggattaccgatctggtggcacacatgcgtcagcac1380ggtctggcaaccgccgaacctacccgcgatgccgaagatgcctggggtcgtacctgtgca1440gagattgccgagcagaccctgttcggccaggtggaaagctggatctttggcgcaaacagc1500ccgggtaagaagcataccctgatgttttatctggccggcctgggcaattaccgcaaacag1560ctggccgatgtggcaaatgcccagtatcagggctttgccttccagcctctgtaa1614<210>3<211>34<212>dna<213>人工合成序列()<400>3gccggttttggcggcatgtatgcgctgcacaagc34<210>4<211>34<212>dna<213>人工合成序列()<400>4gcttgtgcagcgcatacatgccgccaaaaccggc34<210>5<211>33<212>dna<213>人工合成序列()<400>5cgtctggatttacgccgtgacattcagctgaac33<210>6<211>33<212>dna<213>人工合成序列()<400>6gttcagctgaatgtcacggcgtaaatccagacg33<210>7<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>7cgaacatcccgggccttgagtcttttcaagg31<210>8<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>8ccttgaaaagactcaaggcccgggatgttcg31<210>9<211>29<212>dna<213>人工合成序列()<400>9gagcgttagcgaggaagaacgccagcgtg29<210>10<211>29<212>dna<213>人工合成序列()<400>10cacgctggcgttcttcctcgctaacgctc29<210>11<211>39<212>dna<213>人工合成序列()<400>11tttactatatgtttggcacctttagcgatatcgccacag39<210>12<211>39<212>dna<213>人工合成序列()<400>12ctgtggcgatatcgctaaaggtgccaaacatatagtaaa39<210>13<211>33<212>dna<213>人工合成序列()<400>13ggagcatgaactggacgtgctgattctggcaac33<210>14<211>33<212>dna<213>人工合成序列()<400>14gttgccagaatcagcacgtccagttcatgctcc33<210>15<211>38<212>dna<213>人工合成序列()<400>15agcatgaactggacatgctgattttcgcaaccggctac38<210>16<211>38<212>dna<213>人工合成序列()<400>16gtagccggttgcgaaaatcagcatgtccagttcatgct38<210>17<211>29<212>dna<213>人工合成序列()<400>17gggccctaacggcctgttcaccaatctgc29<210>18<211>29<212>dna<213>人工合成序列()<400>18gcagattggtgaacaggccgttagggccc29<210>19<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>19gggccctaacggcccgtataccaatctgccg31<210>20<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>20cggcagattggtatacgggccgttagggccc31<210>21<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>21taacggcccgttcgccaatctgccgcc27<210>22<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>22ggcggcagattggcgaacgggccgtta27<210>23<211>34<212>dna<213>人工合成序列()<400>23cctaacggcccgttcaccaattcgccgccgagta34<210>24<211>34<212>dna<213>人工合成序列()<400>24tactcggcggcgaattggtgaacgggccgttagg34<210>25<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>25gcgatgccgaagatgagtggggtcgtacctg31<210>26<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>26caggtacgaccccactcatcttcggcatcgc31<210>27<211>32<212>dna<213>人工合成序列()<400>27gcctggggtcgtaccgttgcagagattgccga32<210>28<211>32<212>dna<213>人工合成序列()<400>28tcggcaatctctgcaacggtacgaccccaggc32<210>29<211>29<212>dna<213>人工合成序列()<400>29agaccctgttcggcaaggtggaaagctgg29<210>30<211>29<212>dna<213>人工合成序列()<400>30ccagctttccaccttgccgaacagggtct29<210>31<211>34<212>dna<213>人工合成序列()<400>31ccaggtggaaagctgggcctttggcgcaaacagc34<210>32<211>34<212>dna<213>人工合成序列()<400>32gctgtttgcgccaaaggcccagctttccacctgg34<210>33<211>33<212>dna<213>人工合成序列()<400>33gctggatctttggcgcaaacatcccgggtaaga33<210>34<211>33<212>dna<213>人工合成序列()<400>34tcttacccgggatgtttgcgccaaagatccagc33<210>35<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>35gccggttttggcggcttgtatatgctgcaca31<210>36<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>36tgtgcagcatatacaagccgccaaaaccggc31<210>37<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>37acagcttcgatgaggacatgctgcaggagtg31<210>38<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>38cactcctgcagcatgtcctcatcgaagctgt31<210>39<211>29<212>dna<213>人工合成序列()<400>39gcttcgatgaggccttgctgcaggagtgg29<210>40<211>29<212>dna<213>人工合成序列()<400>40ccactcctgcagcaaggcctcatcgaagc29<210>41<211>35<212>dna<213>人工合成序列()<400>41ccagccggaaatcctggaatatctggaatacgtgg35<210>42<211>35<212>dna<213>人工合成序列()<400>42ccacgtattccagatattccaggatttccggctgg35<210>43<211>37<212>dna<213>人工合成序列()<400>43tacgccctgacattcagttcaacaccaccgttaccag37<210>44<211>37<212>dna<213>人工合成序列()<400>44ctggtaacggtggtgttgaactgaatgtcagggcgta37<210>45<211>40<212>dna<213>人工合成序列()<400>45gaacaccaccgttaccagcgcgcattttaacgaggtgcac40<210>46<211>40<212>dna<213>人工合成序列()<400>46gtgcacctcgttaaaatgcgcgctggtaacggtggtgttc40<210>47<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>47gatcgtggcggctactatagagcacgcttca31<210>48<211>31<212>dna<213>人工合成序列()<400>48tgaagcgtgctctatagtagccgccacgatc31<210>49<211>37<212>dna<213>人工合成序列()<400>49cgggatgttcgggaagttgatggcacttaacagaccc37<210>50<211>37<212>dna<213>人工合成序列()<400>50gggtctgttaagtgccatcaacttcccgaacatcccg37<210>51<211>35<212>dna<213>人工合成序列()<400>51tgagtcttttcaaggcgaattgtatcataccgccg35<210>52<211>35<212>dna<213>人工合成序列()<400>52cggcggtatgatacaattcgccttgaaaagactca35<210>53<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>53gcaccgtgccggcattgagcgttagcg27<210>54<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>54cgctaacgctcaatgccggcacggtgc27<210>55<211>40<212>dna<213>人工合成序列()<400>55atcagggcaacggcttttactatatatttggcaccttttg40<210>56<211>40<212>dna<213>人工合成序列()<400>56caaaaggtgccaaatatatagtaaaagccgttgccctgat40<210>57<211>34<212>dna<213>人工合成序列()<400>57gcccgtcgtccgctgttagatagcggctactatc34<210>58<211>34<212>dna<213>人工合成序列()<400>58gatagtagccgctatctaacagcggacgacgggc34<210>59<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>59accccgatcagtgaaatgaccccgcgc27<210>60<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>60gcgcggggtcatttcactgatcggggt27<210>61<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>61accccgatcagtgcaataaccccgcgc27<210>62<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>62gcgcggggttattgcactgatcggggt27<210>63<211>35<212>dna<213>人工合成序列()<400>63ccgccaattttccgaacttgttcatgattctgggc35<210>64<211>35<212>dna<213>人工合成序列()<400>64gcccagaatcatgaacaagttcggaaaattggcgg35<210>65<211>41<212>dna<213>人工合成序列()<400>65caattttccgaacatgttcttcattctgggccctaacggcc41<210>66<211>41<212>dna<213>人工合成序列()<400>66ggccgttagggcccagaatgaagaacatgttcggaaaattg41<210>67<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>67gggccctaacggcgcgttcaccaatct27<210>68<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>68agattggtgaacgcgccgttagggccc27<210>69<211>28<212>dna<213>人工合成序列()<400>69gccctaacggcccgttaaccaatctgcc28<210>70<211>28<212>dna<213>人工合成序列()<400>70ggcagattggttaacgggccgttagggc28<210>71<211>30<212>dna<213>人工合成序列()<400>71gccctaacggcccggccaccaatctgccgc30<210>72<211>30<212>dna<213>人工合成序列()<400>72gcggcagattggtggccgggccgttagggc30<210>73<211>25<212>dna<213>人工合成序列()<400>73acggcccgttcagcaatctgccgcc25<210>74<211>25<212>dna<213>人工合成序列()<400>74ggcggcagattgctgaacgggccgt25<210>75<211>37<212>dna<213>人工合成序列()<400>75gccctaacggcccgttctataatctgccgccgagtat37<210>76<211>37<212>dna<213>人工合成序列()<400>76atactcggcggcagattatagaacgggccgttagggc37<210>77<211>28<212>dna<213>人工合成序列()<400>77acggcccgttcaccaatgggccgccgag28<210>78<211>28<212>dna<213>人工合成序列()<400>78ctcggcggcccattggtgaacgggccgt28<210>79<211>28<212>dna<213>人工合成序列()<400>79acggcccgttcaccaatgcgccgccgag28<210>80<211>28<212>dna<213>人工合成序列()<400>80ctcggcggcgcattggtgaacgggccgt28<210>81<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>81tctggtggcacacttgcgtcagcacgg27<210>82<211>27<212>dna<213>人工合成序列()<400>82ccgtgctgacgcaagtgtgccaccaga27<210>83<211>33<212>dna<213>人工合成序列()<400>83ccaggtggaaagctggttctttggcgcaaacag33<210>84<211>33<212>dna<213>人工合成序列()<400>84ctgtttgcgccaaagaaccagctttccacctgg33<210>85<211>33<212>dna<213>人工合成序列()<400>85ccaggtggaaagctgggtctttggcgcaaacag33<210>86<211>33<212>dna<213>人工合成序列()<400>86ctgtttgcgccaaagacccagctttccacctgg33<210>87<211>35<212>dna<213>人工合成序列()<400>87gtaagaagcataccctgttgttttatctggccggc35<210>88<211>35<212>dna<213>人工合成序列()<400>88gccggccagataaaacaacagggtatgcttcttac35当前第1页12